3.2.1基因工程的基本操作程序(课件共22张PPT)

(共22张PPT)
课前回顾
重组DNA技术的基本工具？工具酶？
限制酶的来源？本质？作用？作用的化学键？结果？
DNA连接酶的本质？作用？作用的化学键？种类？
载体的本质？种类？作为载体需要的条件？
什么是质粒？
DNA粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤
3.2 基因工程的基本操作程序(第1课时)
本节聚焦
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
问题探讨
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
原核和真核基因的结构
启动子是一段有特殊碱基序列的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
终止子位于基因的尾端，相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。
典型的原核细胞基因的结构示意图
典型的真核细胞基因的结构示意图
目的基因的筛选与获取
一
编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”
真核细胞与原核细胞中基因表达过程示意图
原核和真核基因的结构
目的基因的筛选与获取
一
目的基因的筛选与获取
目的基因
1.概念：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子
一
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
目的基因的筛选与获取
筛选合适的目的基因
方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
越来越多基因的功能和结构被分析。
一
目的基因的获取
目的基因获取方法
从基因文库中获取
通过DNA合成仪直接合成
利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
一
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
基因文库：
基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
1.从基因文库中直接获取
目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
提取基因组DNA
DNA片段
重组载体
基因组文库
限制酶
与载体连接
导入受体菌
提取特定组织或发育时期的mRNA
单链DNA
重组载体
cDNA文库
双链cDNA
导入受体菌
与载体连接
DNA聚合酶
逆转录酶
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子
cDNA文库中的基因不含以上结构
2.人工合成
DNA合成仪
（1）前提：基因比较小、核苷酸序列已知
（2）方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
3.利用PCR获取和扩增目的基因
结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？
目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
体内DNA复制要点回顾
条件
原料：游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C）
模板：DNA的两条链
酶：DNA解旋酶、DNA聚合酶等
能量：ATP
复制原则
碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）
3.利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
3.利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
基本过程
变性 复性 延伸
条件P77
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？
如图所示，ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。 ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是转录的底物；同理，dATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA复制的底物。
3’
5’
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A.变性
90℃以上，双链DNA解聚为单链
B.复性
50℃左右，两种引物与两条单链DNA结合
C.延伸
72℃左右，4种脱氧核苷酸在Taq酶的作用下，合成新的DNA链
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3.利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
PCR小结
目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
受热变性
引物
耐高温的
DNA聚合酶
(1)过程：
（2）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出 个DNA片段，共需要引物数量为 个。　　　　
指数
2n
2n＋1－2
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
DNA在高温下变性解旋
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
PCR与DNA复制过程比较
3.利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的获取
目的基因的筛选与获取
一
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
例：以下为逆转录过程和PCR扩增过程示意图。据图分析,下列说法错误的是(　　)
A.催化①过程的酶是逆转录酶
B.④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C.催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶
D.如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%,则一个双链DNA中,A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
1.基因工程的操作步骤？核心？
2.目的基因？筛选目的基因有效的方法之一？
3.获取目的基因的方法？常用的方法？
4.PCR的全称？概念？原理？条件？过程（具体）？引物的作用
今天的内容你掌握了吗？