生物人教版（2019）选择性必修3 3.2 基因工程的基本操作程序（课件共65张ppt）
文档属性
| 名称 | 生物人教版（2019）选择性必修3 3.2 基因工程的基本操作程序（课件共65张ppt） |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 109.7MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-04-27 21:59:58 | ||
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文档简介
(共65张PPT)
课前回顾
1.重组DNA技术的基本工具？
工具酶？
2.限制酶的来源？
作用？
作用的化学键？
结果？
3.DNA连接酶的作用？
作用的化学键？
种类？
4.载体的种类？
作为载体需要的条件？
5.什么是质粒？
6.DNA粗提取的原理？
鉴定的原理？
方法步骤？
1994年郭三堆培育出转基因棉花植株，使中国成为继美国之后，世界第二个拥有自主知识产权转基因抗虫棉国家。这不仅打破了美国的垄断，保护了民族利益，而且为我国农业高新技术在国际竞争中争得了一席之地。
郭三堆
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
第三章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物
以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
基因工程的基本操作程序
（4个步骤）
第一步：目的基因的筛选与获取
1.目的基因的定义：
用于__________________或___________________等的基因。
改变受体细胞性状
获得预期表达产物
编码蛋白质的基因
2.目的基因的类型：
主要是指___________________。
与生物抗逆性相关的基因
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
资料： 通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（ ），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”（Bt 抗虫蛋白基因，简称 ）转入棉花中，使棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
Bt 抗虫蛋白
苏云金杆菌
Bt基因
3.目的基因的筛选：
从相关的 和 中进行筛选是较为有效的方法之一。
已知结构
功能清晰的基因
苏云金杆菌的杀虫作用于Bt基因有关
掌握了Bt基因的
序列信息
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解
苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害
Bt基因是培育转基因抗虫棉的目的基因
3.目的基因的筛选：
测序技术
序列数据库(如GenBank)
序列比对工具(如BLAST)
测定核酸和
蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能
越来越多的基因的结构和功能为人们所知，
4.目的基因的获取：
（1）从生物组织中直接获取
“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”
（2）化学方法直接人工合成
化学合成法：在明确目的基因碱基序列的基础上，利用DNA合成仪自动化合成所需的DNA片段
仅适用于较短的DNA
DNA合成仪
【思考】若不明确基因碱基序列呢？
蛋白质氨基酸序列
mRNA序列
基因序列
反转录法
4.目的基因的获取：
（1）从生物组织中直接获取
“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”
（2）化学方法直接人工合成
（3）从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，结合质粒导入受体菌群体中储存，这个受体菌群就是该生物的基因文库。
（4）利用PCR技术扩增目的基因
利用PCR技术扩增目的基因
1.PCR的中文全称：
聚合酶链式反应
2.原理：
DNA半保留复制
3.操作环境：
体外
（PCR扩增仪/PCR仪）
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行。
4.条件：
资料：真核生物和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加 。
Mg2+
参与的组分 在DNA复制中的作用
【回顾】DNA复制所需要的条件
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
解旋酶
DNA两条母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸
【思考】什么是引物？
引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的
。
短单链核酸
解旋酶
DNA的合成方向总是从子链的5＇端向3＇端延伸。
5＇端
3＇端
5＇端
3＇端
由于DNA双链是反向平行的，所以需要 引物。
2种
4.基本条件：
利用PCR技术扩增目的基因
DNA模板
4种脱氧核苷酸
与两条模板链结合的2种引物
耐高温的DNA聚合酶
用于PCR的引物长度
通常为20~30个核苷酸
实际加入的是dATP dGTP dCTP dTTP
（既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量）
（TaqDNA聚合酶）
P
P
P
碱基
脱氧核糖
~
~
（A、G、C、T）
利用PCR技术扩增目的基因
5.PCR过程：
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到 时，双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到 时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到 时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
90℃以上
50℃左右
72℃左右
【思考】复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，
也存在解开的两条DNA单链的结合，
但两条模板链重新结合的概率较低，
原因:
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的
碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
PCR小结
(1)过程：
变性
复性
延伸
温度：90℃以上
温度：50℃左右
过程：两种引物通过碱基互补配对与
两条单链DNA结合
温度：72℃左右
过程：4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，添加在引物的
3’端，合成新的DNA链。
反复循环
过程：目的基因DNA双链受热变性后解聚为单链
PCR小结
（2）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出 个DNA片段，共需要引物数量为 个。
指数
2n
2n＋1－2
注意：用于PCR扩增的DNA片段往往为了保证目的基因的完整，经切割后目的基因的两端会有一小段非基因序列，其也可能随目的基因一起扩增。
A
A
C
G
G
C
T
T
A
A
T
T
【思考】PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能
从DNA分子中分离出目的基因？
第
一
次
循
环
90℃以上，DNA双链解开
50℃左右，引物与DNA结合
72℃左右，新DNA合成
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
第
二次
循
环
5’
3’
5’
5’
3’
5’
高温变性、低温复性
中温延伸
第
二次
循
环
3’
5’
高温变性、低温复性
第
三次
循
环
3’
5’
中温延伸
第
三次
循
环
3’
5’
目的基因
目的基因
【思考】用PCR可以扩增mRNA吗？
不可以直接扩增mRNA，
需要将它逆转录成cDNA（complementary DNA）再进行扩增。
【思考】PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能
从DNA分子中分离出目的基因？
3次
【思考】怎么鉴定PCR的产物？
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术与体内DNA复制过程比较
项目 PCR技术 体内DNA复制
相同点 原理 原料 条件 不同点 场所
解旋方式
酶
引物
特点
是否需要ATP
温度条件
结果
碱基互补配对原则
四种脱氧核苷酸
均需要模板、引物、酶等
细胞外
（主要在PCR仪内）
（主要在细胞核内）
细胞内
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
耐高温的TaqDNA聚合酶
解旋酶、普通的DNA聚合酶
一小段RNA或单链DNA分子片段
一小段RNA
体外迅速扩增
边解旋边复制
不需要
需要
需控制温度，在较高温度下进行
细胞内温和的条件
短时间内可形成大量的DNA片段
形成完整的DNA分子
第二步：基因表达载体的构建
1.作用：
① 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
② 同时使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的构建是基因工程的核心
2.组成：
目的基因
标记基因
启动子
终止子
复制原点
（载体DNA复制的起始点）
启动子
一段有特殊序列的DNA片段，位于基因的 ，
是 识别和结合的部位。
RNA聚合酶
上游
终止子
驱动基因转录出 ，最终表达出人类需要的 。
mRNA
蛋白质
有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建 ，
但诱导物存在时，可以 或 目的基因的表达。
诱导型启动子
激活
抑制
一段有特殊序列的DNA片段，位于基因的 。
下游
终止转录。
目的基因要插入启动子和终止子之间
启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学 成分
位置
作用
DNA片段
DNA片段
mRNA上
三个相邻碱基
mRNA上
三个相邻碱基
目的基因首端
目的基因尾端
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
决定转录的结束
翻译的起始信号
决定翻译过程的结束
A
A
G
U
G
U
U
A
U
mRNA
第二步：基因表达载体的构建
3.过程：
先用 或 的限制酶
切割载体和含有目的基因的片段，
再用 将目的基因片段拼接到载体上，形成重组DNA分子。
目的基因
限制酶切割位点
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
同种限制酶
能产生相同末端
（同尾酶）
DNA连接酶
【思考】使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
选择 不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，
减少自连情况（自身环化）出现
自连
目的基因自连
质粒自连
片段间的连接
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
目的基因
1
1’
载体
2
2’
正向连接
1
2
2’
1’
2种
2
1’
1
2’
反向连接
第三步：将目的基因导入受体细胞
一、将目的基因导入植物细胞
1.花粉管通道法
①用 将
直接注入 中；
（我国独创）
②在植物受粉后的一定时间内，
，将DNA溶液滴加在 上，使目的基因借助
进入 。
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
剪去柱头
花柱切面
花粉管通道
胚囊
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
一、将目的基因导入植物细胞
2.农杆菌转化法
(1)转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内
和 的过程。
维持稳定
表达
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，
实质都是 。
基因重组
(2)特点：
a.能在自然条件下侵染 .
和 ，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 .（ ）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的
上。
双子叶植物
裸子植物
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
染色体DNA
2.农杆菌转化法
(3)思路：
将目的基因插入Ti质粒的 中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
(4)具体转化方法：
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，
然后筛选转化细胞，并再生成植株。
②将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，
然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
T-DNA
2.农杆菌转化法
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
（5）过程
第三步：将目的基因导入受体细胞
二、将目的基因导入动物细胞
1.导入方法：
显微注射法
2.受体细胞:
受精卵
【思考】为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
①体积大，易操作;
②易表现出全能性。
二、将目的基因导入动物细胞
3.过程：
基因表达载体提纯
受精卵
胚胎
雌性动物的输卵管或子宫内
显微注射
新性状的动物
早期胚胎培养
胚胎移植
发育
第三步：将目的基因导入受体细胞
三、将目的基因导入微生物细胞
1.常用方法：
Ca2+处理
（思考：目的？）
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
（感受态）
2.受体细胞:
原核细胞
（常选择大肠杆菌）
（思考：优点？）
遗传物质相对较少，易于培养，繁殖快。
3.过程:
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收重组DNA
增加细胞壁的
通透性
一般利用温度变化导入
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
第四步：目的基因的检测与鉴定
一、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
(1)方法:
DNA分子杂交
基因探针
简称 ，是一段带有 （同位素、荧光分子或化学发光催化剂），且 已知的，与 互补核酸序列(DNA或RNA)。
探针
顺序
目的基因
检测标记
(2)过程:
① 首先取出转基因生物的基因组DNA；
............TACGGTCATGTCGCATGCTAG............
............ATGCCAGTACAGCGTACGATC............
目的基因片段
基因探针
............GTACAGCGTA...........
放射性标记
杂交DNA分子
② 将含目的基因的DNA片段用
放射性同位素等作标记,以此做探针；
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出 ,表明目的基因已插入染色体DNA中。
杂交带
............TACGGTCATGTCGCATGCTAG............
目的基因片段
............GTACAGCGTA...........
基因探针
(3)技术:
PCR等技术
DNA变性、复性与分子杂交
(4)检测原理:
碱基互补配对原则
第四步：目的基因的检测与鉴定
二、检测目的基因是否转录出了mRNA
(1)方法:
分子杂交
(2)过程:
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,
表明目的基因转录出了mRNA。
三、检测目的基因是否翻译成蛋白质
(1)方法:
抗原-抗体杂交
(2)过程:
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白
抗体
脱分化
提取
蛋白质
出现
杂交带
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫
（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染
（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
二、个体水平的检测
【到社会中去】
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重
的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；
2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。
在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
【到社会中去】
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
(1)基因策略:
该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。
例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
(2)田间策略:
这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。
例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；
在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。
我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。
这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。
这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
(3)国家宏观调控策略:
该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
【探究与实践】
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一.实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的_______原理，通过_________来控制DNA双链的 与 ，PCR仪实质上就是一台能够_______________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理；
热变性
调节温度
解聚
结合
自动调控温度
30
DNA半保留复制
一.实验原理
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_______________，在一定的___下，这些基团可以带上 或
，在______的作用下，这些_________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
正电荷
负电荷
电场
带电分子
与它所带电荷相反
电泳
②PCR的产物一般通过_________________来鉴定；
琼脂糖凝胶电泳
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________、________________和_____等有关
凝胶的浓度
DNA分子的大小
构象
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为_______的_______下被检测出来。
染色
300nm
紫外灯
二.材料用具
①PCR仪
（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管
（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器
（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头
（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置
（包括电泳仪、电泳槽等）
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
三.方法步骤
(一）DNA片段的扩增
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
1.移液：
用 按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在 中依次加入各组分
2.离心：
待所有组分都加入后， 离心管的盖子，将微量离心管放入 里，离心约10s，使反应液集中在离心管的 （提高反应速率）
3.反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性：
微量移液器
微量离心管
盖严
离心机
底部
(二）DNA片段的电泳鉴定
(二）DNA片段的电泳鉴定
1.配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
2.制备凝胶
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
3.加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
4.电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
5.观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
注意
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、
枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，
并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的
枪头都必须 。
4.在进行操作时，一定要 。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
高压灭菌
-20℃
更换
戴好一次性手套
结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？
如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
【习题训练】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
练习与应用
一、概念检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
(1)afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（ ）
(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（ ）
(3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ）
√
×
×
练习与应用
一、概念检测
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
D
练习与应用
二、拓展应用
1.外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。
例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
练习与应用
二、拓展应用
2.(1)crtⅠ基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
(2)不能。
如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，
限制酶可能将它切断。
（3）维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。 β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，便其胚乳中富含β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。
拓展：细胞的基因结构
*原核细胞的基因结构
DNA
基因
上游
下游
mRNA
转录
翻译
多肽链
RNA聚合酶
结合位点
非编码区
非编码区
编码区
拓展：细胞的基因结构
*真核细胞的基因结构
前体mRNA
下游
DNA
上游
RNA聚合酶
结合位点
非编码区
非编码区
编码区
转录
剪切
成熟mRNA
内含子（不能编码蛋白）
外显子（能编码蛋白）
多肽链
翻译
拼接
课前回顾
1.重组DNA技术的基本工具？
工具酶？
2.限制酶的来源？
作用？
作用的化学键？
结果？
3.DNA连接酶的作用？
作用的化学键？
种类？
4.载体的种类？
作为载体需要的条件？
5.什么是质粒？
6.DNA粗提取的原理？
鉴定的原理？
方法步骤？
1994年郭三堆培育出转基因棉花植株，使中国成为继美国之后，世界第二个拥有自主知识产权转基因抗虫棉国家。这不仅打破了美国的垄断，保护了民族利益，而且为我国农业高新技术在国际竞争中争得了一席之地。
郭三堆
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
第三章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物
以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
基因工程的基本操作程序
（4个步骤）
第一步：目的基因的筛选与获取
1.目的基因的定义：
用于__________________或___________________等的基因。
改变受体细胞性状
获得预期表达产物
编码蛋白质的基因
2.目的基因的类型：
主要是指___________________。
与生物抗逆性相关的基因
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
资料： 通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（ ），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”（Bt 抗虫蛋白基因，简称 ）转入棉花中，使棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
Bt 抗虫蛋白
苏云金杆菌
Bt基因
3.目的基因的筛选：
从相关的 和 中进行筛选是较为有效的方法之一。
已知结构
功能清晰的基因
苏云金杆菌的杀虫作用于Bt基因有关
掌握了Bt基因的
序列信息
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解
苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害
Bt基因是培育转基因抗虫棉的目的基因
3.目的基因的筛选：
测序技术
序列数据库(如GenBank)
序列比对工具(如BLAST)
测定核酸和
蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能
越来越多的基因的结构和功能为人们所知，
4.目的基因的获取：
（1）从生物组织中直接获取
“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”
（2）化学方法直接人工合成
化学合成法：在明确目的基因碱基序列的基础上，利用DNA合成仪自动化合成所需的DNA片段
仅适用于较短的DNA
DNA合成仪
【思考】若不明确基因碱基序列呢？
蛋白质氨基酸序列
mRNA序列
基因序列
反转录法
4.目的基因的获取：
（1）从生物组织中直接获取
“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”
（2）化学方法直接人工合成
（3）从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，结合质粒导入受体菌群体中储存，这个受体菌群就是该生物的基因文库。
（4）利用PCR技术扩增目的基因
利用PCR技术扩增目的基因
1.PCR的中文全称：
聚合酶链式反应
2.原理：
DNA半保留复制
3.操作环境：
体外
（PCR扩增仪/PCR仪）
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行。
4.条件：
资料：真核生物和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加 。
Mg2+
参与的组分 在DNA复制中的作用
【回顾】DNA复制所需要的条件
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
解旋酶
DNA两条母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸
【思考】什么是引物？
引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的
。
短单链核酸
解旋酶
DNA的合成方向总是从子链的5＇端向3＇端延伸。
5＇端
3＇端
5＇端
3＇端
由于DNA双链是反向平行的，所以需要 引物。
2种
4.基本条件：
利用PCR技术扩增目的基因
DNA模板
4种脱氧核苷酸
与两条模板链结合的2种引物
耐高温的DNA聚合酶
用于PCR的引物长度
通常为20~30个核苷酸
实际加入的是dATP dGTP dCTP dTTP
（既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量）
（TaqDNA聚合酶）
P
P
P
碱基
脱氧核糖
~
~
（A、G、C、T）
利用PCR技术扩增目的基因
5.PCR过程：
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到 时，双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到 时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到 时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
90℃以上
50℃左右
72℃左右
【思考】复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？
复性时引物与DNA模板的结合是随机的，
也存在解开的两条DNA单链的结合，
但两条模板链重新结合的概率较低，
原因:
①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。
②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的
碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。
PCR小结
(1)过程：
变性
复性
延伸
温度：90℃以上
温度：50℃左右
过程：两种引物通过碱基互补配对与
两条单链DNA结合
温度：72℃左右
过程：4种脱氧核苷酸在耐高温DNA聚合酶的催化下，根据碱基互补配对原则，添加在引物的
3’端，合成新的DNA链。
反复循环
过程：目的基因DNA双链受热变性后解聚为单链
PCR小结
（2）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以_____方式扩增，可以扩增出 个DNA片段，共需要引物数量为 个。
指数
2n
2n＋1－2
注意：用于PCR扩增的DNA片段往往为了保证目的基因的完整，经切割后目的基因的两端会有一小段非基因序列，其也可能随目的基因一起扩增。
A
A
C
G
G
C
T
T
A
A
T
T
【思考】PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能
从DNA分子中分离出目的基因？
第
一
次
循
环
90℃以上，DNA双链解开
50℃左右，引物与DNA结合
72℃左右，新DNA合成
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
第
二次
循
环
5’
3’
5’
5’
3’
5’
高温变性、低温复性
中温延伸
第
二次
循
环
3’
5’
高温变性、低温复性
第
三次
循
环
3’
5’
中温延伸
第
三次
循
环
3’
5’
目的基因
目的基因
【思考】用PCR可以扩增mRNA吗？
不可以直接扩增mRNA，
需要将它逆转录成cDNA（complementary DNA）再进行扩增。
【思考】PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能
从DNA分子中分离出目的基因？
3次
【思考】怎么鉴定PCR的产物？
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术与体内DNA复制过程比较
项目 PCR技术 体内DNA复制
相同点 原理 原料 条件 不同点 场所
解旋方式
酶
引物
特点
是否需要ATP
温度条件
结果
碱基互补配对原则
四种脱氧核苷酸
均需要模板、引物、酶等
细胞外
（主要在PCR仪内）
（主要在细胞核内）
细胞内
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
耐高温的TaqDNA聚合酶
解旋酶、普通的DNA聚合酶
一小段RNA或单链DNA分子片段
一小段RNA
体外迅速扩增
边解旋边复制
不需要
需要
需控制温度，在较高温度下进行
细胞内温和的条件
短时间内可形成大量的DNA片段
形成完整的DNA分子
第二步：基因表达载体的构建
1.作用：
① 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
② 同时使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的构建是基因工程的核心
2.组成：
目的基因
标记基因
启动子
终止子
复制原点
（载体DNA复制的起始点）
启动子
一段有特殊序列的DNA片段，位于基因的 ，
是 识别和结合的部位。
RNA聚合酶
上游
终止子
驱动基因转录出 ，最终表达出人类需要的 。
mRNA
蛋白质
有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建 ，
但诱导物存在时，可以 或 目的基因的表达。
诱导型启动子
激活
抑制
一段有特殊序列的DNA片段，位于基因的 。
下游
终止转录。
目的基因要插入启动子和终止子之间
启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
化学 成分
位置
作用
DNA片段
DNA片段
mRNA上
三个相邻碱基
mRNA上
三个相邻碱基
目的基因首端
目的基因尾端
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
决定转录的结束
翻译的起始信号
决定翻译过程的结束
A
A
G
U
G
U
U
A
U
mRNA
第二步：基因表达载体的构建
3.过程：
先用 或 的限制酶
切割载体和含有目的基因的片段，
再用 将目的基因片段拼接到载体上，形成重组DNA分子。
目的基因
限制酶切割位点
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
同种限制酶
能产生相同末端
（同尾酶）
DNA连接酶
【思考】使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
选择 不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，
减少自连情况（自身环化）出现
自连
目的基因自连
质粒自连
片段间的连接
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
目的基因
1
1’
载体
2
2’
正向连接
1
2
2’
1’
2种
2
1’
1
2’
反向连接
第三步：将目的基因导入受体细胞
一、将目的基因导入植物细胞
1.花粉管通道法
①用 将
直接注入 中；
（我国独创）
②在植物受粉后的一定时间内，
，将DNA溶液滴加在 上，使目的基因借助
进入 。
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
剪去柱头
花柱切面
花粉管通道
胚囊
花粉
外源DNA
花粉管
子房
胚珠
一、将目的基因导入植物细胞
2.农杆菌转化法
(1)转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内
和 的过程。
维持稳定
表达
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，
实质都是 。
基因重组
(2)特点：
a.能在自然条件下侵染 .
和 ，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 .（ ）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的
上。
双子叶植物
裸子植物
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
染色体DNA
2.农杆菌转化法
(3)思路：
将目的基因插入Ti质粒的 中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
(4)具体转化方法：
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，
然后筛选转化细胞，并再生成植株。
②将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，
然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
T-DNA
2.农杆菌转化法
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
（5）过程
第三步：将目的基因导入受体细胞
二、将目的基因导入动物细胞
1.导入方法：
显微注射法
2.受体细胞:
受精卵
【思考】为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
①体积大，易操作;
②易表现出全能性。
二、将目的基因导入动物细胞
3.过程：
基因表达载体提纯
受精卵
胚胎
雌性动物的输卵管或子宫内
显微注射
新性状的动物
早期胚胎培养
胚胎移植
发育
第三步：将目的基因导入受体细胞
三、将目的基因导入微生物细胞
1.常用方法：
Ca2+处理
（思考：目的？）
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
（感受态）
2.受体细胞:
原核细胞
（常选择大肠杆菌）
（思考：优点？）
遗传物质相对较少，易于培养，繁殖快。
3.过程:
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收重组DNA
增加细胞壁的
通透性
一般利用温度变化导入
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
第四步：目的基因的检测与鉴定
一、检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
(1)方法:
DNA分子杂交
基因探针
简称 ，是一段带有 （同位素、荧光分子或化学发光催化剂），且 已知的，与 互补核酸序列(DNA或RNA)。
探针
顺序
目的基因
检测标记
(2)过程:
① 首先取出转基因生物的基因组DNA；
............TACGGTCATGTCGCATGCTAG............
............ATGCCAGTACAGCGTACGATC............
目的基因片段
基因探针
............GTACAGCGTA...........
放射性标记
杂交DNA分子
② 将含目的基因的DNA片段用
放射性同位素等作标记,以此做探针；
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出 ,表明目的基因已插入染色体DNA中。
杂交带
............TACGGTCATGTCGCATGCTAG............
目的基因片段
............GTACAGCGTA...........
基因探针
(3)技术:
PCR等技术
DNA变性、复性与分子杂交
(4)检测原理:
碱基互补配对原则
第四步：目的基因的检测与鉴定
二、检测目的基因是否转录出了mRNA
(1)方法:
分子杂交
(2)过程:
用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,
表明目的基因转录出了mRNA。
三、检测目的基因是否翻译成蛋白质
(1)方法:
抗原-抗体杂交
(2)过程:
苏云金杆菌
Bt毒素蛋白
抗体
脱分化
提取
蛋白质
出现
杂交带
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫
（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染
（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
二、个体水平的检测
【到社会中去】
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重
的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；
2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。
在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
【到社会中去】
2.科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
(1)基因策略:
该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。
例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
(2)田间策略:
这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。
例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；
在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。
我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。
这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。
这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
(3)国家宏观调控策略:
该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、 进行严格的安全生评价等。
【探究与实践】
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一.实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的_______原理，通过_________来控制DNA双链的 与 ，PCR仪实质上就是一台能够_______________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
②PCR扩增DNA片段还利用了_________________的原理；
热变性
调节温度
解聚
结合
自动调控温度
30
DNA半保留复制
一.实验原理
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_______________，在一定的___下，这些基团可以带上 或
，在______的作用下，这些_________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
正电荷
负电荷
电场
带电分子
与它所带电荷相反
电泳
②PCR的产物一般通过_________________来鉴定；
琼脂糖凝胶电泳
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________、________________和_____等有关
凝胶的浓度
DNA分子的大小
构象
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为_______的_______下被检测出来。
染色
300nm
紫外灯
二.材料用具
①PCR仪
（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管
（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器
（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头
（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置
（包括电泳仪、电泳槽等）
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
三.方法步骤
(一）DNA片段的扩增
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
1.移液：
用 按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在 中依次加入各组分
2.离心：
待所有组分都加入后， 离心管的盖子，将微量离心管放入 里，离心约10s，使反应液集中在离心管的 （提高反应速率）
3.反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性：
微量移液器
微量离心管
盖严
离心机
底部
(二）DNA片段的电泳鉴定
(二）DNA片段的电泳鉴定
1.配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
2.制备凝胶
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
3.加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
4.电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
5.观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
注意
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、
枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，
并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的
枪头都必须 。
4.在进行操作时，一定要 。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
高压灭菌
-20℃
更换
戴好一次性手套
结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？
如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
【习题训练】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
练习与应用
一、概念检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
(1)afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（ ）
(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（ ）
(3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ）
√
×
×
练习与应用
一、概念检测
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
D
练习与应用
二、拓展应用
1.外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。
例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
练习与应用
二、拓展应用
2.(1)crtⅠ基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
(2)不能。
如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，
限制酶可能将它切断。
（3）维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。 β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，便其胚乳中富含β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。
拓展：细胞的基因结构
*原核细胞的基因结构
DNA
基因
上游
下游
mRNA
转录
翻译
多肽链
RNA聚合酶
结合位点
非编码区
非编码区
编码区
拓展：细胞的基因结构
*真核细胞的基因结构
前体mRNA
下游
DNA
上游
RNA聚合酶
结合位点
非编码区
非编码区
编码区
转录
剪切
成熟mRNA
内含子（不能编码蛋白）
外显子（能编码蛋白）
多肽链
翻译
拼接