1.2.2 微生物的选择培养和计数(课件共25张PPT)

(共25张PPT)
义县高中 刘占江
1.2.2微生物的选择培养和计数
高压蒸汽灭菌
液体培养基
微生物的基本培养技术
1、实验室培养微生物条件
1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件
—培养基
2）确保其它微生物无法混入
—无菌技术
高压蒸汽灭菌
温故知新：
2、培养基的营养构成:
碳源、氮源、水、无机盐等
1）碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等
自养微生物
异养微生物
2）氮源：
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
3）无机盐：
Ca、K 、Mg为大量元素
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、培养皿等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
无菌的方法：
接种室、接种箱，超净工作台
课题背景
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
那么我们又如何达成这一目标呢？
科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。
二、微生物的选择培养和计数
（一）选择培养基
美国黄石国家公园的一个热泉
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
实验室微生物的筛选时，可人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
培养基中加氨苄青霉素
具有氨苄青霉素抗性的菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌
培养基应有菌落
没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
举例1
加入青霉素：
不加氮源：
不加含碳有机物：
——分离出酵母菌、霉菌等真菌
(青霉素能杀死细菌、放线菌)
——分离出固氮菌
——分离出自养型微生物
补充资料1-几种选择培养基举例
那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
思考-讨论
选择培养基配方的设计
尿素的立体结构
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
讨论：
1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
配方一：培养细菌
配方二：培养可以分解尿素的细菌
补充资料2-普通培养基与选择培养基的比较
1、从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？
固体培养基
配方二是以尿素作唯一氮源的选择培养基
2、此培养基中共有哪些成分？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源： 配方二氮源：
成分：
碳源、氮源、水、无机盐
（二）微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
2、实验的具体操作：
2）土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
1）制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
1、稀释涂布平板法
是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
3）样品梯度稀释：
微量 移液器
稀释10倍菌液
101
土壤10g
在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
滴
2、取少量稀释液（不超过0.1ml ），滴加到培养基表面
灼
3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。
涂
4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
浸
4）取样涂布平板：
放入37℃恒温箱中培养1～2d
5）培养与观察
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
（三）微生物的数量测定
稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。
1、原理：
2、计数原则：
一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
②为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
④分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作
有误，需重新实验。
实例分析1：
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
3、计算：
每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释
倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、
212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。
实例分析2：
1、显微镜直接计数：
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
缺点：
不能区分死菌与活菌
不适于对运动细菌的计数
思考-讨论
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
尿素的立体结构
课题目的
1、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
2、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
研究思路
土壤取样
制备培养基
样品稀释与取样涂布
微生物的培养与观察
1、土壤取样
1）取样的位置：土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培养基。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌分布距地表3 8cm的土壤层。
2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
2、制备培养基
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
3、样品的稀释
测土壤中细菌数量，一般选用1x104 、1x105 和1x106倍的稀释液进行平板培养。
4、微生物的培养与观察
30-370C温度下培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数。
3、操作提示
2）无菌操作
3）做好标记
本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记
4）制定计划
对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊
1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
a、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
b、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入
锥形瓶中，塞好棉塞。
c、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
结果分析与评价
1、结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。
2、你是否获得了某一稀释度下菌落数目在30-300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？
3、你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？
不同菌落的颜色与形状
微生物的培养
基础知识
实验操作
结果分析与评价
培养基
定义：
分类：
无菌技术
定义：
消毒与灭菌
常用灭菌方法
制备选择培养基
纯化酵母菌
小结