3.2基因工程的基本操作程序（第一课时）课件（32张ppt）-2022-2023学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

(共32张PPT)
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
（第一课时）
学习目标：
1.基于PCR技术，运用结构与功能观等理解PCR技术的过程、原理、条件等内容。(生命观念)
2．基于抗虫棉的培育实例，采用文字和图示的方式说明基因工程的基本操作程序。(科学思维、科学探究)
3．尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。(科学探究)
培育转基因抗虫棉的简要过程
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
导入
抗虫基因
（Bt抗虫蛋白基因）
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取（前提）
2.基因表达载体的构建（核心）
3.将目的基因导入受体细胞（关键）
4.目的基因的检测与鉴定（保证）
具体的步骤？
(含抗虫基因）
（含有并表达抗虫基因）
抗虫基因已插入染色体DNA中
1.基因工程的基本操作程序
1、目的基因的筛选与获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
基因的结构
非编码区
（不转录）
编码区
（转录）
启动子：在基因的上游
终止子：在基因的下游
调控转录过程
外显子：转录后翻译，编码蛋白质的合成
内含子：转录后被切除，不翻译
原核生物：无内含子，其编码区是连续的
真核生物：有内含子，其编码区是间断的、不连续的。
非编码序列：不能编码蛋白质的片段，包括非编码区和内含子
编码序列 ：能编码蛋白质的片段，即外显子
①
②
转录起点
转录终点
原核生物
真核生物
编码区（转录区）
非编码区
非编码区
启动子
启动子
终止子
终止子
外显子
内含子
基因结构示意图
1.目的基因的获取和筛选
苏云金芽孢杆菌
产生
Bt基因
伴胞晶体蛋白
(Bt抗虫蛋白)
表达
破坏鳞翅目昆虫的消化系统
杀死棉铃虫
棉花细胞
导入
抗虫棉
培育
1.概念：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关基因。
主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子；
①筛选合适的目的基因
方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因的原因
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
对Bt基因的表达产物--对Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
筛选目的基因的技术手段：
测序技术
序列数据库(如GenBank)
序列比对工具(如BLAST)
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
①筛选合适的目的基因
目的基因获取方法
从基因文库中获取
通过DNA合成仪直接合成
利用PCR获取和扩增目的基因
②获取合适的目的基因：
基因组文库
部分基因文库（主要是cDNA文库）
基因文库：
1.从基因文库中直接获取：
基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。
与载体连接
导入受体菌群
用适当
限制酶切割
（1）基因组文库的构建
提取某生物
全部DNA
许 多
DNA片段
该生物
基因组文库
（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）
（2）cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成
mRNA
（某一发育时期）
逆转录酶
杂交双链
核酸酶H
单链DNA
DNA聚合酶
双链cDNA
(cDNA)
与载体连接
导入受体菌群
该生物
cDNA文库
基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子
cDNA文库中的基因不含以上结构
②获取合适的目的基因：
1.从基因文库中直接获取：
2.人工合成：
DNA合成仪
（1）前提：
（2）方法：
②获取合适的目的基因：
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
3.利用PCR获取和扩增目的基因：
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
发明者：穆里斯
体内DNA复制要点回顾:
条件
原料：游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C）
模板：DNA的两条链
酶：DNA解旋酶、DNA聚合酶等
能量：ATP
复制原则:
碱基互补配对原则
（保证复制的准确进行）
结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？
3.利用PCR获取和扩增目的基因：
PCR扩增仪
知道目的基因的两端核苷酸序列，基因又比较大
前提：
3.利用PCR获取和扩增目的基因：
1.目的基因的获取和筛选
1.体外PCR的条件：
耐高温的DNA聚合酶
（TaqDNA聚合酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
①DNA模板（需含有目的基因）。
②分别与模板DNA相结合的2种引物。
③四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。
④耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）。
⑤稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。
⑥能严格控制温度的温控设备。
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
a.什么是引物
1.目的基因的获取和筛选
1.体外PCR的条件：
在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始台成子链，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
2.PCR反应的过程：
1）变性：
当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
待扩增的DNA片段
第一步：变性
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
变性
90℃
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
1.目的基因的获取和筛选
（2）PCR反应过程：
2）复性：
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。
第二步：复性
引物1
引物2
DNA引物
3’
5’
3’
5’
碱基互补配对
5’
5’
3’
3’
思考：复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，
原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
（2）PCR反应过程：
3）延伸：
当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
第三步：延伸
引物1
引物2
Taq酶
Taq酶
3’
5’
3’
5’
脱氧核苷酸
5’
5’
DNA聚合酶
72℃
3’
3’
3’
3’
思考1：为什么温度要上升至72℃？
思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
（2）PCR反应过程：
1个DNA片段
2个DNA片段
4个DNA片段
8个DNA片段
第一轮
第二轮
小结：PCR重复多次后,DNA分子呈指数形式扩增（约为2n）
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式
场所
引物
酶
温度
结果
联系
解旋酶催化，边解旋边复制
高温变性解旋，全部解旋后再复制
主要在细胞核内
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
RNA
通常是DNA
解旋酶、DNA聚合酶等
耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
细胞内温和条件
在不同温度(较高)下进行
合成整个DNA分子
扩增特定的DNA片段或基因
①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板
③原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
②酶:均需DNA聚合酶
④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链
获得目的基因后直接转入受体吗？
不是，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因。
构建基因表达载体的目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在
使目的基因可以遗传给下一代
使目的基因能够表达和发挥作用
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
2.基因表达载体的构建
基因表达载体的作用：
① 让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；
② 使目的基因能够表达和发挥作用。
☆基因表达载体的构建是基因工程的核心工作。
启动子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，启动转录过程。
终止子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，终止转录。
2.基因表达载体的构建
“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”
启动子与终止子位于DNA分子中，起始和终止转录过程。
启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，起始和终止翻译过程。
(1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了 。
目的基因
(2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
注意:
基因表达载体构建的流程：
①用限制酶切割载体，使它出现一个缺口；
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因；
③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子（基因表达载体、重组质粒）。
重组DNA分子
目的基因
2.基因表达载体的构建
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
2.基因表达载体的构建
拓展：限制酶的选择
1、单酶切（同一种酶）：
（1）目的（结果）：
产生相同的黏性末端，以便进行连接
（2）DNA连接酶处理后会出现几种产物：
质粒
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连：
质粒自连：
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
单酶切缺点：质粒重新环化、目的基因自身环化、质粒与目的基因反向连接
2.基因表达载体的构建
拓展：限制酶的选择
2、双酶切
如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
使用两种限制酶的优点：①防止目的基因和载体的自身环化
②还可以防止目的基因与载体的反向连接
一、选择题
1.在基因工程的基本操作程序中，目的基因的获取的途径不包括(　　)
A．从基因文库中获取目的基因 B．利用PCR技术扩增目的基因
C．人工合成目的基因 D．利用DNA分子杂交技术，获取目的基因
2.PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，下列有关PCR过程的叙述，不正确的是(　　)
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
3.下列对基因表达载体构建的叙述，不正确的是(　　)
A．需要限制酶和DNA连接酶等特殊工具
B．基因表达载体中有的含有启动子和密码子
C．标记基因不一定是抗生素抗性基因
D．基因表达载体的构建是基因工程的核心
4.在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是(　　)
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子　②有了启动子才能驱动目的基因转录出mRNA　③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止　④所有基因表达载体的构建是完全相同的
A．②③ B．①④ C．①② D．③④
5.下图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、EcoR Ⅰ、Apa Ⅰ为四种限制性内切核酸酶。下列叙述错误的是(　　)
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
1.D 2.C 3.B 4.B 5.B