3.1重组DNA技术的基本工具(课件共26张PPT)

(共26张PPT)
第3章　基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具” 这些“分子工具”各具有什么特征呢
1．基因工程的概念：
指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因工程的别名
操作环境
操作对象
操作水平
原理
结果
DNA重组技术
生物体外
基因
DNA分子水平
人们需要的新的生物类型和生物产品
基因重组
一、基因工程
思考·讨论
1．为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
2．为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
2.基因工程的三种“分子工具
准确切割DNA分子的“分子手术刀”
将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”
二、限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
5'
3'
5'
3'
T
A
G
G
T
A
T
C
C
A
磷酸二酯键
1.来源:
主要来自原核生物
2.种类:
数千种
3.作用:
4.结果:
识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端;
当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
5. 限制酶的识别序列的特点
(1)EcoR I、 Sma I限制酶的识别序列均为6个核苷酸
(2)少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成
(3)实例
EcoR I
(在G与A之间切割)
Sma I
(在G与C之间切割)
5'
5'
5'
5'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
5'
3'
3'
黏性末端
平末端
限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列
思考·讨论
3．限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。
1．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
2．为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
思考·讨论
4．请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。
思考·讨论
5．请结合下图，推断限制酶切一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
断开两个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗两分子水。
种类 来源 特点
E.coli DNA连接酶 大肠杆菌 只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
T4 DNA 连接酶 T4噬菌体 既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用:
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
(2)种类:
比较DNA连接酶和DNA聚合酶
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不 同 点 作用 实质 催化单个脱氧核苷酸加到已有脱氧核苷酸片段上，形成磷酸二酯键 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
作用 结果 催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子 催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
模板 需要 不需要
相同点 ①化学本质都是蛋白质； ②都是催化形成磷酸二酯键 核心归纳
2. DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列，能否再被所用的限制酶识别。
(1)若两个相同黏性末端都是由同种限制酶(EcoRⅠ)切割后所得，能不能再被所用的限制酶识别(如图)
(2)若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，能不能再被所用的限制酶识别(如图)
不能
不能
用不同的限制酶进行切割，但只要切割后产生的黏性末端相同就可用DNA连接酶连接起来。
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1．种类：
质粒、噬菌体、动植物病毒等
2．常用载体——质粒
(1)本质：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(2)作用
①作为运输工具，将外源基因导入细胞。
②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
拟核DNA
质粒
氨苄青霉素抗性基因
大肠杆菌细胞
目的基因插入位点
复制原点
(3)质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的筛选
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
核心归纳
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
思考·讨论
重组DNA分子
用EcoRI限制酶切割下列两段DNA序列:
5' -ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC- 3'
3' -TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG- 5'
5'-TCCTAGAATT CTCGGTATGAATTCCATAC- 3'
3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG- 5'
5' -ATAGCATGCTATCCATGAATTCCATAC- 3'
3' -TATCGTACGATAGGTACTTAAGGTATG- 5'
5'
5'
3'
3'
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　)
(2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体(　　)
(3)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同(　　)
(4)作为载体，必须要有标记基因(　　)
×
×
辨析易错易混
√
√
DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理
1．提取DNA的原理
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
如：(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
(2)DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
2．鉴定DNA的原理
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
探究·实践
二、方法步骤
1．称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。
2．去除滤液中的杂质
方案一 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液
方案二 直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取上清液
探究·实践
3.DNA的析出
方案一 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA；用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分
方案二 将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干
探究·实践
4.DNA的鉴定
取两支20 mL的试管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支试管的NaCl溶液中，再向两支试管中加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
鉴定结果
鉴定DNA
探究·实践
三、方法步骤 （视频）
1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3．利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
4．不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。
5．提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：体积分数为95%的冷酒精提纯效果更佳。
特别提醒
知识网络
在基因工程操作过程中，DNA连接酶的作用是(　　)
A．将任意两个DNA片段连接起来
B．将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来，包括DNA片段和碱基对之间的氢键
C．连接具有相同黏性末端或平末端的DNA片段，即形成磷酸二酯键
D．只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键
练一练
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