人教生物学选择性必修3单元检测卷 (3) 基因工程 生物技术的安全性与伦理问题（含答案））
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| 名称 | 人教生物学选择性必修3单元检测卷 (3) 基因工程 生物技术的安全性与伦理问题（含答案）） |  | |
| 格式 | doc | ||
| 文件大小 | 433.5KB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-03-03 23:14:17 | ||
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文档简介
人教生物学选择性必修3单元检测卷
(三) 基因工程 生物技术的安全性与伦理问题
(本试卷满分：100分)
一、选择题(本题共16小题，共40分。第1～12小题，每小题2分；第13～16小题，每小题4分。每小题给出的四个选项中，只有一个选项是最符合题目要求的。)
1．下列有关基因工程的说法，正确的是( )
A．基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体
B．目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等
C．基因工程运用基因突变的原理来培育新品种
D．成功地将目的基因导入受体细胞便完成了基因工程的工作
2．有关基因工程中工具的说法，正确的是( )
A．限制酶只能识别6个核苷酸组成的序列
B．限制酶与DNA聚合酶的作用部位一样
C．病毒不能作为基因工程的载体
D．DNA连接酶能把黏性末端的氢键连接起来
3．如图是DNA分子结构的示意图，其中，基因工程中使用的限制酶的作用位点是( )
A．① B．② C．③ D．④
4．某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶结构和功能很相似，只是热稳定性较差，进入人体后容易失效。现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗食物的消化不良，最佳方案是( )
A．减少此酶在片剂中的含量
B．将此酶与人蛋白酶拼接，形成新的蛋白酶
C．重新设计与创造一种全新的蛋白酶
D．替换此酶中的少数氨基酸，改善其功能
5．科学家利用基因工程培育出了耐盐的转基因水稻新品系。下列有关叙述错误的( )
A．获得目的基因需用限制性内切核酸酶和DNA连接酶
B．可通过农杆菌的感染以实现重组质粒导入受体细胞
C．含耐盐基因的水稻细胞经植物组织培养可获得耐盐植株
D．可用较高浓度的盐水浇灌以鉴定水稻植株的耐盐性
6．下列关于基因工程的应用的叙述，错误的是( )
A．利用基因工程的方法，可获得高产、稳产和具有优良品质的农作物
B．抗虫基因作物的使用，不仅减少了农药的用量，大大降低了生产成本，而且还减少了农药对环境的污染
C．用基因工程的方法能够高效率地生产出各种高质量、低成本的药品
D．基因工程可用于环境保护
7．科学家利用生物技术将人的生长激素基因导入小鼠受精卵中，培育出一种转基因小鼠，使其膀胱上皮细胞合成人的生长激素并分泌到尿液中。下列叙述错误的是( )
A．该技术克服了不同生物远缘杂交的障碍，实现了物种间的基因交流
B．采用DNA分子杂交技术，可检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达
C．人的生长激素基因能在小鼠细胞中表达，说明遗传密码在不同生物中可以通用
D．将转基因小鼠体细胞进行核移植(克隆)，可以获得多个具有外源基因的后代
8．基因工程与蛋白质工程的区别是( )
A．基因工程需要进行转录和翻译，蛋白质工程不需要
B．基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程合成的可以是天然不存在的蛋白质
C．基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平(或性状水平)操作
D．基因工程完全不同于蛋白质工程
9．下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．实验室可用鸡血细胞作为提取DNA的材料
B．在2 mol/L NaCl溶液中，DNA溶解度较大
C．向溶解DNA的NaCl溶液中缓慢加入蒸馏水，是为了充分稀释DNA
D．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定效果
10．如图所示的黏性末端是由几种限制酶作用产生的( )
A．1种 B．2种
C．3种 D．4种
11．下列关于现代生物工程技术应用安全性评价的叙述，正确的是( )
A．由于存在生殖隔离，大量种植转基因抗除草剂农作物不存在安全性问题
B．转基因的受体细胞通常限制在遗传上有特定缺陷的生物上
C．中国政府不反对治疗性克隆，可以有限制地进行生殖性克隆研究
D．在任何情况下都不发展、不生产生物武器，但可储存少量的生物武器用于研究
12．下列有关基因工程的叙述，错误的是( )
A．用同种限制性内切核酸酶切割载体与含目的基因的DNA片段，可获得相同的黏性末端
B．质粒上的抗生素抗性基因有利于鉴别和筛选含目的基因的受体细胞
C．将重组Ti质粒转入农杆菌之前，常用Ca2＋处理农杆菌使其成为感受态细胞
D．用PCR检测目的基因已插入染色体DNA上，则说明转基因植物生产成功
13．如图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图(其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因)。下列叙述正确的是( )
A．可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA进行切割
B．过程②中，可直接将过程①得到的产物注入受体细胞
C．过程③需要用到纤维素酶和果胶酶，以便获得并培养活的原生质体
D．过程④中，若利用探针在试管苗细胞内检测到目的基因，则转基因成功
14．限制酶BamHⅠ和BglⅡ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为
研究中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅡ切割质粒，并连接得到重组质粒，下列相关叙述正确的是( )
A．酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素
B．目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是—CTAG
C．分别用两种限制酶切割，保证了目的基因定向插入质粒
D．经两种酶处理得到的重组质粒能再被这两种酶所识别
15．如图是利用奶牛乳腺生产人血清白蛋白的图解，下列相关说法错误的是( )
A．常用胰蛋白酶将奶牛组织分散成单个细胞
B．常用显微注射技术将目的基因导入受体细胞
C．M应该包括早期胚胎培养、胚胎移植等过程
D．在重组细胞中检测到人血清白蛋白基因，说明目的基因在受体细胞中完成了表达
16．如图为某种cDNA基因的制作流程图，下列相关叙述正确的是( )
A．催化①②过程的酶都能促进双链间氢键的形成
B．核酸酶H能催化杂交双链上的磷酸二酯键断裂
C．该双链DNA上不含与RNA聚合酶结合的碱基序列
D．该双链DNA在PCR仪中扩增时需提供DNA连接酶
二、非选择题(本题包括5小题，共60分。)
17．(12分)Bt基因是从苏云金杆菌中分离出来的抗虫蛋白基因，因其表达产物Bt抗虫蛋白具有杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的基因。请回答下列问题：
(1)要从苏云金杆菌中获取Bt基因，可根据Bt基因的部分已知序列，设计特异性________，再利用________技术扩增出Bt基因。
(2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有________，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)的____________上。这种将基因表达载体导入受体细胞的方法是________法。利用________法将基因表达载体导入植物细胞是我国科学家独创的方法。
(3)要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做________实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应抗虫蛋白，在分子水平上可利用________________方法进行检测。
(4)Ⅳ中产生的细胞团称为________，Ⅳ和Ⅴ过程要注意控制培养基中____________________的比例，以便获得幼苗。
18．(10分)某植物抗虫基因转录的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知。现利用PCR扩增该基因，简要流程如图所示，其中①～③表示有关过程，Ⅰ～Ⅲ表示有关物质。请回答下列问题：
(1)过程①反应体系中需要加入________酶，生成杂合双链物质Ⅰ。
(2)利用DNA末端转移酶催化过程②，使cDNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列AAA(A)n，进而利于过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ。在过程③反应体系中还需要添加新的引物，新引物的碱基序列应该是________。
(3)得到物质Ⅲ后，通常还需在其两端增加__________序列，以便切割后与相应的载体重组。将基因表达载体导入大肠杆菌之前，还需用______________处理大肠杆菌。
19．(12分)请回答有关下图的问题：
(1)图甲中①～⑤所示的生物工程为______________。该工程是指以_______________
____________________________________________________________________作为基础，通过改造或合成______________，来改造现有__________，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
(2)图甲中④所示过程叫________，该过程遵循的碱基互补配对原则不同于翻译过程的是________(请将模板碱基写在前)。
(3)若预期蛋白质欲通过乳腺生物反应器生产，则构建基因表达载体时，图乙中序号[1]代表的是___________________________________________
_____________________________________________________________；
在图甲中⑨过程之前，要对精子进行筛选，保留含性染色体________的精子。
20．(13分)丙肝病毒(HCV)是一种RNA病毒，对HCV感染的诊断步骤是首先进行抗HCV抗体检测，若检测结果呈阳性，则还需要进行HCV核酸检测。HCV 融合抗原可用于制作第三代HCV抗体检测试剂。回答下列问题：
(1)将得到的HCV的多个抗原基因首尾相连，在同一启动子、终止子等的调控之下，构成融合基因，进而构建融合抗原重组质粒。构建融合抗原重组质粒的过程中，需要用到__________________________酶。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动____________________________________。
(2)用重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，用含硫酸卡那霉素的培养基筛选出能生长的菌落，从而得到能产生HCV融合抗原的工程菌。用____________处理大肠杆菌可得到感受态细胞，受体大肠杆菌细胞____________(填“含有”或“不含有”)硫酸卡那霉素抗性基因。
(3)进行HCV核酸检测时，需要用到一对HCV特异性引物和一种HCV特异性荧光探针，需要的酶有__________________和耐高温的DNA聚合酶，需要的原料是______________；检测过程是先将RNA合成cDNA，再通过PCR法扩增DNA，实时监测扩增全过程，从而检测出HCV-RNA。
(4)某人体内HCV抗体检测结果呈阳性，但进行HCV核酸检测时结果呈阴性，原因是____________________________________。
21．(13分)如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图中所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是AOX1基因的启动子和终止子]。请分析回答下列问题：
(1)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择____________切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______________________，这样设计的优点是
________________________________________________________________________。
(2)酶切获取HBsAg基因后，需用____________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取____________。
(3)步骤3中应选用限制酶____________来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入________以便筛选；若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用________技术进行检测。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入____________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
人教生物学选择性必修3单元检测卷（参考答案）
(三) 基因工程 生物技术的安全性与伦理问题
1解析：选B 载体不属于工具酶，A错误；目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，载体需要含有限制酶切点、标记基因等，B正确；基因工程的原理是基因重组，C错误；将目的基因导入受体细胞，还需要对目的基因进行检测和鉴定，D错误。
2解析：选B 大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，A错误；限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，B正确；在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等，C错误；DNA连接酶可使DNA片段的黏性末端通过磷酸二酯键连接起来，D错误。
3解析：选B 限制酶的作用位点是磷酸二酯键，即图中的②。
4解析：选D 减少此酶的含量会降低疗效，且剩余的酶仍然容易失效，A错误；蛋白质之间不能进行简单的拼接，B错误；只需将此酶进行改造后满足需求即可，不需重新设计与创造一种全新的蛋白酶，C错误；要提高该酶的热稳定性，可以采用蛋白质工程技术替换此酶中的少数氨基酸，以改善其功能，D正确。
5解析：选A 获取目的基因只需要用到限制性内切核酸酶，不需要DNA连接酶，A错误；将目的基因导入到植物细胞可以通过农杆菌转化法，B正确；含耐盐基因的水稻利用植物细胞的全能性经过植物组织培养可以得到耐盐植株，C正确；耐盐植株的鉴定可以用高浓度的盐水灌溉来鉴定，这属于个体水平的鉴定，D正确。
6解析：选C 基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良的农作物，A正确；抗虫基因作物的使用，不仅减少了农药的用量，大大降低了生产成本，而且还减少了农药对环境的污染，B正确；基因工程的原理是基因重组，基因工程只是让生物生产它原来不能产生的物质，药品不一定都能通过基因工程生产，C错误；在环境保护方面主要用于环境监测和对污染环境的净化，D正确。
7解析：选B 该技术克服了不同生物远缘杂交的障碍，实现了物种间的基因交流，A正确；采用抗原抗体杂交技术，可检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达，B错误；一种生物的基因能在另一种生物体内表达，说明遗传密码在不同生物中可以通用，C正确；因为动物细胞的细胞核具有全能性，且转基因小鼠的细胞核中含有目的基因，所以将转基因小鼠体细胞进行核移植并克隆，可以获得多个具有外源基因的后代，D正确。
8解析：选B 基因工程和蛋白质工程均需要进行转录和翻译，A错误。基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程可以合成非天然存在的蛋白质，B正确。基因工程和蛋白质工程都是分子水平操作，C错误。基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内，产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状，但只能生产自然界已存在的蛋白质；蛋白质工程是通过修改基因或改造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，蛋白质工程不完全同于基因工程，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，D错误。
9解析：选C 该实验中材料选择的原则是DNA含量相对较高的生物组织，材料易得，操作简便，因此鸡血细胞是较理想的实验材料，A正确；在2 mol/L NaCl溶液中，DNA溶解度较大，B正确；向溶解DNA的NaCl溶液中缓慢加入蒸馏水，是使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出，C错误；二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定效果，D正确。
10解析：选C 限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成两个相同的黏性末端。图中四个黏性末端中第一个和第二个相同，由同一种限制酶切割产生，所以图中共有3种不同的黏性末端，由3种限制酶切割形成。
11解析：选B 转基因农作物的抗除草剂基因可能通过花粉传播到杂草中，存在安全性问题；转基因的受体细胞通常限制在遗传上有特定缺陷的生物上，该生物只能在特定条件下生存；中国政府的态度是禁止生殖性克隆人，坚持四不原则(不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验)，不反对治疗性克隆；中国在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
12解析：选D 基因工程中，构建基因表达载体时，要用同种限制性内切核酸酶切割载体与含目的基因的DNA片段，以获得相同的黏性末端，A正确。质粒上的抗生素抗性基因有利于重组后重组子的筛选，即鉴别和筛选含目的基因的受体细胞，B正确。将重组Ti质粒转入农杆菌之前，常用Ca2＋处理农杆菌使其成为感受态细胞，便于完成转化过程，C正确。用PCR检测目的基因已插入染色体DNA上，则说明目的基因导入成功；植物表现出某种特性，则说明转基因植物生产成功，D错误。
13解析：选A 根据外源DNA中目的基因的位置以及三种限制酶的切割位点可知，可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA进行切割，A正确；将目的基因导入植物细胞时可采用农杆菌转化法、花粉管通道法，不能直接将基因表达载体注入受体细胞，B错误；③表示植物组织培养过程，该过程不需要使用纤维素酶和果胶酶，C错误；过程④中，若利用探针在试管苗细胞内检测到目的基因，说明目的基因已经成功导入受体细胞，但不能说明目的基因会成功表达，因此不能表明转基因成功，D错误。
14解析：选A 影响酶促反应的因素有温度、pH、酶浓度、底物浓度等，因此酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素，A正确；根据题意可知，限制酶BamHⅠ的识别序列及切割位点为因此目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是，B错误；分别用两种限制酶切割，由于形成的黏性末端相同，因此并不能保证目的基因定向插入质粒，C错误；经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别，D错误。
15解析：选D 常用胰蛋白酶将奶牛组织分散成单个细胞，A正确；常用显微注射技术将人血清白蛋白基因(目的基因)导入受体细胞，B正确；M为将重组细胞形成胚胎后移植的过程，应该包括早期胚胎培养、胚胎移植等过程，C正确；重组细胞中检测到人血清白蛋白基因，说明目的基因已导入受体细胞中，但不一定完成了表达，D错误。
16解析：选C 催化①②过程的酶是逆转录酶和DNA聚合酶，作用的都是磷酸二酯键，A错误；据图可知，核酸酶H能催化杂交双链转变成单链DNA，作用的是氢键，B错误；RNA聚合酶结合在DNA的非编码序列中，cDNA的制作过程是以RNA为模板形成，不含非编码序列，C正确；该双链DNA在PCR仪中扩增时不需提供DNA连接酶，D错误。
17解析：(1)要从苏云金杆菌中获取Bt基因，可利用PCR扩增目的基因，该技术需要引物，可根据Bt基因的部分已知序列，设计特异性引物(对)。(2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有T-DNA(可移动的DNA)，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)的染色体DNA上。这种将基因表达载体导入受体细胞的方法是农杆菌转化法。花粉管通道法是我国科学家独创的将基因表达载体导入植物细胞的方法。(3)要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做抗虫接种实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应抗虫蛋白，在分子水平上可利用抗原抗体杂交方法进行检测。(4)Ⅳ中产生的细胞团称为愈伤组织，Ⅳ和Ⅴ过程要注意控制培养基中生长素与细胞分裂素的比例，以便获得幼苗。
答案：(1)引物 PCR (2)T-DNA 染色体DNA 农杆菌转化 花粉管通道 (3)抗虫接种 抗原抗体杂交 (4)愈伤组织 生长素和细胞分裂素
18解析：(1)过程①表示逆转录过程，即以mRNA为模板合成cDNA单链的过程，该过程需要逆转录酶的催化。(2)过程②在cDNA末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列AAA(A)n，其目的是便于设计引物，过程③表示在DNA聚合酶的作用下生成互补链，因此根据碱基互补配对原则可以确定，过程③反应体系需要添加的新引物序列是TTT(T)n。(3)获取目的基因需要用限制酶切割获得，因此在物质Ⅲ的两端通常还需增加限制酶识别序列，以便与相应的载体重组，再利用Ca2＋处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，以利于将重组质粒导入细胞。
答案：(1)逆转录 (2)TTT(T)n (3)限制酶识别 Ca2＋(或CaCl2溶液)
19解析：(1)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。图甲中①～⑤所示的生物工程为蛋白质工程。(2)图甲中④表示逆转录过程，该过程遵循的碱基互补配对原则为U—A、A—T、C—G、G—C，而翻译过程中遵循的碱基互补配对原则为U—A、A—U、C—G、G—C，转录过程不同于翻译过程的是A—T。(3)制备乳腺生物反应器过程中，在构建基因表达载体时，需在目的基因前加上乳腺蛋白基因的启动子，图乙中序号[1]代表的是启动子；因为只有雌性个体能分泌乳汁，所以在图甲⑨过程之前，要对精子进行筛选，保留含性染色体X的精子。
答案：(1)蛋白质工程 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 基因 蛋白质 (2)逆转录 A—T (3)乳腺蛋白基因的启动子 X
20解析：(1)构建融合抗原重组质粒的过程中，首先需要用同种限制酶切割质粒和融合基因，其次用DNA连接酶将融合基因与质粒连接形成重组质粒。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动融合基因转录出mRNA。(2)将目的基因导入微生物细胞时，需要用Ca2＋(或CaCl2) 处理微生物细胞以获得感受态细胞；用重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，用含硫酸卡那霉素的培养基筛选出能生长的菌落，从而得到能产生HCV融合抗原的工程菌，这说明硫酸卡那霉素抗性基因是标记基因，受体大肠杆菌细胞不能含有该抗性基因，否则无法利用该抗性基因进行重组质粒的筛选。(3)根据“检测过程是先将RNA合成cDNA，再通过PCR法扩增DNA”可知，将RNA合成cDNA的逆转录过程需要用到逆转录酶，利用PCR法扩增DNA的过程需要用到耐高温的DNA聚合酶，这两个过程所需的原料都是脱氧核苷酸。(4)某人体内HCV抗体检测结果呈阳性，但进行HCV核酸检测时结果呈阴性，原因是其感染HCV后通过免疫反应已将HCV清除，但体内存在抗HCV的抗体。
答案：(1)限制酶和DNA连接 融合基因转录出mRNA (2)Ca2＋(或CaCl2) 不含有 (3)逆转录酶 四种脱氧核苷酸 (4)其感染HCV后通过免疫反应已将HCV清除，但体内存在抗HCV的抗体
21解析：(1)图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和SacⅠ限制酶切割位点，其中SacⅠ位于启动子上，Bgl Ⅱ位于终止子上。如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶识别序列。这两种酶切割产生的黏性末端不同，这样可以避免质粒和目的基因自身环化，还可以防止目的基因和质粒反向连接。(2)获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒。(3)步骤3是要获取含有5′AOX1……3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。(4)5′AOX1……3′AOX1段基因含有卡拉霉素抗性基因，因此在培养基中加入卡拉霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌。检测目的基因是否转录可用PCR。(5)巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源，同时甲醇能诱导AOX1基因表达。所以转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
答案：(1)SnaBⅠ、AvrⅡ 相应的限制酶识别序列 确保定向连接(避免质粒和目的基因自身环化及目的基因和质粒反向连接) (2)DNA连接酶 大量重组质粒 (3)BglⅡ (4)卡拉霉素 PCR (5)甲醇
(三) 基因工程 生物技术的安全性与伦理问题
(本试卷满分：100分)
一、选择题(本题共16小题，共40分。第1～12小题，每小题2分；第13～16小题，每小题4分。每小题给出的四个选项中，只有一个选项是最符合题目要求的。)
1．下列有关基因工程的说法，正确的是( )
A．基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体
B．目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等
C．基因工程运用基因突变的原理来培育新品种
D．成功地将目的基因导入受体细胞便完成了基因工程的工作
2．有关基因工程中工具的说法，正确的是( )
A．限制酶只能识别6个核苷酸组成的序列
B．限制酶与DNA聚合酶的作用部位一样
C．病毒不能作为基因工程的载体
D．DNA连接酶能把黏性末端的氢键连接起来
3．如图是DNA分子结构的示意图，其中，基因工程中使用的限制酶的作用位点是( )
A．① B．② C．③ D．④
4．某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶结构和功能很相似，只是热稳定性较差，进入人体后容易失效。现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗食物的消化不良，最佳方案是( )
A．减少此酶在片剂中的含量
B．将此酶与人蛋白酶拼接，形成新的蛋白酶
C．重新设计与创造一种全新的蛋白酶
D．替换此酶中的少数氨基酸，改善其功能
5．科学家利用基因工程培育出了耐盐的转基因水稻新品系。下列有关叙述错误的( )
A．获得目的基因需用限制性内切核酸酶和DNA连接酶
B．可通过农杆菌的感染以实现重组质粒导入受体细胞
C．含耐盐基因的水稻细胞经植物组织培养可获得耐盐植株
D．可用较高浓度的盐水浇灌以鉴定水稻植株的耐盐性
6．下列关于基因工程的应用的叙述，错误的是( )
A．利用基因工程的方法，可获得高产、稳产和具有优良品质的农作物
B．抗虫基因作物的使用，不仅减少了农药的用量，大大降低了生产成本，而且还减少了农药对环境的污染
C．用基因工程的方法能够高效率地生产出各种高质量、低成本的药品
D．基因工程可用于环境保护
7．科学家利用生物技术将人的生长激素基因导入小鼠受精卵中，培育出一种转基因小鼠，使其膀胱上皮细胞合成人的生长激素并分泌到尿液中。下列叙述错误的是( )
A．该技术克服了不同生物远缘杂交的障碍，实现了物种间的基因交流
B．采用DNA分子杂交技术，可检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达
C．人的生长激素基因能在小鼠细胞中表达，说明遗传密码在不同生物中可以通用
D．将转基因小鼠体细胞进行核移植(克隆)，可以获得多个具有外源基因的后代
8．基因工程与蛋白质工程的区别是( )
A．基因工程需要进行转录和翻译，蛋白质工程不需要
B．基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程合成的可以是天然不存在的蛋白质
C．基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平(或性状水平)操作
D．基因工程完全不同于蛋白质工程
9．下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．实验室可用鸡血细胞作为提取DNA的材料
B．在2 mol/L NaCl溶液中，DNA溶解度较大
C．向溶解DNA的NaCl溶液中缓慢加入蒸馏水，是为了充分稀释DNA
D．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定效果
10．如图所示的黏性末端是由几种限制酶作用产生的( )
A．1种 B．2种
C．3种 D．4种
11．下列关于现代生物工程技术应用安全性评价的叙述，正确的是( )
A．由于存在生殖隔离，大量种植转基因抗除草剂农作物不存在安全性问题
B．转基因的受体细胞通常限制在遗传上有特定缺陷的生物上
C．中国政府不反对治疗性克隆，可以有限制地进行生殖性克隆研究
D．在任何情况下都不发展、不生产生物武器，但可储存少量的生物武器用于研究
12．下列有关基因工程的叙述，错误的是( )
A．用同种限制性内切核酸酶切割载体与含目的基因的DNA片段，可获得相同的黏性末端
B．质粒上的抗生素抗性基因有利于鉴别和筛选含目的基因的受体细胞
C．将重组Ti质粒转入农杆菌之前，常用Ca2＋处理农杆菌使其成为感受态细胞
D．用PCR检测目的基因已插入染色体DNA上，则说明转基因植物生产成功
13．如图为转基因抗冻番茄培育过程的示意图(其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因)。下列叙述正确的是( )
A．可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA进行切割
B．过程②中，可直接将过程①得到的产物注入受体细胞
C．过程③需要用到纤维素酶和果胶酶，以便获得并培养活的原生质体
D．过程④中，若利用探针在试管苗细胞内检测到目的基因，则转基因成功
14．限制酶BamHⅠ和BglⅡ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为
研究中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅡ切割质粒，并连接得到重组质粒，下列相关叙述正确的是( )
A．酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素
B．目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是—CTAG
C．分别用两种限制酶切割，保证了目的基因定向插入质粒
D．经两种酶处理得到的重组质粒能再被这两种酶所识别
15．如图是利用奶牛乳腺生产人血清白蛋白的图解，下列相关说法错误的是( )
A．常用胰蛋白酶将奶牛组织分散成单个细胞
B．常用显微注射技术将目的基因导入受体细胞
C．M应该包括早期胚胎培养、胚胎移植等过程
D．在重组细胞中检测到人血清白蛋白基因，说明目的基因在受体细胞中完成了表达
16．如图为某种cDNA基因的制作流程图，下列相关叙述正确的是( )
A．催化①②过程的酶都能促进双链间氢键的形成
B．核酸酶H能催化杂交双链上的磷酸二酯键断裂
C．该双链DNA上不含与RNA聚合酶结合的碱基序列
D．该双链DNA在PCR仪中扩增时需提供DNA连接酶
二、非选择题(本题包括5小题，共60分。)
17．(12分)Bt基因是从苏云金杆菌中分离出来的抗虫蛋白基因，因其表达产物Bt抗虫蛋白具有杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的基因。请回答下列问题：
(1)要从苏云金杆菌中获取Bt基因，可根据Bt基因的部分已知序列，设计特异性________，再利用________技术扩增出Bt基因。
(2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有________，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)的____________上。这种将基因表达载体导入受体细胞的方法是________法。利用________法将基因表达载体导入植物细胞是我国科学家独创的方法。
(3)要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做________实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应抗虫蛋白，在分子水平上可利用________________方法进行检测。
(4)Ⅳ中产生的细胞团称为________，Ⅳ和Ⅴ过程要注意控制培养基中____________________的比例，以便获得幼苗。
18．(10分)某植物抗虫基因转录的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知。现利用PCR扩增该基因，简要流程如图所示，其中①～③表示有关过程，Ⅰ～Ⅲ表示有关物质。请回答下列问题：
(1)过程①反应体系中需要加入________酶，生成杂合双链物质Ⅰ。
(2)利用DNA末端转移酶催化过程②，使cDNA单链左侧末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列AAA(A)n，进而利于过程③扩增获得目的基因序列Ⅲ。在过程③反应体系中还需要添加新的引物，新引物的碱基序列应该是________。
(3)得到物质Ⅲ后，通常还需在其两端增加__________序列，以便切割后与相应的载体重组。将基因表达载体导入大肠杆菌之前，还需用______________处理大肠杆菌。
19．(12分)请回答有关下图的问题：
(1)图甲中①～⑤所示的生物工程为______________。该工程是指以_______________
____________________________________________________________________作为基础，通过改造或合成______________，来改造现有__________，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
(2)图甲中④所示过程叫________，该过程遵循的碱基互补配对原则不同于翻译过程的是________(请将模板碱基写在前)。
(3)若预期蛋白质欲通过乳腺生物反应器生产，则构建基因表达载体时，图乙中序号[1]代表的是___________________________________________
_____________________________________________________________；
在图甲中⑨过程之前，要对精子进行筛选，保留含性染色体________的精子。
20．(13分)丙肝病毒(HCV)是一种RNA病毒，对HCV感染的诊断步骤是首先进行抗HCV抗体检测，若检测结果呈阳性，则还需要进行HCV核酸检测。HCV 融合抗原可用于制作第三代HCV抗体检测试剂。回答下列问题：
(1)将得到的HCV的多个抗原基因首尾相连，在同一启动子、终止子等的调控之下，构成融合基因，进而构建融合抗原重组质粒。构建融合抗原重组质粒的过程中，需要用到__________________________酶。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动____________________________________。
(2)用重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，用含硫酸卡那霉素的培养基筛选出能生长的菌落，从而得到能产生HCV融合抗原的工程菌。用____________处理大肠杆菌可得到感受态细胞，受体大肠杆菌细胞____________(填“含有”或“不含有”)硫酸卡那霉素抗性基因。
(3)进行HCV核酸检测时，需要用到一对HCV特异性引物和一种HCV特异性荧光探针，需要的酶有__________________和耐高温的DNA聚合酶，需要的原料是______________；检测过程是先将RNA合成cDNA，再通过PCR法扩增DNA，实时监测扩增全过程，从而检测出HCV-RNA。
(4)某人体内HCV抗体检测结果呈阳性，但进行HCV核酸检测时结果呈阴性，原因是____________________________________。
21．(13分)如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图中所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是AOX1基因的启动子和终止子]。请分析回答下列问题：
(1)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择____________切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上_______________________，这样设计的优点是
________________________________________________________________________。
(2)酶切获取HBsAg基因后，需用____________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取____________。
(3)步骤3中应选用限制酶____________来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入________以便筛选；若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用________技术进行检测。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入____________以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
人教生物学选择性必修3单元检测卷（参考答案）
(三) 基因工程 生物技术的安全性与伦理问题
1解析：选B 载体不属于工具酶，A错误；目前常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，载体需要含有限制酶切点、标记基因等，B正确；基因工程的原理是基因重组，C错误；将目的基因导入受体细胞，还需要对目的基因进行检测和鉴定，D错误。
2解析：选B 大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成，少数限制酶识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成，A错误；限制酶、DNA连接酶和DNA聚合酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，B正确；在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等，C错误；DNA连接酶可使DNA片段的黏性末端通过磷酸二酯键连接起来，D错误。
3解析：选B 限制酶的作用位点是磷酸二酯键，即图中的②。
4解析：选D 减少此酶的含量会降低疗效，且剩余的酶仍然容易失效，A错误；蛋白质之间不能进行简单的拼接，B错误；只需将此酶进行改造后满足需求即可，不需重新设计与创造一种全新的蛋白酶，C错误；要提高该酶的热稳定性，可以采用蛋白质工程技术替换此酶中的少数氨基酸，以改善其功能，D正确。
5解析：选A 获取目的基因只需要用到限制性内切核酸酶，不需要DNA连接酶，A错误；将目的基因导入到植物细胞可以通过农杆菌转化法，B正确；含耐盐基因的水稻利用植物细胞的全能性经过植物组织培养可以得到耐盐植株，C正确；耐盐植株的鉴定可以用高浓度的盐水灌溉来鉴定，这属于个体水平的鉴定，D正确。
6解析：选C 基因工程在农业上的应用主要是培育高产、稳产、品质优良的农作物，A正确；抗虫基因作物的使用，不仅减少了农药的用量，大大降低了生产成本，而且还减少了农药对环境的污染，B正确；基因工程的原理是基因重组，基因工程只是让生物生产它原来不能产生的物质，药品不一定都能通过基因工程生产，C错误；在环境保护方面主要用于环境监测和对污染环境的净化，D正确。
7解析：选B 该技术克服了不同生物远缘杂交的障碍，实现了物种间的基因交流，A正确；采用抗原抗体杂交技术，可检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达，B错误；一种生物的基因能在另一种生物体内表达，说明遗传密码在不同生物中可以通用，C正确；因为动物细胞的细胞核具有全能性，且转基因小鼠的细胞核中含有目的基因，所以将转基因小鼠体细胞进行核移植并克隆，可以获得多个具有外源基因的后代，D正确。
8解析：选B 基因工程和蛋白质工程均需要进行转录和翻译，A错误。基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程可以合成非天然存在的蛋白质，B正确。基因工程和蛋白质工程都是分子水平操作，C错误。基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内，产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状，但只能生产自然界已存在的蛋白质；蛋白质工程是通过修改基因或改造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，蛋白质工程不完全同于基因工程，蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，D错误。
9解析：选C 该实验中材料选择的原则是DNA含量相对较高的生物组织，材料易得，操作简便，因此鸡血细胞是较理想的实验材料，A正确；在2 mol/L NaCl溶液中，DNA溶解度较大，B正确；向溶解DNA的NaCl溶液中缓慢加入蒸馏水，是使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出，C错误；二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定效果，D正确。
10解析：选C 限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成两个相同的黏性末端。图中四个黏性末端中第一个和第二个相同，由同一种限制酶切割产生，所以图中共有3种不同的黏性末端，由3种限制酶切割形成。
11解析：选B 转基因农作物的抗除草剂基因可能通过花粉传播到杂草中，存在安全性问题；转基因的受体细胞通常限制在遗传上有特定缺陷的生物上，该生物只能在特定条件下生存；中国政府的态度是禁止生殖性克隆人，坚持四不原则(不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验)，不反对治疗性克隆；中国在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
12解析：选D 基因工程中，构建基因表达载体时，要用同种限制性内切核酸酶切割载体与含目的基因的DNA片段，以获得相同的黏性末端，A正确。质粒上的抗生素抗性基因有利于重组后重组子的筛选，即鉴别和筛选含目的基因的受体细胞，B正确。将重组Ti质粒转入农杆菌之前，常用Ca2＋处理农杆菌使其成为感受态细胞，便于完成转化过程，C正确。用PCR检测目的基因已插入染色体DNA上，则说明目的基因导入成功；植物表现出某种特性，则说明转基因植物生产成功，D错误。
13解析：选A 根据外源DNA中目的基因的位置以及三种限制酶的切割位点可知，可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA进行切割，A正确；将目的基因导入植物细胞时可采用农杆菌转化法、花粉管通道法，不能直接将基因表达载体注入受体细胞，B错误；③表示植物组织培养过程，该过程不需要使用纤维素酶和果胶酶，C错误；过程④中，若利用探针在试管苗细胞内检测到目的基因，说明目的基因已经成功导入受体细胞，但不能说明目的基因会成功表达，因此不能表明转基因成功，D错误。
14解析：选A 影响酶促反应的因素有温度、pH、酶浓度、底物浓度等，因此酶切过程中，需控制好酶浓度、温度和反应时间等因素，A正确；根据题意可知，限制酶BamHⅠ的识别序列及切割位点为因此目的基因经BamHⅠ切割后形成的黏性末端是，B错误；分别用两种限制酶切割，由于形成的黏性末端相同，因此并不能保证目的基因定向插入质粒，C错误；经两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别，D错误。
15解析：选D 常用胰蛋白酶将奶牛组织分散成单个细胞，A正确；常用显微注射技术将人血清白蛋白基因(目的基因)导入受体细胞，B正确；M为将重组细胞形成胚胎后移植的过程，应该包括早期胚胎培养、胚胎移植等过程，C正确；重组细胞中检测到人血清白蛋白基因，说明目的基因已导入受体细胞中，但不一定完成了表达，D错误。
16解析：选C 催化①②过程的酶是逆转录酶和DNA聚合酶，作用的都是磷酸二酯键，A错误；据图可知，核酸酶H能催化杂交双链转变成单链DNA，作用的是氢键，B错误；RNA聚合酶结合在DNA的非编码序列中，cDNA的制作过程是以RNA为模板形成，不含非编码序列，C正确；该双链DNA在PCR仪中扩增时不需提供DNA连接酶，D错误。
17解析：(1)要从苏云金杆菌中获取Bt基因，可利用PCR扩增目的基因，该技术需要引物，可根据Bt基因的部分已知序列，设计特异性引物(对)。(2)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有T-DNA(可移动的DNA)，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)的染色体DNA上。这种将基因表达载体导入受体细胞的方法是农杆菌转化法。花粉管通道法是我国科学家独创的将基因表达载体导入植物细胞的方法。(3)要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做抗虫接种实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应抗虫蛋白，在分子水平上可利用抗原抗体杂交方法进行检测。(4)Ⅳ中产生的细胞团称为愈伤组织，Ⅳ和Ⅴ过程要注意控制培养基中生长素与细胞分裂素的比例，以便获得幼苗。
答案：(1)引物 PCR (2)T-DNA 染色体DNA 农杆菌转化 花粉管通道 (3)抗虫接种 抗原抗体杂交 (4)愈伤组织 生长素和细胞分裂素
18解析：(1)过程①表示逆转录过程，即以mRNA为模板合成cDNA单链的过程，该过程需要逆转录酶的催化。(2)过程②在cDNA末端增加十多个腺嘌呤脱氧核苷酸序列AAA(A)n，其目的是便于设计引物，过程③表示在DNA聚合酶的作用下生成互补链，因此根据碱基互补配对原则可以确定，过程③反应体系需要添加的新引物序列是TTT(T)n。(3)获取目的基因需要用限制酶切割获得，因此在物质Ⅲ的两端通常还需增加限制酶识别序列，以便与相应的载体重组，再利用Ca2＋处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，以利于将重组质粒导入细胞。
答案：(1)逆转录 (2)TTT(T)n (3)限制酶识别 Ca2＋(或CaCl2溶液)
19解析：(1)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。图甲中①～⑤所示的生物工程为蛋白质工程。(2)图甲中④表示逆转录过程，该过程遵循的碱基互补配对原则为U—A、A—T、C—G、G—C，而翻译过程中遵循的碱基互补配对原则为U—A、A—U、C—G、G—C，转录过程不同于翻译过程的是A—T。(3)制备乳腺生物反应器过程中，在构建基因表达载体时，需在目的基因前加上乳腺蛋白基因的启动子，图乙中序号[1]代表的是启动子；因为只有雌性个体能分泌乳汁，所以在图甲⑨过程之前，要对精子进行筛选，保留含性染色体X的精子。
答案：(1)蛋白质工程 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 基因 蛋白质 (2)逆转录 A—T (3)乳腺蛋白基因的启动子 X
20解析：(1)构建融合抗原重组质粒的过程中，首先需要用同种限制酶切割质粒和融合基因，其次用DNA连接酶将融合基因与质粒连接形成重组质粒。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动融合基因转录出mRNA。(2)将目的基因导入微生物细胞时，需要用Ca2＋(或CaCl2) 处理微生物细胞以获得感受态细胞；用重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，用含硫酸卡那霉素的培养基筛选出能生长的菌落，从而得到能产生HCV融合抗原的工程菌，这说明硫酸卡那霉素抗性基因是标记基因，受体大肠杆菌细胞不能含有该抗性基因，否则无法利用该抗性基因进行重组质粒的筛选。(3)根据“检测过程是先将RNA合成cDNA，再通过PCR法扩增DNA”可知，将RNA合成cDNA的逆转录过程需要用到逆转录酶，利用PCR法扩增DNA的过程需要用到耐高温的DNA聚合酶，这两个过程所需的原料都是脱氧核苷酸。(4)某人体内HCV抗体检测结果呈阳性，但进行HCV核酸检测时结果呈阴性，原因是其感染HCV后通过免疫反应已将HCV清除，但体内存在抗HCV的抗体。
答案：(1)限制酶和DNA连接 融合基因转录出mRNA (2)Ca2＋(或CaCl2) 不含有 (3)逆转录酶 四种脱氧核苷酸 (4)其感染HCV后通过免疫反应已将HCV清除，但体内存在抗HCV的抗体
21解析：(1)图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和SacⅠ限制酶切割位点，其中SacⅠ位于启动子上，Bgl Ⅱ位于终止子上。如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶识别序列。这两种酶切割产生的黏性末端不同，这样可以避免质粒和目的基因自身环化，还可以防止目的基因和质粒反向连接。(2)获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒。(3)步骤3是要获取含有5′AOX1……3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。(4)5′AOX1……3′AOX1段基因含有卡拉霉素抗性基因，因此在培养基中加入卡拉霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌。检测目的基因是否转录可用PCR。(5)巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源，同时甲醇能诱导AOX1基因表达。所以转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
答案：(1)SnaBⅠ、AvrⅡ 相应的限制酶识别序列 确保定向连接(避免质粒和目的基因自身环化及目的基因和质粒反向连接) (2)DNA连接酶 大量重组质粒 (3)BglⅡ (4)卡拉霉素 PCR (5)甲醇