3.2 基因工程的基本操作程序（第一课时）（人教版2019选择性必修3）课件(共53张PPT)

(共53张PPT)
第3章 第2节
人教版 选择性必修3
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
苏-基因1
苏-基因2
苏-基因3
苏-基因4
Bt基因
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
棉-基因1
棉-基因2
棉-基因3
棉-基因4
棉花细胞DNA片段中的部分基因
“分子手术刀”
“分子缝合针”
实际操作和这一样都在体外进行吗？
首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；
然后，将重组DNA分子导入棉花体细胞内，并使其在细胞中表达。
体外
导入
载体
棉花细胞的DNA不进行切割
DNA连接酶
重组DNA
限制酶
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
相关信息
1.目的基因的筛选和获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
第二步：基因表达载体的构建
二/
第一步：目的基因的筛选与获取
一/
目录
CONTENTS
第三步：将目的基因导入受体细胞
三/
第四步：目的基因的检测与鉴定
四/
DNA 片段的扩增及电泳鉴定
五/
01
第一步：目的基因的筛选与获取
一
第一步：目的基因的筛选与获取
目的基因：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或
获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
主要是指编码蛋白质的基因
注意：不是所有的基因都编码蛋白质或肽链。
（了解）
基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。
结构基因的功能：
具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。
转录基因的功能：
只有转录功能，没有翻译功能。能转录形成tRNA和rRNA
调控基因的功能：
不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。
一
第一步：目的基因的筛选与获取
目的基因：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或
获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
主要是指编码蛋白质的基因
注意：不是所有的基因都编码蛋白质或肽链。
（了解）
基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。
结构基因的功能：
具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。
转录基因的功能：
只有转录功能，没有翻译功能。能转录形成tRNA和rRNA
调控基因的功能：
不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。
如：Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因
Bt抗虫蛋白
使棉花抗虫
转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒
转基因抗除草剂植物
一
第一步：目的基因的筛选与获取
目的基因：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或
获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
主要是指编码蛋白质的基因
如：Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因
Bt抗虫蛋白
使棉花抗虫
转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒
转基因抗除草剂植物
……
抗逆性
毒物降解
转基因芥属能多吸收土壤中5.3倍的有毒金属硒，而自身却不会死亡
一
第一步：目的基因的筛选与获取
目的基因：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或
获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
主要是指编码蛋白质的基因
使棉花抗虫
转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒
转基因抗除草剂植物
……
抗逆性
毒物降解
转基因芥属能多吸收土壤中5.3倍的有毒金属硒，而自身却不会死亡
生产药物
重组人胰岛素注射液
工业用酶
那么，如何筛选目的基因呢？
如：现在需要选择一种抗虫基因，该如何筛选？
Bt毒蛋白基因是从苏云金芽孢杆菌中分离出来的抗虫基因。当害虫食用含有转基因的植物时，Bt基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道，在消化酶的作用下，蛋白质能够降解成相对分子质量比解，最后造成害虫死亡。由于Bt毒蛋白对哺乳动物无毒害作用，因而广泛用于抗虫转基因植物。
蛋白酶抑制剂基因广泛存在于植物中它生的抑制剂可与害虫消化道中的蛋白酶结合形复合物，从而阻断或降低蛋白酶的活性，使昆虫不能正常摄取、消化食物中的蛋白质。这种复合物还能刺激昆虫分泌过量的消化酶，引起害虫的厌食反应。
淀粉酶抑制剂基因产生的粉酶抑制剂可以抑制昆虫消化道中的淀粉酶活性,使害虫不能消化所摄取的淀粉，从而阻断害虫的能量来源。
植物凝集素基因控制植物合成一种糖蛋白糖蛋白可与昆虫肠道黏膜上的某种物质结而影响害虫对营养物质的吸收和利用。
资料卡：可用于转基因植物的抗虫基因
如何选择？
一
第一步：目的基因的筛选与获取
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
P27
1.3发酵工程及其应用
在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。
——筛选
一
第一步：目的基因的筛选与获取
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
P27
1.3发酵工程及其应用
在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。
研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关。科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物 — Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。因此，Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。
还有没有其他筛选方法？
——筛选
——筛选
一
第一步：目的基因的筛选与获取
DNA测序
序列数据库
（如GenBank）
序列比对工具
（如BLAST）
BLAST全称Basic Local Alignment Search Tool，即“基于局部比对算法的搜索工具”，是生物信息学常用的工具软件，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系。
序列数据库是分子生物信息数据库中最基本的数据库，包括核酸和蛋白质两类，以核苷酸碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容，并附有注释信息。
明确了目的基因后，该怎么获得它呢？
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
获取目的基因的常用方法有：
人工合成
从基因文库中获取
利用PCR获取和扩增目的基因
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
2.从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（了解）
基因文库
基因组文库
cDNA文库
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
基因组文库
2.从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（了解）
基因文库
cDNA文库
将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。
该受体菌群为基因组文库
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
cDNA文库
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。
某种生物体内的全部DNA
某个时期
基因选择性表达
转录
转录
转录
转录
mRNA
翻译
翻译
翻译
翻译
蛋白质
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
某原核细胞基因
非编码区
非编码区
编码区
不编码mRNA
不编码mRNA
(编码mRNA)
启动子
终止子
启动子：启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列
终止子：给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列
RNA聚合酶
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
启动子：启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列
终止子：给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
某原核细胞基因
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
如果该基因为真核细胞基因有什么不同？
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
某真核细胞基因
非编码区
非编码区
编码区
不编码mRNA
不编码mRNA
(编码mRNA)
启动子
终止子
RNA聚合酶
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
外显子：编码蛋白质的序列称为外显子
内含子：外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
初始mRNA
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
外显子：编码蛋白质的序列称为外显子
内含子：外显子之间不能编码蛋白质的序列称为内含子
外显子和内含子均会被转录成RNA，再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程，形成可以直接用于翻译的mRNA
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
外显子和内含子均会被转录成RNA，再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程，形成可以直接用于翻译的mRNA
初始mRNA
成熟mRNA
cDNA文库
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
反转录
GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC
CA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG ……
GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC ……
cDNA
复制
双链DNA
受体菌
无启动子、终止子等非编码区
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
初始mRNA
成熟mRNA
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
初始mRNA
成熟mRNA
反转录
GT …… ATCCTAGGTCTAC
GT …… ATCCTAGGTCTAC
CA …… TAGGATCCAGATG
复制
受体菌
无启动子、终止子等非编码区及无内含子
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）
基因多少
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
2.从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（了解）
基因组文库
cDNA文库
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？
某种生物体内的全部DNA
转录
转录
转录
转录
mRNA
反转录
反转录
反转录
反转录
cDNA
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
2.从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（了解）
基因组文库
cDNA文库
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
2.从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（了解）
基因组文库
cDNA文库
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？
这还是一件比较复杂的事情，简单地说就是根据目的基因的有关信息，例如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA 以及基因翻译产物蛋白质等特性来获取目的基因。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
（常用方法）
从 DNA 文库中获取并扩增目的基因通常采用PCR
PCR
（polymerase chain reaction）
聚合酶
链
反应
聚合酶链式反应
是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
DNA半保留复制。
体外（PCR扩增仪/PCR仪）。
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
可以在短时间内大量扩增目的基因。
原理：
操作环境：
目的：
优点：
模拟体内DNA复制过程
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
参与的组分 在DNA复制中的作用
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
体内DNA复制所需的基本条件
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
体外复制怎么改进？
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
参与的组分 在DNA复制中的作用
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
体内DNA复制所需的基本条件
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
体外复制怎么改进？
体外用高温代替
体外需用耐高温的DNA聚合酶
引 物 是 一 小 段 能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20 30个核苷酸。
体外复制的引物一般为DNA单链。
复制的原料实为dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同时水解产生能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。
微量离心管
缓冲液
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg 2+ 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg 2+ 。
DNA模板
四种脱氧核苷酸(dNTP)
引物
分别与两条模板链结合的2种引物
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
微量离心管
缓冲液
离心处理后
缓冲液
缓冲液
非目标DNA数目
目标DNA数目
循环次数
1
2
3
4
5
6
7
2
4
6
8
10
12
14
0
0
2
8
22
52
114
非目标DNA数目
目标DNA数目
循环次数
1
2
0
2
4
0
3
6
2
4
8
8
5
10
22
6
12
52
7
14
114
n
2n
2n-2n
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
3.利用PCR获取和扩增目的基因
a、变性（超过90℃）：双链DNA模板在热作用下， 断裂，形成 。
b、复性（下降到50℃）：系统温度降低，引物与DNA模板通过碱基互补配对，形成局部 。
c、延伸（上升到72℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，溶液中的的 在 的作用下，根据碱基互补配对原则，合成与模板互补的 的新的DNA链。
氢键
单链DNA
双链
4种脱氧核苷酸
5′端→3′端
耐高温的DNA聚合酶
过程：
指数
2n
可采用 来鉴定PCR的产物。
琼脂糖凝胶电泳
3.利用PCR获取和扩增目的基因
反应的结果：
以_______方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）
目标DNA为：
2n-2n
产物鉴定：
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
获取目的基因的常用方法有：
人工合成
从基因文库中获取
利用PCR获取和扩增目的基因