3.1重组DNA技术的基本工具-(课件共45张PPT)

(共45张PPT)
3.1 重组DNA技术的基本工具
导入
扩增
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
非转基因番木瓜
转基因番木瓜
基因工程
就是按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
原 理：
基因重组
操作水平：
DNA分子水平
结 果：
定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的生物类型和生物产品
1、不同生物的基因为什么能拼接？
2、外源基因为什么能在受体细胞中表达？
思考-讨论
(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。相同的遗传信息在
不同的生物体内表达出相同的蛋白质。
基因工程诞生的理论基础
“工欲善其事，必先利其器”。在培育转基因番木瓜时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组DNA分子导入番木瓜体内，并使其表达。
DNA分子极小，实现这些精确操作需要哪些“分子工具”呢？
3.1 重组DNA技术的基本工具
重组DNA技术的基本工具：
（三）分子运输车---运载体
分子运输车
（一）分子手术刀---限制性内切核酸酶
分子手术刀
（二）分子缝合针---DNA连接酶
（一）分子手术刀---限制性内切核酸酶（限制酶）
1、来源：
主要从原核生物中分离纯化来的
3、特点 :
4、作用部位:
特定切点上的磷酸二酯键
5、结果：
形成黏性末端和平末端
2、种类：
数千种
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
1’
2’
3’
4’
5’
G
1’
2’
3’
4’
5’
A
3’,5’-磷酸二酯键
3’端
5’端
3’端
5’端
（1）限制酶作用部位:
（2）限制酶的识别序列
限制酶所识别序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列
在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：
黏性末端
黏性末端
（3）EcoRI 限制酶的切割:
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
EcoRI 只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
　
黏性末端　　　　
黏性末端
中轴线
（4）SmaI 限制酶的作用
SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
在C和G之间切开
平末端　　　平末端
（5）SmaI 限制酶的切割
1、要想获得某个特定性状的基因必须要
用限制酶切几个切口？可产生几个黏
性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端。
2、如果把两种来源不同的DNA用同一种
限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性末端
供体生物细胞
取出DNA
限制酶
目的基因
想一想：
断开两个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗两分子水。
同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。
现有EcoRI限制酶（识别GAATTC序列，在G和A之间切）和SmaI限制酶（识别CCCGGG序列，在C和G之间切），请用这两种限制酶将①、②
号DNA片段分别切割为两段。
……ATAGCATGCTATGAATTCGGCATACCCAT……
……TATCGTACGATACTTAAGCCGTATGGGTA……
①
……ATAGCATGCTATCCCGGGAACATACCCAT……
……TATCGTACGATAGGGCCCTTGTATGGGTA……
②
模拟实验1：模拟限制酶的剪切
EcoRI限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切割。
SmaI限制酶只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割。
……ATAGCATGCTATGAATTCGGCATACCCAT……
……TATCGTACGATACTTAAGCCGTATGGGTA……
……ATAGCATGCTATCCCGGGAACATACCCAT……
……TATCGTACGATAGGGCCCTTGTATGGGTA……
回文序列
限制酶识别序列的特征：
反向重复，中心对称。
结果：形成黏性末端或平末端
①黏性末端：
②平末端：
……ATAGCATGCTATG
……TATCGTACGATACTTAA
AATTCGGCATACCCAT……
GCCGTATGGGTA……
……ATAGCATGCTATCCC
……TATCGTACGATAGGG
GGGAACATACCCAT……
CCCTTGTATGGGTA……
思考·讨论
3．限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
不能。
1．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
2．为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
主要是原核生物
数千种
1、来源：
2、种类：
3、作用特点：
4、结果：
形成两种末端
小结： “分子手术刀” ——限制酶
黏性末端
平末端
5、限制酶切一次可产生2个末端和2个游离的磷酸基团
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
思考：
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
什么样的末端才能连接起来？，
（二）分子缝合针---DNA连接酶
1. 作用：
2. 种类：
⑴ E·coli DNA连接酶
⑵ T4 DNA连接酶
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
1、E·coli DNA连接酶的缝合作用
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
（1）E·coli DNA连接或T4DNA连接酶连接粘性末端
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
（2）T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低
CTTCATG
GAAGTACTTAA
AATTCCCTAA
GGGATT
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
TCTTCATG
AGAAGTACTTAA
AATTCCCTAAG
GGGATTC
GG...TCTTAA
AATTCC...AG
（3） E·coli DNA连接酶在基因工程中的应用
（4）E·coli DNA连接酶与T4DNA连接酶比较：
类型 来源
E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
功能
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复磷酸
二酯键
只能连接黏性末端
能连接黏性末端和平末端(效率较低)
相同点
差别
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
A A T T G
C
A
A
T
T
A
A
T
T
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
(5)DNA聚合酶的作用
比较DNA连接酶和DNA聚合酶
种类 DNA聚合酶 DNA连接酶
不 同 点 作用 实质 催化单个脱氧核苷酸加到已有脱氧核苷酸片段上，形成磷酸二酯键 催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
作用 结果 催化形成与模板链互补的DNA链，形成新的双链DNA分子 催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子
模板 需要 不需要
相同点 ①化学本质都是蛋白质； ②都是催化形成磷酸二酯键 核心归纳
（三）分子运输车---运载体
分子运输车
质粒
将外源基因送入受体细胞。
1.作用：
动植物病毒
λ噬菌体的衍生物
2.种类：
质粒
3质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的筛选
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
质粒
的特点
质粒是基因工程中最常用的运载体
最常用的质粒是大肠杆菌的质粒
细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子
存在于许多细菌及酵母菌等生物中
质粒的存在对宿主细胞无影响
质粒的复制只能在宿主细胞内完成
4、小资料---质粒的特点：
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
大肠杆菌及质粒结构模式图
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
GCCGTATG…
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
实例： 重组DNA分子的模拟操作
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
目的基因
… TCCTAG
… AGGATCTTAA
AATTCCATAC …
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
GGTATG …
GCCGTATG…
1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因
规律：---选择酶切位点的原则：
Hind III和EcoR I
下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？
各抒己见
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(　　)
(2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体(　　)
(3)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同(　　)
(4)作为载体，必须要有标记基因(　　)
×
×
辨析易错易混
√
√
DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理
1．提取DNA的原理
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
如：(1)DNA在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
(2)DNA在NaCl溶液中的溶解性：DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
2．鉴定DNA的原理
在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
探究·实践
二、方法步骤
1．称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。
2．去除滤液中的杂质
方案一 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液
方案二 直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取上清液
探究·实践
3.DNA的析出
方案一 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA；用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分
方案二 将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干
探究·实践
4.DNA的鉴定
取两支20 mL的试管，各加入2 mol/L的NaCl溶液5 mL。将丝状物或沉淀物溶解于其中一支试管的NaCl溶液中，再向两支试管中加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
鉴定结果
鉴定DNA
探究·实践
三、方法步骤 （视频）
1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2．加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3．利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。
4．不能选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。
5．提纯DNA时，选用体积分数为95%的冷酒精的原因：体积分数为95%的冷酒精提纯效果更佳。
特别提醒
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
小结
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类:
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
在基因工程操作过程中，DNA连接酶的作用是(　　)
A．将任意两个DNA片段连接起来
B．将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来，包括DNA片段和碱基对之间的氢键
C．连接具有相同黏性末端或平末端的DNA片段，即形成磷酸二酯键
D．只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键
练一练
C