3.2.2基因工程的基本操作程序(课件共27张PPT)

(共27张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序
本节聚焦
基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥作用。
构建基因表达载体（核心工作）
基因表达载体由哪些部分组成
基因表达载体的构建
二
1.基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
基因的首端（一段有特殊结构的DNA片段）
人们所需要的基因
位置：
功能：
基因的尾端（一段特殊的DNA片断）
终止mRNA的转录
用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞
基因表达载体的构建
二
3.基因表达载体的构建过程
基因表达载体构建模式图
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
基因表达载体的构建
二
培育抗虫棉的简要过程
使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
问题探讨
选择2种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，减少自连情况出现；
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何解决这一问题？
(2016·全国课标卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，有人将此质粒用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________；并且________和________的细胞也是不能区分的，其原因是________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。
二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长
含有质粒载体
含有目的基因的重组质粒
二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长
四环素
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
将目的基因导入受体细胞
三
转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
培育抗虫棉的简要过程
1.花粉管通道法
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
将目的基因导入受体细胞
三
将目的基因导入植物细胞
2.农杆菌转化法-双子叶植物
农杆菌转化法步骤：
将目的基因导入受体细胞
三
将目的基因导入植物细胞
1.显微注射法
操作程序：
取受精卵
显微注射
胚胎移植
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
提纯基因表达载体
①体积大，易操作。
②全能性高，易培养成完整个体。
将目的基因导入受体细胞
三
将目的基因导入动物细胞
2.科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。
如慢病毒载体、腺病毒载体等。
将目的基因导入受体细胞
三
将目的基因导入动物细胞
使用Ca2+处理：
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
过程
微生物作为受体细胞的优点：
繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
大肠杆菌细胞
将目的基因导入受体细胞
三
将目的基因导入微生物细胞
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
目的基因的检测与鉴定
四
在棉花细胞中，重组表达载体是否导入成功？是否可以稳定维持并表达出Bt蛋白？表达出的Bt蛋白是否具有杀虫的功效？
1.分子检测
2.个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
1.分子水平的检测
1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增或DNA分子杂交技术
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
DNA分子杂交（Southern-blot)流程图
DNA分子杂交结果图
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增或分子杂交技术
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
Bt基因在抗虫棉中的表达
从左至右依次是苗期叶片、花铃期叶片，苞叶，花，雌雄蕊和铃壳
1.分子水平的检测
目的基因的检测与鉴定
四
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
分子水平的检测
目的基因的检测与鉴定
四
转Bt基因
非转基因
2.个体水平的检测
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
没有抗虫基因的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
目的基因的检测与鉴定
四
类型 步骤 检测内容 方法
分子检测 第一步 转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 PCR扩增
DNA分子杂交技术
第二步 目的基因是否转录出mRNA PCR扩增
分子杂交技术
第三步 目的基因是否翻译形成蛋白质 抗原-抗体杂交技术
个体水平鉴定 抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度 抗性检测； 基因工程产品与天然产品的功能活性比较 功能活性。
目的基因的检测与鉴定
四
基因工程的基本操作程序
获取质粒、噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物);
目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
到社会中去
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。
（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物（非抗品种）轮作或套种等。
（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
到社会中去
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ）
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
练习与应用（P83）
一.概念检测
D
1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
练习与应用（P83）
二、拓展应用
2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
【这项研究成果发表在《自然 生物技术》（Nature Biotechnology ）杂志上】
练习与应用（P83）
二、拓展应用
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是______ ，标记基因是_____ ，质粒pSYN12424的作用是______ 。
ctrⅠ基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
不能。
如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
练习与应用（P83）
二、拓展应用
(3)请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广'黄金大米'”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开
练习与应用（P83）
二、拓展应用