生物人教版（2019）选择性必修3 3.2基因工程的基本操作程序（共33张ppt）
文档属性
| 名称 | 生物人教版（2019）选择性必修3 3.2基因工程的基本操作程序（共33张ppt） |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 21.2MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-05-25 08:32:16 | ||
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文档简介
(共33张PPT)
第3章 基因工程问题探讨
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
讨论：
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因”转移到棉花细胞，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
苏云金杆菌内获得Bt抗虫蛋白基因
与载体结合
转入棉花细胞内
检查转基因抗虫棉是否培育成功
将转化成功的细胞进行组织培养，获得转基因抗虫植株
新课讲解
基因工程的基本操作主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞(转化)、目的基因的检测与鉴定。
新课讲解
一、目的基因的筛选与获取
(一）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指能够编码(特定)蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。如：培育抗虫棉所用的抗虫基因就是目的基因。
(二)筛选合适的目的基因：
1.筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
2.实例：
新课讲解
▼相关信息：
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理：
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
1.从基因文库中获取目的基因：
2.利用PCR技术扩增目的基因：
3.通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成目的基因。
获取目的基因常用的方法
新课讲解
(三)利用PCR获取和扩增目的基因
1.PCR含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR是聚合酶链式反应的缩写。
2.目的：获取和扩增目的基因。
3.原理：利用DNA半保留复制。
4.前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
5.过程：PCR扩增目的基因包括多轮循环，每一轮包括：变性、复性和延伸三步。
第1步：变性：加热至90～95℃，DNA解链为单链。
第2步：复性：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链。
第3步：延伸：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。
以上三步不断循环。
▲上述过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
3/
5/
A—G
C—C
第1步：变性：加热至90～95℃，DNA解链为单链。[其中预变性为5min，最后一次变性为1min，其他为30s]
第2步：复性：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链。[时间为30s]
第3步：延伸：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。[时间为1min]
以上三步不断循环(大概30次)。
新课讲解
(三)利用PCR获取和扩增目的基因
观看视频
5/
3/
G—G
T—C
变性
复性(退火)
延伸
5/
3/
A—G
引物Ⅰ
G—G
引物Ⅱ
新课讲解
▼引物：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
细胞内DNA复制是RNA引物，而PCR中是DNA引物。
▼热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)：耐热，热稳定性较高，其催化作用的最适温度是70～75℃。
6.利用PCR技术扩增目的基因的条件
(1)原料：4种脱氧核苷酸。
(2)热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)：催化DNA子链的延伸。
(3)模板：含有目的基因的DNA的两条单链。
(4)引物：DNA引物(过量)。
(5)添加有Mg2+的缓冲液： Mg2+用于激活DNA聚合酶。缓冲液提供扩增反应所需的适宜PH。
(6)温度控制。
耐高温的DNA聚合酶
引物
四种脱氧核苷酸
DNA模板
知识回顾
细胞内参与DNA复制的各种组成分的作用
条件 组分 作用
模板 DNA的两条单链 提供复制的模板
原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
酶 解旋酶 DNA聚合酶等 打开DNA双螺旋
催化合成DNA子链
能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能
引物 RNA引物 为DNA聚合酶提供合成的3′端起点
知识整合
细胞内DNA复制 PCR
不同点 解旋 在解旋酶作用下边解旋边复制 80~100℃高温解旋，双链完全解开
酶 DNA解旋酶； DNA聚合酶。 热稳定性DNA聚合酶（Taq聚合酶）
引物 RNA引物 DNA引物
温度 细胞内温和条件 体外高温条件
过程
相同点 ①需要模板、能量、酶； ②需要四种脱氧核苷酸作原料； ③子链延伸的方向都是从5′端向3′端 ④都遵循碱基互补配对。 细胞内DNA复制与PCR技术的比较
观察思考
1、n代后，DNA分子有_____个。
2、n代后，DNA链有_____条。
3、第____代开始符合要求的目的基因。
4、n代后，含引物的DNA分子有_____个。
5、n代后，共消耗__________个引物。
6、第n代复制，消耗了______个引物。
7、n代后，完整的目的基因有________个。
2n
2n+1
3
2n
2n+1-2
2n
2n-2n
观看动画
拓展应用
“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图乙所示：
1.第⑤种DNA分子有_____个
2.第①②种DNA分子有_____个
3.第③④种DNA分子有_____个
8
2
6
新课讲解
二、基因表达载体的构建
(一)基因表达载体的作用：
1.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并能(通过复制)遗传给下一代。
2.使目的基因能够受体细胞中表达和发挥作用。
重组载体的构建是基因工程的核心，其目的是把目的基因和载体组合成一个新的DNA分子，以便将目的基因送进受体细胞。
(二)基因表达载体的组成：
(1)目的基因
(2)启动子
(3)终止子
(4)标记基因
(5)复制原点
新课讲解
(1)启动子：一段特殊的DNA片段，位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。
(2)终止子：一段特殊的DNA片段，位于目的基因的尾端，使转录终止。
启动子和终止子是目的基因表达所必需的。
(3)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
标记基因的作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，筛选含有目的基因的受体细胞。
(4)复制原点：解旋酶和DNA聚合酶结合位点，是DNA复制所必需的。
新课讲解
(三)构建基因表达载体过程：
1.先用一定的限制酶去切割载体(质粒)，使它出现一个切口，露出末端。
2.然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切断含目的基因的DNA，使二者产生相同(或互补)的末端；
3.将切下的目的基因的片段插入载体的切口处，再加入适量的DNA连接酶；
4.二者的(黏性末端)因碱基互补配对而结合，再加上DNA的连接酶的作用，而结合成重组DNA分子——重组质粒。
难点突破
1.对载体质粒和含目的基因的DNA的切割一般用同一种限制酶，为形成相同的黏性末端。
如果是用不同的限制酶，但必须要形成相同的(或互补的)黏性末端。
——限制酶种类的选择：
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
难点突破
2.构建基因表达载体时，对载体质粒和含目的基因的DNA一般采用用双酶切，而不用单酶切。
因为这样可实现目的基因与载体发生定向连接，可防止它们之间的反向连接，还可防止目的基因和载体DNA的自身环化。
(2)若要将图甲中的抗病基因与图乙中的质料构成重组质粒，应选用图中哪种限制酶？为什么？
提示：Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接。
3.目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
4.基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
新课讲解
三、将目的基因导入受体细胞
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的受体细胞：
微生物细胞（如大肠杆菌、酵母菌）；
植物细胞；
动物细胞（主要是动物的受精卵）。
3.将目的基因导入植物细胞(即转化植物细胞)的方法：
(1)农杆菌转化法：最常用。适用于双子叶植物和裸子植物，一般不适用于单子叶植物。
(2)花粉管通道法：我国科学家独创。
(3)基因枪法：常用于单子叶植物。
新课讲解
(1)基因枪法：将目的基因吸附在微小的金粒或钨粒表面，然后将微粒用基因枪高速射入受体细胞或组织。该法已广泛应用于被子植物的基因导入。
(2)花粉管通道法：主要有两种做法：一是先将目的基因导入花粉，再通过受精获得导入基因的植株。二是在植物自花授粉后，将目的基因滴在剪开的柱头上，使其沿着花粉管进入胚囊，完成基因导入。目前，后一种方法已在水稻、棉花等农作物上获得了成功。
新课讲解
(3)农杆菌转化法：将目的基因导入植物细胞最常用的方法。 (用于双子叶植物)。
▼农杆菌的特点：
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的DNA上。
新课讲解
农杆菌转化步骤：
新课讲解
4.将目的基因导入动物细胞(转化动物细胞)的方法——显微注射法。
(1)显微注射法。借助光学显微镜的放大作用，利用一种极细的注射器直接将目的基因注射到细胞(一般是受精卵)中。利用这种方法已生产出了鼠、兔、羊、猪、牛等转基因动物。
(2)基本操作程序：目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵→移植到雌性动物的输卵管或子宫内→发育成具有新性状的动物。
新课讲解
5.将目的基因导入微生物细胞(转化微生物细胞)——感受态细胞法：
原核细胞适于做受体细胞的原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少。
导入方法：感受态细胞法(或叫Ca2+处理法)。
转化的步骤：
①用CaCl2溶液处理大肠杆菌，增大其细胞壁及细胞膜的通透性，使其处于感受态(易吸收周围环境中DNA分子的生理状态)；
②重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
新课讲解
四、目的基因的检测与鉴定
1.检测转基因生物(受体) 的染色体DNA上是否插入了目的基因：
(一)分子水平的检测：
常用方法：(1)DNA分子杂交：观察是否出现杂交带。如果出现杂交带说明目的基因已插入到受体细胞DNA上。
(2)PCR技术。根据目的基因的碱基序列设计特异性引物，进行PCR扩增，如果能扩增出目的基因，说明目的基因已插入到受体细胞DNA上。
新课讲解
2.转录检测——即目的基因是否转录出了相应的mRNA。
方法：(1)分子杂交法，用于检测目的基因转录的mRNA。若出现杂交带说明目的转录成功。
(2)PCR技术。提取受体生物的mRNA，进行逆转录获取cDNA，再利用目的基因特异性引物，进行PCR扩增，如果能扩增出目的基因，说明目的基因转录成功。
3.翻译检测——检测目的基因是否翻译成蛋白质：
方法：抗原—抗体杂交。若出现杂交带，说明目的基因已翻译成功。
(二)个体生物学水平上的鉴定：
检测转基因生物是否表现出目的基因所控制的性状。如抗虫或抗病的鉴定等。
(1)抗虫或抗病的接种实验。
(2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较。
例如，对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄，需要先通过栽培获得果实后，再与天然产品比较，确定其是否具有了抗冻性状。
知识整合
检测过程 检测对象 方法原理 现象结论
目的基因是否整合到受体生物的DNA上 目的基因 DNA分子杂交法或PCR技术 出现杂交带，说明已整合或经鉴定PCR能扩增出目的基因
目的基因是否转录 mRNA或目的基因 分子杂交法 或PCR技术 出现杂交带，说明转录或经鉴定PCR能扩增出相应的产物
目的基因是否翻译 蛋白质 抗原-抗体杂交 出现杂交带，说明已翻译
个体水平检测 包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同 目的基因的检测与鉴定——分子水平上的鉴定及方法
知识整合
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物 饲喂害虫(抗虫接种实验) 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染(抗病接种实验) 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌或种植于盐碱地中 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常
个体生物学水平的鉴定
课堂训练
1.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是（ ）
A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性
B.有利于对目的基因是否导入进行检测
C.增加质粒分子的分子量
D.便于与外源基因连接
B
2.哪项不是基因表达载体的组成部分（ ）
A.启动子 B.终止密码
C.标记基因 D.目的基因
3.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法（ ）
A.基因枪法 B.显微注射法
C.农杆菌转化法 D.花粉管通道法
B
B
4.利用细菌大量生产人类干扰素，下列叙述错误的是（ ）
A.用适当的酶对运载体与人类干扰素基因进行切割与黏合
B.用适当的化学物质处理受体细菌表面，将重组DNA导入受体细菌
C.通常通过检测目的基因产物来检测重组DNA是否已导入受体细菌
D.受体细菌内能合成人类干扰素说明目的基因完成了表达
C
课堂训练
5.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是 ， 限制酶Ⅱ的识别序列和切点是 。根据图示判断下列操作正确的是（ ）
A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
D.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
D
6. 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：·
（1）限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有_____________和_______________。
（2）质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是__________________________________________________。
（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即___________DNA连接酶和______DNA连接酶。
平末端 黏性末端
切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同
E·coli T4
（4）反转录作用的模板是 ，产物是 。若要在体外获得大量反转录产物，常采用 技术。
（5）基因工程中除质粒外， 和 也可作为载体。
（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是 。
mRNA
单链DNA
PCR
动植物病毒
噬菌体
未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱
课堂训练
课堂训练
7.图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被____酶切后的产物连接，理由是_______________________。
（2）若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是___________________。
（1）Sau3A Ⅰ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
（2）甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
（3）E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
8.下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答：
（1）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用________________限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含____________的培养基上进行。
HindⅢ和BamHⅠ
氨苄青霉素
（2）能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是________(填字母代号)。
A．启动子 B．tetR C．复制原点 D．ampR
（3）过程①可采用的操作方法是________(填字母)。
A．农杆菌转化 B．大肠杆菌转化
C．显微注射 D．细胞融合
C
A
课堂训练
（4）为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用___________技术。
A.核酸分子杂交 B.基因序列分析
C.抗原-抗体杂交 D.PCR
C
课堂训练
第3章 基因工程问题探讨
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
讨论：
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因”转移到棉花细胞，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
苏云金杆菌内获得Bt抗虫蛋白基因
与载体结合
转入棉花细胞内
检查转基因抗虫棉是否培育成功
将转化成功的细胞进行组织培养，获得转基因抗虫植株
新课讲解
基因工程的基本操作主要包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞(转化)、目的基因的检测与鉴定。
新课讲解
一、目的基因的筛选与获取
(一）目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指能够编码(特定)蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。如：培育抗虫棉所用的抗虫基因就是目的基因。
(二)筛选合适的目的基因：
1.筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
2.实例：
新课讲解
▼相关信息：
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理：
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
1.从基因文库中获取目的基因：
2.利用PCR技术扩增目的基因：
3.通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成目的基因。
获取目的基因常用的方法
新课讲解
(三)利用PCR获取和扩增目的基因
1.PCR含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR是聚合酶链式反应的缩写。
2.目的：获取和扩增目的基因。
3.原理：利用DNA半保留复制。
4.前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
5.过程：PCR扩增目的基因包括多轮循环，每一轮包括：变性、复性和延伸三步。
第1步：变性：加热至90～95℃，DNA解链为单链。
第2步：复性：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链。
第3步：延伸：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。
以上三步不断循环。
▲上述过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
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A—G
C—C
第1步：变性：加热至90～95℃，DNA解链为单链。[其中预变性为5min，最后一次变性为1min，其他为30s]
第2步：复性：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链。[时间为30s]
第3步：延伸：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。[时间为1min]
以上三步不断循环(大概30次)。
新课讲解
(三)利用PCR获取和扩增目的基因
观看视频
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G—G
T—C
变性
复性(退火)
延伸
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A—G
引物Ⅰ
G—G
引物Ⅱ
新课讲解
▼引物：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
细胞内DNA复制是RNA引物，而PCR中是DNA引物。
▼热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)：耐热，热稳定性较高，其催化作用的最适温度是70～75℃。
6.利用PCR技术扩增目的基因的条件
(1)原料：4种脱氧核苷酸。
(2)热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)：催化DNA子链的延伸。
(3)模板：含有目的基因的DNA的两条单链。
(4)引物：DNA引物(过量)。
(5)添加有Mg2+的缓冲液： Mg2+用于激活DNA聚合酶。缓冲液提供扩增反应所需的适宜PH。
(6)温度控制。
耐高温的DNA聚合酶
引物
四种脱氧核苷酸
DNA模板
知识回顾
细胞内参与DNA复制的各种组成分的作用
条件 组分 作用
模板 DNA的两条单链 提供复制的模板
原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
酶 解旋酶 DNA聚合酶等 打开DNA双螺旋
催化合成DNA子链
能量 ATP 为解螺旋和合成子链供能
引物 RNA引物 为DNA聚合酶提供合成的3′端起点
知识整合
细胞内DNA复制 PCR
不同点 解旋 在解旋酶作用下边解旋边复制 80~100℃高温解旋，双链完全解开
酶 DNA解旋酶； DNA聚合酶。 热稳定性DNA聚合酶（Taq聚合酶）
引物 RNA引物 DNA引物
温度 细胞内温和条件 体外高温条件
过程
相同点 ①需要模板、能量、酶； ②需要四种脱氧核苷酸作原料； ③子链延伸的方向都是从5′端向3′端 ④都遵循碱基互补配对。 细胞内DNA复制与PCR技术的比较
观察思考
1、n代后，DNA分子有_____个。
2、n代后，DNA链有_____条。
3、第____代开始符合要求的目的基因。
4、n代后，含引物的DNA分子有_____个。
5、n代后，共消耗__________个引物。
6、第n代复制，消耗了______个引物。
7、n代后，完整的目的基因有________个。
2n
2n+1
3
2n
2n+1-2
2n
2n-2n
观看动画
拓展应用
“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图乙所示：
1.第⑤种DNA分子有_____个
2.第①②种DNA分子有_____个
3.第③④种DNA分子有_____个
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新课讲解
二、基因表达载体的构建
(一)基因表达载体的作用：
1.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并能(通过复制)遗传给下一代。
2.使目的基因能够受体细胞中表达和发挥作用。
重组载体的构建是基因工程的核心，其目的是把目的基因和载体组合成一个新的DNA分子，以便将目的基因送进受体细胞。
(二)基因表达载体的组成：
(1)目的基因
(2)启动子
(3)终止子
(4)标记基因
(5)复制原点
新课讲解
(1)启动子：一段特殊的DNA片段，位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。
(2)终止子：一段特殊的DNA片段，位于目的基因的尾端，使转录终止。
启动子和终止子是目的基因表达所必需的。
(3)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
标记基因的作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，筛选含有目的基因的受体细胞。
(4)复制原点：解旋酶和DNA聚合酶结合位点，是DNA复制所必需的。
新课讲解
(三)构建基因表达载体过程：
1.先用一定的限制酶去切割载体(质粒)，使它出现一个切口，露出末端。
2.然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切断含目的基因的DNA，使二者产生相同(或互补)的末端；
3.将切下的目的基因的片段插入载体的切口处，再加入适量的DNA连接酶；
4.二者的(黏性末端)因碱基互补配对而结合，再加上DNA的连接酶的作用，而结合成重组DNA分子——重组质粒。
难点突破
1.对载体质粒和含目的基因的DNA的切割一般用同一种限制酶，为形成相同的黏性末端。
如果是用不同的限制酶，但必须要形成相同的(或互补的)黏性末端。
——限制酶种类的选择：
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
难点突破
2.构建基因表达载体时，对载体质粒和含目的基因的DNA一般采用用双酶切，而不用单酶切。
因为这样可实现目的基因与载体发生定向连接，可防止它们之间的反向连接，还可防止目的基因和载体DNA的自身环化。
(2)若要将图甲中的抗病基因与图乙中的质料构成重组质粒，应选用图中哪种限制酶？为什么？
提示：Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶。避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接。
3.目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
4.基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
新课讲解
三、将目的基因导入受体细胞
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的受体细胞：
微生物细胞（如大肠杆菌、酵母菌）；
植物细胞；
动物细胞（主要是动物的受精卵）。
3.将目的基因导入植物细胞(即转化植物细胞)的方法：
(1)农杆菌转化法：最常用。适用于双子叶植物和裸子植物，一般不适用于单子叶植物。
(2)花粉管通道法：我国科学家独创。
(3)基因枪法：常用于单子叶植物。
新课讲解
(1)基因枪法：将目的基因吸附在微小的金粒或钨粒表面，然后将微粒用基因枪高速射入受体细胞或组织。该法已广泛应用于被子植物的基因导入。
(2)花粉管通道法：主要有两种做法：一是先将目的基因导入花粉，再通过受精获得导入基因的植株。二是在植物自花授粉后，将目的基因滴在剪开的柱头上，使其沿着花粉管进入胚囊，完成基因导入。目前，后一种方法已在水稻、棉花等农作物上获得了成功。
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(3)农杆菌转化法：将目的基因导入植物细胞最常用的方法。 (用于双子叶植物)。
▼农杆菌的特点：
农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的DNA上。
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农杆菌转化步骤：
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4.将目的基因导入动物细胞(转化动物细胞)的方法——显微注射法。
(1)显微注射法。借助光学显微镜的放大作用，利用一种极细的注射器直接将目的基因注射到细胞(一般是受精卵)中。利用这种方法已生产出了鼠、兔、羊、猪、牛等转基因动物。
(2)基本操作程序：目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵→移植到雌性动物的输卵管或子宫内→发育成具有新性状的动物。
新课讲解
5.将目的基因导入微生物细胞(转化微生物细胞)——感受态细胞法：
原核细胞适于做受体细胞的原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少。
导入方法：感受态细胞法(或叫Ca2+处理法)。
转化的步骤：
①用CaCl2溶液处理大肠杆菌，增大其细胞壁及细胞膜的通透性，使其处于感受态(易吸收周围环境中DNA分子的生理状态)；
②重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
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四、目的基因的检测与鉴定
1.检测转基因生物(受体) 的染色体DNA上是否插入了目的基因：
(一)分子水平的检测：
常用方法：(1)DNA分子杂交：观察是否出现杂交带。如果出现杂交带说明目的基因已插入到受体细胞DNA上。
(2)PCR技术。根据目的基因的碱基序列设计特异性引物，进行PCR扩增，如果能扩增出目的基因，说明目的基因已插入到受体细胞DNA上。
新课讲解
2.转录检测——即目的基因是否转录出了相应的mRNA。
方法：(1)分子杂交法，用于检测目的基因转录的mRNA。若出现杂交带说明目的转录成功。
(2)PCR技术。提取受体生物的mRNA，进行逆转录获取cDNA，再利用目的基因特异性引物，进行PCR扩增，如果能扩增出目的基因，说明目的基因转录成功。
3.翻译检测——检测目的基因是否翻译成蛋白质：
方法：抗原—抗体杂交。若出现杂交带，说明目的基因已翻译成功。
(二)个体生物学水平上的鉴定：
检测转基因生物是否表现出目的基因所控制的性状。如抗虫或抗病的鉴定等。
(1)抗虫或抗病的接种实验。
(2)有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较。
例如，对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄，需要先通过栽培获得果实后，再与天然产品比较，确定其是否具有了抗冻性状。
知识整合
检测过程 检测对象 方法原理 现象结论
目的基因是否整合到受体生物的DNA上 目的基因 DNA分子杂交法或PCR技术 出现杂交带，说明已整合或经鉴定PCR能扩增出目的基因
目的基因是否转录 mRNA或目的基因 分子杂交法 或PCR技术 出现杂交带，说明转录或经鉴定PCR能扩增出相应的产物
目的基因是否翻译 蛋白质 抗原-抗体杂交 出现杂交带，说明已翻译
个体水平检测 包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同 目的基因的检测与鉴定——分子水平上的鉴定及方法
知识整合
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物 饲喂害虫(抗虫接种实验) 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染(抗病接种实验) 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌或种植于盐碱地中 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常
个体生物学水平的鉴定
课堂训练
1.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是（ ）
A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性
B.有利于对目的基因是否导入进行检测
C.增加质粒分子的分子量
D.便于与外源基因连接
B
2.哪项不是基因表达载体的组成部分（ ）
A.启动子 B.终止密码
C.标记基因 D.目的基因
3.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法（ ）
A.基因枪法 B.显微注射法
C.农杆菌转化法 D.花粉管通道法
B
B
4.利用细菌大量生产人类干扰素，下列叙述错误的是（ ）
A.用适当的酶对运载体与人类干扰素基因进行切割与黏合
B.用适当的化学物质处理受体细菌表面，将重组DNA导入受体细菌
C.通常通过检测目的基因产物来检测重组DNA是否已导入受体细菌
D.受体细菌内能合成人类干扰素说明目的基因完成了表达
C
课堂训练
5.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是 ， 限制酶Ⅱ的识别序列和切点是 。根据图示判断下列操作正确的是（ ）
A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
D.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
D
6. 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：·
（1）限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有_____________和_______________。
（2）质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是__________________________________________________。
（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即___________DNA连接酶和______DNA连接酶。
平末端 黏性末端
切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同
E·coli T4
（4）反转录作用的模板是 ，产物是 。若要在体外获得大量反转录产物，常采用 技术。
（5）基因工程中除质粒外， 和 也可作为载体。
（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是 。
mRNA
单链DNA
PCR
动植物病毒
噬菌体
未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱
课堂训练
课堂训练
7.图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被____酶切后的产物连接，理由是_______________________。
（2）若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是___________________。
（1）Sau3A Ⅰ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
（2）甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
（3）E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
8.下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ直线所示为三种限制酶的酶切位点。据图回答：
（1）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用________________限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含____________的培养基上进行。
HindⅢ和BamHⅠ
氨苄青霉素
（2）能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是________(填字母代号)。
A．启动子 B．tetR C．复制原点 D．ampR
（3）过程①可采用的操作方法是________(填字母)。
A．农杆菌转化 B．大肠杆菌转化
C．显微注射 D．细胞融合
C
A
课堂训练
（4）为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用___________技术。
A.核酸分子杂交 B.基因序列分析
C.抗原-抗体杂交 D.PCR
C
课堂训练