第三章 动物细胞工程
【动物细胞培养】
①动物细胞培养原理：
②动物细胞生长特点： 、 、
培养（摇床的 可以调节）
③动物细胞培养基：添加 、 糖；
添加 （确保无菌条件）
CO2培养箱（CO2调节PH——5%CO2+95% ）；
④动物细胞克隆—来源 —克隆后的细胞群是一个纯系， 均一、
一致、表现的性状相似。
⑤动物细胞扩大培养： 培养+ 培养（传代一次——细胞会分裂很多很多次）
⑥细胞系：
有限细胞系
连续细胞系：连续传代的细胞——包括良性细胞系（保留接触抑制）和恶性细胞系
恶性细胞系能无限增殖，具有 性，无 等特性
⑦细胞株一般具有恒定的 ，在连续传代中可能会发生 的改变，使遗传性状难以保持稳定
1个 细胞——经过 培养——细胞株（ 均一的细胞群）
⑧动物细胞悬液的制备： 酶—原因：动物细胞间存在胶原纤维（蛋白质）
⑨胚胎干细胞培养——添加动物血清+ 细胞（胚胎成纤维细胞：全能性高于体细胞）
【例】可以通过 培养获得特定细胞系以实现产物的工业化生产。
【例】当细胞发生贴壁和 现象时,加入胰酶可使其脱壁分散,处理一段时间后添加血清以 。
【例】科研人员通过 实现转基因矮牵牛中重要次生代谢产物的工业化生产。
【例】)含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞在体外培养,为提高克隆成功率,可向培养基中添
加血清和 (写2点),贴满瓶壁的细胞常用胰蛋白酶消化处理,以便进行
培养。
(5)将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞,在此之前,需要对猪胚胎成纤维细胞做特殊处理 ，以提高实验成功率。
【单克隆抗体的制备】
①最大优点： ，
②应用时具有的特点：
制备B淋巴细胞悬液——不用加 酶（因为淋巴细胞在体内悬浮生长）
过程： 淋巴细胞(选自小鼠 )+ 细胞
(经过毒性筛选，缺少DNA辅助途径的瘤细胞)
动物细胞融合技术（ ）
第一次筛选:利用 培养基（ 选择）
（瘤瘤、瘤B、BB、多细胞聚合体等细胞中）
A:氨基蝶呤：叶酸的拮抗剂，阻断瘤细胞合成DNA
细胞
第二次筛选： （需要进行 培养+ 检测（可多次检测））
产生 细胞
动物细胞培养技术（不加 ——成分复杂）或小鼠注入 （抽取腹水）体内培养
（小鼠需要注射 ：why？小鼠易于接纳杂交瘤细胞，避免 ）
体外培养法：将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞合成并分泌单克隆抗体，收集 ， 去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
单克隆抗体（效应B细胞分泌）
【例】人体内抗体种类繁多，且抗体基因在细胞内一般成簇存在。获取人抗体基因可从
细胞中提取出相应 为模板，利用 酶合成;或通过设计引物，利用 技术获得。
(6)途径一利用胚胎干细胞作为受体细胞，原因是胚胎干细胞具有 特点。为让抗体基因只在嵌合鼠乳汁中表达，可将抗体基因与小鼠乳清酸性蛋白基因的 部位结合，构建出乳腺特异性表达载体。
(7)途径二将小鼠抗体基因剔除的目的 ；获得的抗体比途径一的抗体具有 优点。
【胚胎工程】
受精（精卵识别依赖于细胞膜表面的特异性相互识别的 ）：
体内受精发生于
优良品种雌性（ 技术—— 激素）
（场所：
获得 细胞（培养到 期） 与 处理的精子（精子不能直接使用）
作用 受精卵
技术——不同胚胎发育阶段需要不同营养物质（目前无全体外胚胎培养技术）
早期胚胎（ 期）—— 技术（获得更多相同胚胎）
技术（一般不会引起免疫排斥反应）（是否添加免疫抑制剂）
一般品种的受体雌性（ 处理—— 激素）
妊娠——妊娠率和产仔率受代孕母体的影响
个体
妊娠率和产仔率影响因素？
【判断】内细胞团可以发育成成体的所有组织和器官？
（拓展）胚胎发育过程中，囊胚期开始分化形成 和滋养层
（拓展）试管动物涉及的技术？
（拓展）早期胚胎的来源？
【胚胎分割】
胚胎分割——切割
——切割时期：8细胞时期、囊胚期（受精卵、原肠胚不可切割）
——酶解法处理内细胞团—— 不能酶解法
【胚胎干细胞核移植】
胚胎干细胞—具有 性—取自
胚胎干细胞（ 仪）核移植到 细胞中（卵细胞细胞质中也有遗传物质），经过 、胚胎培养、胚胎移植——受体——克隆动物
【蛋白质工程】
根据蛋白质 —设计蛋白质的 ——推测其 序列——根据中心法则逆推基因的 序列——利用 技术改变DNA上特定位点的核苷酸序列——将改造的基因导入受体细胞表达
【生物工程】
干扰素—— 细胞均可以产生干扰素——间接杀死病毒
【例】“筛选”是生物学研究中常用的技术手段。下列叙述错误的是( )
A.单倍体育种中，需要通过表现型对单倍体植株进行筛选
B.利用农杆菌转化法培育转基因植物时，需要在重组质粒上设计不同的标记基因对农杆菌和植物细胞进行筛选
C.制备单克隆抗体时，第一次和第二次筛选的目的和原理都不同
D.用鉴别培养基和选择培养基对微生物进行筛选时，有时需要加入特定的化学物质
【例】为更好地研究新冠患者的病症及治疗办法,我国科学家成功研发了新冠病毒小鼠模型。已知新冠病毒通过识别人肺部细胞表面的受体(ACE2蛋白进个中日用易小鼠却并不含人的ACE2 基因。因此,科学家将 导人鼠的受精卵,经
后得到了转基因鼠接下来，可对转基因鼠进行 处
理,以观察其呈现的病症并测试药物的敏感性。第三章 动物细胞工程
【动物细胞培养】
①动物细胞培养原理：细胞增殖
②动物细胞生长特点：贴壁生长、存在接触抑制（离体）、
液体悬浮培养（摇床的转速和温度可以调节）
③动物细胞培养基：添加动物血清/鸡胚浸出液（天然成分）、葡萄糖；
添加抗生素（确保无菌条件）
CO2培养箱（CO2调节PH——5%CO2+95%空气）；
④动物细胞克隆：—来源单细胞—克隆后的细胞群是一个纯系，遗传性状均一、基因型一致、表现的性状相似。
⑤动物细胞扩大培养：原代培养+传代培养（传代一次——细胞会分裂很多很多次）
⑥细胞系：有限细胞系
连续细胞系：连续传代的细胞——包括良性细胞系（保留接触抑制）和恶性细胞系
恶性细胞系能无限增殖，具有不死性，无接触抑制等特性
⑦细胞株一般具有恒定的染色体组型，在连续传代中可能会发生遗传物质的改变，使遗传性状难以保持稳定 1个祖细胞——经过克隆培养——细胞株（遗传物质均一的细胞群）
⑧动物细胞悬液/单个动物细胞的制备：胰蛋白酶/胶原蛋白酶—动物细胞间存在胶原纤维（蛋白质）
⑨胚胎干细胞培养——添加动物血清+饲养层细胞（胚胎成纤维细胞：全能性高于体细胞）
【例】可以通过 液体悬浮培养/克隆 培养获得特定细胞系以实现产物的工业化生产。
【例】当细胞发生贴壁和接触抑制现象时,加入胰酶可使其脱壁分散,处理一段时间后添加血清以 终止酶解反应 。
【例】科研人员通过 大量培养特定的细胞系 实现转基因矮牵牛中重要次生代谢产物的工业化生产。
【例】)含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞在体外培养,为提高克隆成功率,可向培养基中添加血清和饲养层细胞、激素 (写2点),贴满瓶壁的细胞常用胰蛋白酶消化处理,以便进行 传代 培养。
(5)将含有“敲入”序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞,在此之前,需要对猪胚胎成纤维细胞做特殊处理 营养限制性培养 ,以提高实验成功率。
【单克隆抗体的制备】
①最大优点：纯度高、可大量制备，
②应用时具有的特点：特异性强、灵敏度高的
制备B淋巴细胞悬液——不用加胰蛋白酶（因为淋巴细胞在体内悬浮生长）
过程：B淋巴细胞(选自小鼠脾脏)+骨髓瘤细胞(经过毒性筛选，缺少DNA辅助途径的瘤细胞)
动物细胞融合技术（灭活的仙台病毒/聚乙二醇）
第一次筛选:利用HAT选择培养基（自然选择）（瘤瘤、瘤B、BB、多细胞聚合体等细胞中）
A:氨基蝶呤：叶酸的拮抗剂，阻断瘤细胞合成DNA
杂交瘤细胞
第二次筛选：抗原—抗体杂交（需要进行克隆化培养+抗体检测（可多次检测））
产生特定抗体的杂交瘤细胞
动物细胞培养技术（不加动物血清——成分复杂）或小鼠注入腹腔（抽取腹水）体内培养
（小鼠需要注射免疫抑制剂：why？小鼠易于接纳杂交瘤细胞，避免免疫排斥）
体外培养法：将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞合成并分泌单克隆抗体，收集上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
单克隆抗体（效应B细胞分泌）
【例】人体内抗体种类繁多，且抗体基因在细胞内一般成簇存在。获取人抗体基因可从效应B 细胞中提取出相应全部mRNA为模板，利用逆转录酶合成;或通过设计引物，利用PCR技术获得。
(6)途径一利用胚胎干细胞作为受体细胞，原因是胚胎干细胞具有发育的全能性特点。为让抗体基因只在嵌合鼠乳汁中表达，可将抗体基因与小鼠乳清酸性蛋白基因的启动子部位结合，构建出乳腺特异性表达载体。
(7)途径二将小鼠抗体基因剔除的目的小鼠自身的抗性基因不表达，只表达人的抗体是获得的抗体比途径一的抗体具有 特异性强、灵敏度高优点。
【胚胎工程】
受精（精卵识别依赖于细胞膜表面的特异性相互识别的糖蛋白）：体内受精发生于输卵管
优良品种雌性（超数排卵技术——促性腺激素）
（场所：输卵管、子宫角）
获得次级卵母细胞（培养到中期II） 与获能处理的精子（精子不能直接使用）
受精作用 受精卵
胚激活
胚胎体外培养技术—不同胚胎发育阶段需要不同营养物质（目前无全体外胚胎培养技术）
早期胚胎（囊胚期）——胚胎分割（获得更多相同胚胎）
胚胎移植技术（一般不会引起免疫排斥反应）场所：子宫
一般品种的受体雌性（同期发情处理——孕激素）
妊娠——妊娠率和产仔率受代孕母体的影响
个体
妊娠率和产仔率影响因素：代孕母体的发情特征明显、营养状况、激素水平、子宫内部的环境、疾病，胚胎移植时，胚胎要尽可能分散移植到两侧的输卵管或子宫角，使得胚胎均匀分布
【判断】内细胞团可以发育成成体的所有组织和器官？对
（拓展）胚胎发育过程中，囊胚期开始分化形成内细胞团和滋养层
试管动物涉及的技术：体外受精+胚胎体外培养+胚胎移植
（拓展）早期胚胎的来源
受精作用2.试管受精3.胚胎分割（切割针——切割囊胚期的内细胞团——酶解法：胰蛋白酶——但是不能对囊胚使用）
【胚胎分割】
胚胎分割——切割 囊胚期的内细胞团
——切割时期：8细胞时期、囊胚期（受精卵、原肠胚不可切割）
——酶解法处理内细胞团——囊胚不能酶解法
【胚胎干细胞核移植】
胚胎干细胞—具有发育的全能性—取自囊胚期的内细胞团
核移植：胚胎干细胞（显微操作仪）核移植到去核卵细胞中（卵细胞细胞质中也有遗传物质），经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植——受体——克隆动物
【蛋白质工程】
根据蛋白质功能—设计蛋白质的空间结构——推测其氨基酸序列——根据中心法则逆推基因的核苷酸序列——利用基因工程技术改变DNA上特定位点的核苷酸序列——将改造的基因导入受体细胞表达
【干扰素】
干扰素——大肠杆菌、酵母菌、白细胞、t淋巴细胞均可以产生干扰素——间接杀死病毒
【例】“筛选”是生物学研究中常用的技术手段。下列叙述错误的是( A )
A.单倍体育种中，需要通过表现型对单倍体植株进行筛选
B.利用农杆菌转化法培育转基因植物时，需要在重组质粒上设计不同的标记基因对农杆菌和植物细胞进行筛选
C.制备单克隆抗体时，第一次和第二次筛选的目的和原理都不同
D.用鉴别培养基和选择培养基对微生物进行筛选时，有时需要加入特定的化学物质
【例】为更好地研究新冠患者的病症及治疗办法,我国科学家成功研发了新冠病毒小鼠模型。已知新冠病毒通过识别人肺部细胞表面的受体(ACE2蛋白进个中日用易小鼠却并不含人的ACE2 基因。因此,科学家将 含人的ACE2 基因的重组DNA分子 导人鼠的受精卵,经 胚胎体外培养、胚胎移植 后得到了转基因鼠接下来可对转基因鼠进行 感染新冠病毒 处理,以观察其呈现的病症并测试药物的敏感性。
