1.2.2微生物的选择培养与计数(共30张PPT)-2022-2023学年高二生物学人教版（2019）选择性必修三课件

(共30张PPT)
1.2.2 微生物的选择培养与计数
第1章 发酵工程
本节聚焦
1.怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？
2.如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？
3.测定微生物数量的常用方法有哪些？
一、选择培养基
㈠筛选菌株
1、实例：
DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（93℃）的DNA聚合酶
原因：因为热泉温度70～80℃，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。
2.实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
3.选择培养基的概念：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或组织其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基
思考：
尿素[CO(NH2)2]含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥
尿素分解菌分解尿素的原理：
CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3
脲酶
1.如果让你配制一种培养基，让土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
培养基的配方中应含有微生物生长所需的营养要素——碳源、氮源、水、无机盐等。由于绝大多数微生物都能利用葡萄糖，分解尿素的细菌也能利用葡萄糖，可以用葡萄糖作为碳源，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，在培养基中加入尿素提供氮源，使培养基具有了选择作用。该培养基以尿素作为唯一氮源，只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
该培养基与普通培养基相比较，共同点是都认有机碳（如葡萄糖）作为碳源，都有水和无机盐；不同点是该培养基以尿素作为唯一氮源，使只有能以尿素作为氮源的微生物生长
二、微生物的选择培养
1.稀释涂布平板法
①铲取土壤，将样品装入纸袋中
②将10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的是试管中，依次等比稀释
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
（1) 将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按102～107的顺序编号。
（2) 用移液管吸取1mL锥形瓶中稀释10倍的菌液，注入102倍稀释的试管中。用手指轻压移液管的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。
（3) 从102倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入103倍稀释的试管中，重复第（2) 步的混匀操作。依次类推，直至完成最后一支试管的操作。
梯度稀释操作
拓展
（1) 各操作细节要保证“无菌”。例如，移液管要经过灭菌。梯度稀释时，试管口和移液管应在离火焰1～2cm处，涂布器要经过灼烧灭菌等。
（2) 将涂布器浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
（3) 操作中要注意防火。涂布结束后，应将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，以检测培养基是否灭菌彻底。
稀释涂布平板法操作的几点注意事项：
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
平板划线法 稀释涂布平板法
关键操作 接种环在固体平板培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
注意事项 每次划线前后均需灼烧接种环 稀释度要足够高，为确保试验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点 可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落 既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点 不能对微生物计数 操作复杂，需要涂布多个平板
三、微生物的数量测定
显微镜直接计数法：
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
②方法：用计数板计算。
③计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数x400x103x稀释倍数。
④缺点：不能区分死菌与活菌，造成统计值比实际值偏大。
1.统计菌落数目的方法：
间接计数法（活菌计数法）
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②操作注意事项：a.设置重复组，增强实验的说服力与准确性。b. 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③计算公式：每毫升样品中的菌株数=(C÷V)xM,其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL)，M代表稀释倍数。
④缺点：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，造成统计值比实际值偏小。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、土壤取样
细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3～8cm 的土壤层。因此，取样时一般要铲去表层土。
注：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
二、制备培养基
用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用以尿素为唯一氮源的培养基做实验组，用来判断选择培养基是否具有选择作用
实验设计流程
三、样品的稀释
在酒精灯火焰旁称取10g土壤，放入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，振荡使土壤与水充分混合，将细菌分散，制成101倍土壤稀释液。用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍的土壤稀释液。依次类推，制成103、104、105、106、107倍的土壤稀释液
四、涂布平板
图中的1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；另外，还要有两个对照，即不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌
五、观察与培养
将平板倒置于30～37℃温室中培养1～2d,每隔24h统计一次菌落数目
六、菌落计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。设计如下表格记录并计数
稀释度 104 105 106 107
1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
菌落数/平板
七、结果分析与评价
内容 现象 结论
有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
选择培养基中菌落数偏高 被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高 培养基中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作 得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功
重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近
1.如表所示为某微生物培养基的配方。下列说法中不正确的是( )
成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4·7H2O
含量 3g 1g 0.5g 0.5g
成分 FeSO4 （CH2O） H2O 青霉素
含量 0.01g 30g 定容至1000mL 0.1万单位
A.此培养基属于液体培养基，其中的碳源是（CH2O）
B.配制培养基时，溶化后必须要进行的是调整pH和灭菌
C.接种时应在酒精灯火焰附近操作
D.若用该培养基选择培养纤维素分解菌，应除去青霉素，加入纤维素粉
课堂练习
D
2.下图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的示意图,有关叙述错误的是( )
A.在配制步骤②、③ 的培养基时,应先调pH值后高压蒸汽灭菌
B.步骤③ 纯化分解尿素的原理是将聚集的细菌分散,可以获得单细胞菌落
C.步骤③ 采用涂布平板法接种,并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④ 挑取③ 中不同种的菌落分别接种,比较细菌分解尿素的能力
C
3.下列与纤维素分解菌及其分离实验的有关说法，错误的是( )
A.纤维素酶至少包括三种组分：C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶
B.正确的操作流程：土壤取样→选择培养→梯度稀释→挑选菌落
C.刚果红可与纤维素形成透明复合物，所以可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌
D.通过定时测定葡萄糖产量的变化来衡量纤维素分解菌培养液中纤维素酶产量
C
谢谢观看