生物人教版（2019）选择性必修3课件 2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体（共51张ppt）

(共51张PPT)
第二章 细胞工程
第2节 动物细胞工程
人教版·选择性必修3
（第二课时）
动物细胞融合技术与单克隆抗体
01
动物细胞融合技术
目录 /CONTENTS
运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。
从社会中来
有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同
细胞的优势于一身的动物细胞呢？
马的动物细胞A
天鹅的动物细胞B
飞马？
需要什么技术？
从社会中来
资料： 1970年，科学家用发绿色荧光的染料标记小鼠细胞表面的蛋白质分子，用发红色荧光的染料标记人细胞表面的蛋白质分子，将小鼠细胞和人细胞融合。这两种细胞刚融合时，融合细胞的一半发绿色荧光，另一半发红色荧光。在37℃下经过40min，两种颜色的荧光均匀分布。
小鼠细胞
人细胞
细胞融合
37℃,40min
正常融合的细胞
融合细胞
红色荧光染料标记的膜蛋白
绿色荧光染料标记的膜蛋白
荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验示意图
动物细胞融合技术培养
一
请同学们快速阅读课本P48页回答以下问题
1. 什么是动物细胞融合技术（概念）？原理是什么？
2. 所形成的杂种细胞有什么特点？
3. 诱导动物细胞融合的方法有哪些？
4. 动物细胞融合技术的意义和应用有哪些？
动物细胞融合技术培养
一
1. 动物细胞融合技术
① 概念：
指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
细胞膜具有一定的流动性。
物理法：
化学法：
生物法：
② 原理：
③ 诱导方式
电融合法
聚乙二醇（PEG）融合法
灭活病毒诱导法
④ 过程：
病毒颗粒
灭活的病毒颗粒粘附于细胞表面，使细胞互相凝聚
细胞膜融合
细胞核融合
形成杂交细胞
细胞膜
打开
细胞质融合
动物细胞融合特有的诱导融合方法
动物细胞融合技术培养
一
3、为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？
①灭活的病毒失去感染性。
②灭活的病毒其表面的糖蛋白结构没有被破坏，能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
1、什么是病毒的灭活？
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去 ，但并不破坏病毒的 。
病毒的糖蛋白和一些酶可以与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞膜的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
思考·讨论：
2、灭活病毒诱导细胞融合的原理是？
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性（不感染细胞）
保留融合活性（诱导细胞融合）
感染能力
抗原结构
动物细胞融合技术培养
一
【问题探究2】19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中，观察到多核细胞。如何解释这一现象？
肺结核病人病理切片
病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
动物细胞融合技术培养
一
⑤ 结果：
突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。
⑥ 意义：
形成 核的杂交细胞。即融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。
融合完成的标志：
细胞核的融合
单
至今，种间、属间、科间，甚至动植物之间融合都已获得了成功。
生物种类 细胞来源 成功年代
酵母菌—鸡 原生质体—血红细胞 1975年
人—胡萝卜 腹水癌细胞—原生质体 1976年
人—小鼠 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞 1978年
动物细胞融合技术培养
一
1. 动物细胞融合技术
⑤ 结果：
⑥ 意义：
⑦ 应用：
研究细胞 、细胞 、 和培育生物 等的重要手段，特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤细胞技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。
遗传
免疫
肿瘤
新品种
动物细胞融合技术培养
一
动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较
比较 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
步骤 酶解法去掉 后，诱导 融合，形成 ，再经植物组织培养形成 。 分散成 后诱导细胞融合，形成 。
方法 聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2＋—高pH融合法、电融合法、离心法 PEG融合法、电融合法、
诱导法
结果 形成？ 形成 ，以生产细胞产品
意义 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种 突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
细胞膜的流动性
细胞的全能性
细胞膜的流动性
细胞壁
原生质体
杂种细胞
杂种植株
单个细胞
杂交细胞
灭活病毒
杂种植株
杂交细胞
动物细胞融合技术培养
一
（1）与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒 （　 　）
（2）灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构 （　　 ）
（3）二倍体动物细胞融合后的杂交细胞仍然是二倍体细胞 （　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
01
动物细胞融合技术
目录 /CONTENTS
从社会中来
思考·讨论：
1.视频中了解到针对新冠肺炎真正的特效药是什么？
2.这种特效药有着怎样的特点呢？
针对新冠病毒的单克隆抗体。
这种单克隆抗体可以和新冠病毒特异性结合，准确定位、药效强、持续时间久，并且可以大量储备生产。
什么细胞能产生抗体？
能产生抗体的细胞能否大量无限增殖？
什么细胞具有无限增殖的能力？
能否培养出一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞？
要制备单克隆抗体，就需要找到一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞。
单克隆抗体及其应用
二
病原体
（如流感病毒）
B细胞
抗原呈递细胞
辅助性T细胞
B细胞
记忆B细胞
浆细胞
抗体
1
一些病原体可以和B细胞接触，这为激活B细胞提供了第一个信号。
1
抗原呈递细胞将抗原处理后呈递在细胞表面，然后传递给辅助性T细胞。
3
一些病原体被树突状细胞、B细胞等抗原呈递细胞摄取。
2
2
3
4
5
6
辅助性T细胞表面的特定分子发生变化并与B细胞结合，这是激活B细胞的第二个信号；辅助性T细胞开始分裂、分化，并分泌细胞因子。
4
单克隆抗体及其应用
二
病原体
（如流感病毒）
B细胞
抗原呈递细胞
辅助性T细胞
B细胞
记忆B细胞
浆细胞
抗体
1
B细胞受到两个信号的刺激后开始分裂、分化，大部分分化为浆细胞，小部分分化为记忆B细胞。细胞因子能促进B细胞的分裂、分化过程。
5
2
3
4
5
6
浆细胞产生和分泌大量抗体，抗体可以随体液在全身循坏并与这种病原体结合。抗体与病原体的结合可以抑制病原体的增殖或对人体细胞的黏附。
6
单克隆抗体及其应用
二
1.传统抗体的获得方法
（1）分泌细胞: 化学本质:
分布？
浆细胞
蛋白质
主要分布在 中，少量分布于组织液和外分泌液中
（2） 获取方法：
向动物体内 注射某种 ，使动物产生抗体，然后从动物 中分离所需抗体。
血清抗体
反复
抗原
血清
血清
单克隆抗体及其应用
二
不能无限增殖产生大量抗体
动物体内
抗原
刺激
浆细胞
抗体
筛选单一B细胞
增殖分化
抗原不纯
抗体不纯
产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。
缺陷：
抗原
免疫
传统抗血清
所有抗体混合
（3）缺点：
回顾旧知：抗体的产生
单克隆抗体及其应用
二
2．单克隆抗体的制备思路
（1）B淋巴细胞特点：
①哺乳动物感染病原体后，体内会形成效应B细胞，这些细胞能分泌抗体，抗体识别并特异性结合病原体，从而抑制病原体的增殖等。
实质是浆细胞
②动物体内产生的特异性抗体种类超过百万种，但每一个B淋巴细胞只分泌 特异性抗体。
③要想获得大量单一抗体，
④面临困难：在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。
如何解决这一难题？
一种
必须 单一的B淋巴细胞，形成细胞群。
克隆（大量增殖）
单克隆抗体及其应用
二
（2）骨髓瘤细胞特点：
在体外培养条件下，能大量增殖。
英国：米尔斯坦
德国：科勒
由于发明了单克隆抗体的制备技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
大胆设想
一种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
（能产生抗体）
（能大量增殖）
融合细胞
（既能产生抗体，又能大量增殖）
（3）杂交瘤细胞特点：
B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。
单克隆抗体：由单个B淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成基因型相同的细胞群，由这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
单克隆抗体及其应用
二
3．单克隆抗体的制备过程
注射特定的抗原进行免疫
培养骨髓瘤细胞
从脾中提取
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
能产生抗体，但不能大量增殖
不能产生抗体，但能大量增殖
单克隆抗体及其应用
二
【问题探究】过程分析
①不注射抗原，直接提取B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，能得到单克隆抗体吗？给小鼠注射特定抗原的目的是什么？
②诱导细胞融合的方法:
能从该小鼠的脾中得到可以产生特定抗体的B淋巴细胞。
不能
实质是浆细胞
物理方法：
电融合法
化学方法：
聚乙二醇（PEG）融合法
特有生物方法：
灭活病毒诱导法
单克隆抗体及其应用
二
将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合
多种杂交细胞
③若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？
B-B细胞
B-瘤细胞
瘤-瘤细胞
3种
杂交瘤细胞
【延伸】若只考虑细胞的两两融合，培养液中共会出现几种细胞？
5种
融合的细胞3种
未融合的细胞2种
诱导融合
单克隆抗体及其应用
二
多种杂交细胞
第一次筛选
用特定的 培养基
在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长
杂交瘤细胞
（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）
单克隆抗体及其应用
二
选择
知识拓展：第一次筛选获得杂交瘤细胞。
资料：已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖，死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能合成DNA，死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖，生长
培养基中加入
氨基喋呤
B淋巴细胞
合成DNA
S途径
D途径
不能分裂增殖
骨髓瘤细胞
合成DNA
D途径
能无限增殖
任务：请根据以上信息，设计一种方法，从培养液中筛选出杂交瘤细胞。
单克隆抗体及其应用
二
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖
又能产生抗体
第二次筛选
克隆化培养、抗体检测
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
（分泌的抗体能与特定抗原结合）
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
经多次筛选
单克隆抗体及其应用
二
96孔板培养和筛选
阳性孔
抗体检测的方法——抗原 — 抗体杂交法
在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。
将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养 （克隆化培养）
一段时间后，检测各孔
上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原
结合的培养孔为阳性孔
多孔细胞培养板
抗体检测板
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
阳性孔中的细胞还 保证是来自单个细胞，挑选
孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
不能
阳性
检测原理：
抗原—抗体杂交技术
单克隆抗体及其应用
二
多孔细胞培养板
阳性克隆的筛选和克隆化培养
用培养液有限稀释
克隆化培养抗体检测
单克隆抗体及其应用
二
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
能产生所需抗体的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔内
体外培养
单克隆抗体
从细胞培养液中提取
从小鼠腹水中提取
体内培养
★杂交瘤细胞的特点:
Ⅰ 既能无限增殖，又能分泌特异性抗体
Ⅱ 具备两种细胞的遗传物质
特异性强，灵敏度高，可大量制备
单克隆抗体及其应用
二
4.单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较
项目 第一次筛选 第二次筛选
筛选 原因 诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等 由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选 目的 筛选出？ 筛选出 的杂交瘤细胞
筛选 方法 用特定的选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会 ，只有融合的杂交瘤细胞才能 。 用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和 ，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞
能分泌所需抗体
死亡
抗体检测
生长
单克隆抗体及其应用
二
诱导其融合的方法有哪些？
注射特定抗原的目的是什么？
大量增殖杂交瘤细胞获得单克隆抗体的方法
两次筛选的目的
获得能产生特定抗体的B淋巴细胞
物理：电融合法
第1次筛选：得到杂交瘤细胞（多种）。
体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。
多种B淋巴细胞
B淋巴细胞
注射特定抗原
骨髓瘤细胞
融合
B-B细胞
杂交瘤细胞
瘤-瘤细胞
多种杂交瘤细胞
符合要求的杂交瘤细胞
抗原—抗体杂交法
筛选2
克隆化培养
体外培养
小鼠腹腔内增殖
单克隆抗体
B细胞
瘤细胞
选择培养基
筛选1
化学：聚乙二醇 （PEG）融合法
生物：灭活病毒诱导法
第2次筛选：得到能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
小结
单克隆抗体制备过程中应用到的细胞工程技术手段
杂交瘤细胞特点
单克隆抗体的优点
原理
既可以产生抗体，又可以大量增殖
动物细胞融合、
动物细胞培养
细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖
多种B淋巴细胞
B淋巴细胞
注射特定抗原
骨髓瘤细胞
融合
B-B细胞
杂交瘤细胞
瘤-瘤细胞
选择性培养基
多种杂交瘤细胞
符合要求的杂交瘤细胞
抗原—抗体杂交法
筛选2
克隆化培养
体外培养
小鼠腹腔内增殖
单克隆抗体
B细胞
瘤细胞
筛选1
① 能准确地识别抗原的细微差异。
② 与特定抗原发生特异性结合。
③ 可以大量制备。
小结
20世纪90年代初，英国科学家成功地利用“生物导弹”单克隆抗体瞄准并杀死了癌细胞，使患血癌的一名67岁退休教授与一名女患者的癌细胞奇迹般消失了。被称为“生物导弹”的单克隆抗体，能够跟踪和杀死细菌、病毒或癌细胞。
创设情境
从社会中来
资料1：用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的方法提前了10d左右。可以避免孕妇在知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成了不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
思考·讨论：单克隆抗体的应用
单克隆抗体及其应用
二
思考·讨论：单克隆抗体的应用
资料2：使用高效的细胞毒素类药物进行化疗，可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（antibody-drug conjugates，ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。
单克隆抗体及其应用
二
抗体
药物
接头
ADC被细胞吞噬
释放药物
溶酶体裂解
细胞凋亡
1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？
抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。
2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。也可以与一些作用于细胞信号转导通路的药物结合，可阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长。
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识別的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
思考·讨论：单克隆抗体的应用
单克隆抗体及其应用
二
优点：准确、高效、简易、快速。
5. 单克隆抗体的应用
① 作为诊断试剂——最广泛应用
② 用于治疗疾病和运载药物
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
a、特异性强、灵敏度高，可以大量制备。
生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物+放射性同位素
b、位置准确、疗效高、毒副作用小。
艾滋病检测试剂
结合同位素的单抗
治疗B细胞淋巴瘤
单克隆抗体及其应用
二
5．单克隆抗体的优点
（1）能准确地识别抗原的 ；
（2）与特定抗原发生 结合；
（3）可以 制备。
6．单克隆抗体的应用
（1）广泛用作 。
利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
乙肝测定试剂
艾滋病检测试剂
单克隆抗体及其应用
二
细微差异
特异性
大量
诊断试剂
（2）运载药物：
如抗体-药物偶联物（ADC ）。
生物导弹=单克隆抗体+药物，治疗肿瘤
(单抗导向，药物为弹头)
优点：位置准确、疗效高、副作用小
（3）直接用于治疗疾病。
实例：利妥昔单抗(美罗华)是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体，是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应，抑制细胞生长，改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。
在医学领域，单克隆抗体药物占有非常重要的地位。
单克隆抗体及其应用
二
课堂小结
（1）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞（　 　）
（2）单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同（ 　　）
（3）ADC的抗体具靶向运输作用、药物具有治疗作用（　 　）
判断常考语句，澄清易混易错
一、概念检测
1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是 （ ）
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株
C
练习与应用
2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒
B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为
杂交瘤细胞
D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离
出的抗体为单克隆抗体
A
练习与应用
3．如图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述正确的是 （ ）
A．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的细胞毒性T细胞
B．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成
C．③同时具有脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞的特性
D．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞
D
练习与应用
4．抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列表述正确的是 （ ）
A．ADC可通过主动运输进入肿瘤细胞
B．抗体进入细胞后激活溶酶体酶，导致细胞凋亡
C．单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合
D．肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，所以不会产生新的蛋白质
C
练习与应用
【概念检测】
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）
A. 它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B. 都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C. 融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D. 前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株
教材P51
C
练习与应用
【概念检测】
2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
教材P51
A
练习与应用
【扩展应用】
2. 假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。
练习与应用
教材P51
可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，日前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来些伦理方面的问题。
练习与应用
结束语