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第2节 微生物的培养技术及应用
第2课时 微生物的选择培养和计数
第1章 发酵工程
课标内容要求
核心素养对接
必备知识·自主预习储备
01
目的菌
抑制
阻止
特定种类
抑制或阻止
脲酶
尿素
菌液
选择
0.1 mL
培养基表面
酒精
火焰
冷却
均匀
转动
均匀
倒置
恒温培养箱
稀释度
活菌
30～300
3
平均值
血细胞计数板
计数
分离
无机盐
碳源
氮源
凝固剂
表层土
3～8
1×104、1×105和1×106
30～37 ℃
24 h
菌落数目稳定
×
×
×
√
√
×
关键能力·重难探究达成
02
核心点一
核心点二
应用创新·问题情境探究
03
学习效果·随堂评估自测
04
点击右图进入…
课
时
分
层
作
业
谢谢观看 THANK YOU!
W
104
10
106
eD e
1×10
10g土样+90mL无菌水
浅仰芹
我仰
h
团结守纪勤学春
概念
选择培养基
配方的设计
微生物的选择培养和计数
稀释涂布
微生物的
平板法
系列梯度稀释操作
选择培养
涂布操作与培养
方法
稀释涂布平板法
显微镜直接计数
微生物的
数量测定
探究，实践
土壤中分解尿素的
细菌的分离与计数第2课时 微生物的选择培养和计数
1．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。2．概述稀释涂布平板法和显微镜直接计数法是测定微生物数量的常用方法。 1．生命观念——通过实例理解各类微生物都能适应其生活环境。2．科学思维——根据微生物的代谢类型配制选择培养基；总结分离微生物的过程和测定微生物数量的常用方法。3．科学探究——讨论土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验方法并对实验结果进行评价。
一、选择培养基
1．实验室中微生物筛选的原理
人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．选择培养基的概念
在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
3．选择培养基配方的设计
(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生NH3。
(2)培养基配方设计：以尿素为唯一氮源的选择培养基。
二、微生物的选择培养
1．方法
对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上，即稀释涂布平板法。
2．稀释涂布平板法的操作过程
(1)系列梯度稀释操作
(2)涂布平板操作
①取菌液：取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面。
②涂布器灭菌：取出浸在酒精中的涂布器，放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
③涂布过程：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
3．培养
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d，观察。
三、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)统计依据
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)操作
①选用一定稀释范围的样品液进行培养，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
2．显微镜直接计数
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
四、探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．提出问题
如何分离土壤中分解尿素的细菌？每克土壤样品中含有多少分解尿素的细菌？
2．基础知识
组分 含量 提供的主要营养
KH2PO4 1.4 g 无机盐
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g 碳源
尿素 1.0 g 氮源
琼脂 15.0 g 凝固剂
H2O 定容至1 000 mL 水
3．实验设计
(1)土壤取样：先铲去表层土，取距地表3～8 cm的土壤层，将样品装入纸袋中。
(2)样品的稀释：一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
(3)微生物的培养与观察：细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2天。每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
1．该实验中的选择培养基对分解尿素的细菌具有选择作用。若要判断选择培养基是否起到筛选的作用，对照组应如何设置？
提示：用牛肉膏蛋白胨培养基接种后在相同条件下同时培养。
2．若分离纤维素分解菌，需将土壤浸出液接种到仅含有纤维素作为碳源的培养基进行培养，培养2天后可“浓缩”纤维素分解菌，分析其原因。
提示：在仅含有纤维素作为碳源的培养基上，纤维素分解菌能够分解纤维素获取营养进行繁殖，不能分解纤维素的微生物因缺乏营养而繁殖受到抑制。
(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。 (×)
提示：选择分解尿素的细菌的培养基为固体培养基，固体培养基具有分离、鉴定作用。
2．由于使用了选择培养基，因此实验不需要设置对照组。 (×)
提示：应该设置未接种的平板和接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板作为对照。
3．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿盖。 (×)
提示：为了防止杂菌污染，不能完全打开皿盖。
4．在同一稀释度下，至少要涂布3个平板。 (√)
5．当菌落数目稳定时，选取菌落数为30～300的平板进行计数。 (√)
6．统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。 (×)
提示：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
微生物的选择培养与计数方法
1．选择培养的目的
从众多微生物中分离出需要的特定微生物。
2．筛选微生物常用培养基——选择培养基和鉴别培养基
选择培养基 鉴别培养基
特殊成分 控制某一条件(如唯一氮源)或加入某种物质(如青霉素) 加入某种指示剂或化学药品
目的 抑制其他微生物生长，促进目的微生物的生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途 培养、分离出特定微生物 鉴别不同的微生物
举例 培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌 可用伊红—美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
3．稀释涂布平板法
(1)主要操作环节：系列梯度稀释和涂布平板。
(2)系列梯度稀释和涂布平板后培养结果如图所示：
(3)计算公式：
每克样品中的菌株数＝
×稀释倍数
(4)计数结果：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以计算结果比实际值偏小。
4．稀释涂布平板法操作注意的问题
(1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。
(2)涂布平板时
①涂布器浸在体积分数为70%的酒精中，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧。
②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不接触任何物体。
(3)同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。
5．显微镜直接计数
(1)原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)方法：显微镜下观察，细菌计数板或血细胞计数板计数。
(3)缺点：统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和，计算结果比实际值偏大。
1．如何从大豆田土壤中分离出固氮微生物？
提示：从大豆田土壤中取土样，利用缺乏氮源的培养基可分离出固氮微生物。
2．要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
提示：应从富含纤维素的土壤中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
3．稀释涂布平板法和显微镜直接计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微镜直接计数法计数的结果比实际值大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。
1．(2021·山东泰安期中)下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的描述不正确的是( )
A．利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌
B．两种计数方法，其统计值与实际值相比均有差异，但差异原因不同
C．两种计数方法均能在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征
D．当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进行计数
C [显微镜直接计数法无法区分死菌和活菌，A正确；稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的往往是一个菌落，故而统计值比实际值偏小，显微镜直接计数时不能区分死菌和活菌，故统计值大于实际值，因此两种计数方法，其统计值与实际值相比均有差异，但差异原因不同，B正确；稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征，而不是微生物的形态特征，显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征，C错误；当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进行计数，D正确。]
2．尿素是一种重要的氮肥，但是不能被农作物直接吸收，只有被土壤中的细菌分解成氨后才能被植物利用。某实验小组要完成课题“从土壤中分离出能分解尿素的细菌”，请回答下列问题。
(1)细菌适宜在酸碱度为________________的潮湿土壤中生长，因此土壤取样时要选择合适的地点。
(2)在该实验中，配制培养基需要以________为唯一氮源，该培养基中________(填“需要”或“不需要”)添加葡萄糖，原因是____________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
若要验证该培养基具有选择作用，需要设置__________________________
____________________________________________________________________
作为对照，当____________________________________时，即可说明该培养基具有选择作用。
(3)在接种前需要对样品进行稀释处理，以保证获得菌落数在________范围、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105、1×106倍的稀释液进行平板培养，若测定放线菌数量，则需要采用与此不一样的稀释倍数，原因是____________________________________________。
(4)在进行实验时，甲同学从对应1×106倍稀释的培养基中筛选出大约200个菌落，但是其他同学在同样稀释度下只筛选出大约90个菌落，若甲同学的结果有问题，则可能的原因是_____________
______________________________________(答出一项即可)。
[解析] (1)细菌适宜在酸碱度为中性或弱碱性的潮湿土壤中生长。(2)从土壤中分离尿素分解菌，需要配制以尿素为唯一氮源的培养基，并且需要外加碳源，因为尿素分解菌为异养微生物。为验证该培养基具有选择作用，需要设置牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，接种等量样品，在相同条件下培养，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数量应明显多于该培养基。(3)计数时需要保证菌落数为30～300；土壤中各类微生物的数量是不同的，所以分离不同的微生物需要采用不同的稀释倍数。
[答案] (1)中性或弱碱性 (2)尿素 需要 尿素分解菌为异养生物，葡萄糖可为其提供碳源 接种相同样品的牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落明显多于该培养基上的菌落 (3)30～300 土壤中各类微生物的数量是不同的 (4)培养基被杂菌污染或培养基中混入了其他含氮物质(合理即可)
两种纯化方法的比较
主要方法 平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
菌体获取 在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．分离菌种的原理
在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，只有能产生脲酶的微生物才能分解尿素，而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖。
2．实验流程示意图
3．实验操作过程
流程 具体操作 操作提示
土壤取样 先铲去表层土，取距地表3～8 cm的土壤层，将样品装入纸袋中 ①适宜在富含有机质，酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样②取样用的铁铲和取样的纸袋使用前都需要灭菌
制备培养基 分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用
样品的稀释和涂布 ①火焰旁称取土壤样本②将稀释倍数为103～107倍稀释的稀释液涂布平板。每个稀释度至少涂布三个平板作为重复组 ①注意无菌操作②对所用的平板、试管标记好③初次实验对于稀释的范围没有把握，可选择一个较为宽泛范围(103～107倍稀释)的稀释液
培养、观察和计数 ①将涂布好的平板和空白平板放在适宜温度下的培养箱中倒置培养②每隔24 h统计一次菌落数目，比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录③当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数 ①空白平板作为对照，检测培养基制备是否合格②观察时还要记录不同菌落的形状、大小、颜色等③在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中活菌的数目
4．实验结果分析
内容 现象 结论
有无杂菌污染的判断 对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高 被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高 培养基中混入其他杂菌
选择培养基的筛选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作 得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板 操作成功
重复组的结果 若选取同一种土样，统计结果应接近
5．鉴定原理
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3，使培养基的碱性增强，pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
1．在稀释涂布平板法中，为何需要涂布3个平板？
提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
2．为什么一般选择菌落数为30～300的平板进行计数？
提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌种的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌种形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
3．为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌种开始看不出来明显的菌落。
1．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是( )
A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照
C．该实验应采用稀释涂布平板法
D．用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲液的培养基来培养该细菌后不会使酚红指示剂变红
B [利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低，菌落太多，会长在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种了的没有选择作用的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，B错误；该实验应采用稀释涂布平板法，C正确；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲液的培养基来培养该细菌，则能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D正确。]
2．(2021·山东烟台月考)分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，某生物实验小组尝试对分解尿素的微生物进行分离与计数。请回答下列问题。
(1)分解尿素的微生物能产生________；配制培养基时应以________作为唯一氮源。
(2)该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是__________________；然后将1 mL样液稀释10 000倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别涂布0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板的菌落数分别为39、42和45。据此可得出每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数为________个。
(3)微生物的培养与观察
①培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养________和培养________。
②观察：每隔24 h统计一次________数目，选取菌落数目______时的记录作为结果。
[解析] (1)分解尿素的微生物能产生脲酶；配制培养基时应以尿素作为唯一氮源。(2)在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，其目的是检测平板灭菌是否合格。每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数＝某一稀释度下培养基上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数＝(39＋42＋45)÷3÷0.1×10 000＝4.2×106个。(3)不同种类的微生物，在培养时往往需要不同的培养温度和培养时间，在培养过程中，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
[答案] (1)脲酶 尿素 (2)检测平板灭菌是否合格 4.2×106 (3)①温度 时间 ②菌落 稳定
实验中的两种“对照组”与“重复组”
(1)两种对照组作用比较
①判断培养基中“是否有杂菌污染”，需将未接种的培养基(空白对照组)同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”，需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行接种培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用：为排除偶然因素对实验结果的干扰，在每一稀释度下宜设置3个平板作为重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式计算活菌数。
微生物合成的油脂是制备生物柴油的新型原料。如图为产油脂芽孢杆菌筛选的流程，其中B平板上的5个菌落是初筛得到的芽孢杆菌，C为B平板上菌落的原位影印，利用苏丹黑B可使脂类物质呈黑色的特性，对C进行染色，得到结果D。
通过本案例培养学生的演绎与推理和对实验结果的交流和讨论能力。
(1)图中对土壤菌液进行系列梯度稀释的目的是什么？(科学思维)
(2)根据D的染色结果，判断B平板中产油脂芽孢杆菌的菌落是哪一个？(科学思维)
(3)采用什么方法将B平板中的产油脂芽孢杆菌的单菌落进一步纯化培养得到E？(科学思维)
提示：(1)将微生物分散成单个细胞，进而获得单个菌落。
(2)3。
(3)平板划线法或稀释涂布平板法。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 要 点 强 化 识 记
1．核心概念选择培养基：指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。2．结论语句(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。(2)为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。(3)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。(4)统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1．选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是( )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养型细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养型细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
D [不含有机物的培养基中能筛选出自养型微生物，如硝化细菌；缺氮培养基可以筛选出固氮微生物，如固氮菌；含尿素(不含其他氮源)的培养基能筛选出合成脲酶的微生物，如分解尿素的细菌，D正确。]
2．(2021·四川绵阳月考)下列不能测定样品微生物数目的方法是( )
A．稀释涂布平板法
B．细菌计数板计数法
C．血细胞计数板计数法
D．平板划线法
D [稀释涂布平板法能推测出样品中大约含有多少活菌，A正确；细菌计数板计数法和血细胞计数板计数法都可用于测定样品中微生物数目，B、C正确；平板划线法可用于分离微生物，但不能用于测定样品中微生物数目，D错误。]
3．(2022·太原月考)判断选择培养基是否起到选择作用时，需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基
B．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
C．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
D．接种了的选择培养基
B [选择培养基的作用是只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长，若设置对照组，需要用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基，若该培养基上微生物能生长且并非只有特定种类，则可证明选择培养基起到选择作用，B项符合题意。]
4．用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( )
A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是212、240和250，取平均值234
D [在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，A、B错误。C项虽然涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与其他的相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值，C错误。]
5．尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题。
(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。
(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是_________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)一般依据尿素分解菌菌落的________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数目为________个。上述过程采用的接种方法是______________。
(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是___________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
[解析] (1)分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，尿素作为氮源。因为只有能合成脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度，据此来统计菌落的数目。微生物计数的方法为稀释涂布平板法，1 mL悬液中活细菌的数目为(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(个)。(4)可单独设置一个灭菌后不接种样液的含同种培养基的培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。
[答案] (1)脲酶 (2)无机盐 只有以尿素为唯一氮源的细菌才能在该培养基上生长 (3)形状、大小 4.2×108 稀释涂布平板法 (4)单独设置一个灭菌后不接种样液的培养皿(含同种培养基)进行培养
15/15课时分层作业(2) 微生物的基本培养技术
题组一 制备培养基
1．(2022·北京顺义区期末)下列有关培养基的叙述，正确的是( )
A．培养基所含物质的成分都相同
B．培养基只能用于培养微生物
C．向固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基
D．微生物在固体培养基上生长时可形成肉眼可见的菌落
2．下列关于微生物的营养物质的说法，正确的是( )
A．同一种物质不可能既作碳源又作氮源
B．凡是碳源都能提供能量
C．除水以外的无机物仅提供无机盐
D．无机氮源也可能提供能量
3．培养自养型微生物和培养异养型微生物的主要区别是( )
A．培养过程对氧气的需求不同
B．培养基中碳源不同
C．培养基中氮源不同
D．培养基中无机盐不同
题组二 无菌技术
4．下列操作与消毒或灭菌无关的是( )
A．接种前用酒精灯火焰灼烧接种环
B．接种前用酒精擦拭双手
C．将平板倒置，放入培养箱中培养
D．在酒精灯的火焰旁完成接种
5．下列关于灭菌和消毒的理解，不正确的是( )
A．灭菌是指杀灭物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B．常用消毒方法有加热法、紫外线法、化学药剂法
C．接种环用灼烧灭菌法
D．消毒和灭菌实质上是相同的
6．(2021·天津等级考)下列操作能达到灭菌目的的是( )
A．用免洗酒精凝胶擦手
B．制作泡菜前用开水烫洗容器
C．在火焰上灼烧接种环
D．防疫期间用石炭酸喷洒教室
题组三 微生物的纯培养
7．下列有关倒平板操作的叙述，错误的是( )
A．将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B．使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C．将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上
D．等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置
8．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 ℃恒温箱的目的是( )
A．对比观察培养基有没有被微生物利用
B．对比分析培养基是否被杂菌污染
C．没必要放入未接种的培养基
D．为了下次接种时再使用
9．下列关于平板划线操作的叙述，错误的是( )
A．每次划线前都要灼烧接种环
B．灼烧接种环后，要立即用接种环接种，防止杂菌污染接种环
C．要在酒精灯火焰旁进行
D．接种前，要将菌种试管口通过火焰
10．如图为微生物的实验室培养和纯化醋酸菌的部分操作步骤，请回答下列问题。
① ② ③ ④
(1)①是制备培养基时________的操作，该操作需待培养基冷却至________左右时进行。
(2)该实验中纯化醋酸菌的接种方法是______________；完成步骤④的操作，接种环共需要________次灼烧处理，其中最后一次灼烧的目的是_____________________________________________________________________
__________________________________________________________________。
(3)划线的某个平板经培养后，第一次划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二次划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，造成划线上无菌落可能的操作失误有_______________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________(回答2个)。
(4)接种结束后，将④倒置培养，皿底上标注__________________________。
11．(2022·河北唐山期中)下列关于微生物实验操作的叙述，正确的是( )
A．配制细菌培养基过程中，需要在倒平板时调节培养基的pH
B．配制固体培养基时加入琼脂，其作用是为微生物生长提供碳源
C．平板划线法接种时，每次划线之前都需对接种环进行灭菌
D．实验结束后，使用完的培养基可以直接丢弃
12．人体皮肤表面存在着多种微生物，某同学拟从中分离出葡萄球菌。下述操作不正确的是( )
A．对配制的培养基进行高压蒸汽灭菌
B．使用无菌棉拭子从皮肤表面取样
C．用取样后的棉拭子在固体培养基上直接培养
D．观察菌落的形态和颜色等进行初步判断
13．(不定项)接种是微生物培养和分离等过程的必要步骤之一。下列关于接种的叙述不正确的是( )
A．接种通常指无菌条件下将微生物接入培养基的操作
B．接种前需要对接种环灼烧灭菌，接种后则不需要灭菌
C．接种通常在酒精灯火焰附近进行
D．接种环能将培养基的表面划破
14．(不定项)下列有关平板划线操作的叙述，正确的是( )
A．第一次操作前灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
C．在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
D．划线结束后，灼烧接种环能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境或感染操作者
15．请回答下列与大肠杆菌纯培养有关的问题：
(1)制备培养基：配制培养基时各种成分在溶化后分装前必须进行________，培养基在接种前要进行____________灭菌。
(2)纯化大肠杆菌
①通过接种环在琼脂固体培养基的表面进行连续划线的操作，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的单菌落，这种方法称为______________。
②用该方法统计样本菌落数时________(填“需要”或“不需要”)设置对照组，为什么？_______________________________________________________
__________________________________________________________________。
(3)讨论分析
①纯化大肠杆菌时，________(填“可以”或“不可以”)用加入抗生素的方法防止杂菌感染。
②用该方法分离大肠杆菌时，从第二次划线操作起，每次总是要从上一次划线的末端开始划线，并划线数次，其原因是__________________________
__________________________________________________________________。
③大肠杆菌与酵母菌的最本质区别是______________________________
__________________________________________________________________。
5/7课时分层作业(3) 微生物的选择培养和计数
题组一 选择培养基
1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
C [尿素和硝酸盐都能作为氮源，而培养尿素分解菌的培养基应是以尿素为唯一氮源的固体培养基。因此培养基中应不加硝酸盐，加入尿素和琼脂。葡萄糖作为碳源，也需要加入。]
2．(2022·山东德州高二期末)某同学成功分离出了土壤中的固氮菌，结果如图所示。该实验使用了( )
A．平板划线法
B．液体培养基
C．不含氮源的培养基
D．不含碳源的培养基
C [题图所示结果呈现的是单个菌落，故题述实验采用了稀释涂布平板法，A项错误；在固体培养基上才能形成菌落，B项错误；要分离土壤中的固氮菌，应该用不含氮源的选择培养基，C项正确；固氮菌为异养型生物，因此所用培养基需要加入碳源，D项错误。]
3．为了从土壤中分离获得尿素分解菌的单菌落，某同学设计了A、B两种培养基，其成分如下表所示。请回答下列相关问题。
项目 葡萄糖 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 尿素 琼脂 水
培养基A ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
培养基B ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
注：“＋”表示有，“－”表示无。
(1)培养基中的葡萄糖能为细菌的生长繁殖提供__________和________。通常情况下，制备培养基时要根据所培养微生物的不同来调节培养基的pH，其原因是________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
(2)据表判断，培养基A________(填“能”或“不能”)用于分离获得尿素分解菌的单菌落，原因是_________________________________________________
____________________________________________________________________；
培养基B不能用于分离尿素分解菌，原因是__________________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)培养基中的葡萄糖能作为能源物质，即作为细菌细胞呼吸的底物，为细菌的生长繁殖提供能量；葡萄糖氧化分解的中间产物能为合成其他有机物提供原料。不同微生物生长繁殖所需的最适pH不同，如培养霉菌时需要将pH调至酸性，培养细菌时需要将pH调至中性或弱碱性。(2)培养基A没有添加尿素或其他氮源物质，尿素分解菌不能获得氮源而无法生长繁殖。培养基B没有添加凝固剂——琼脂，属于液体培养基。液体培养基不能将培养的目的菌分散成单个细菌而无法获得单菌落。
[答案] (1)能量(能源) 碳源(合成其他有机物的原料或中间物质) 不同微生物生长繁殖所需要的(适宜)pH不同 (2)不能 该培养基缺少氮源，尿素分解菌不能获得氮源而无法生长繁殖 培养基没有凝固剂，是液体培养基，不能将目的菌分散成单个细菌而无法获得单菌落
题组二 微生物的选择培养
4．(2021·湖北鄂州高二期末)研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从石油污染的土壤中筛选出一种高效石油降解菌。下列相关叙述错误的是( )
A．这种培养基是一种选择培养基
B．培养基中的碳源应该以石油为唯一碳源
C．高效石油降解菌可以降解土壤中的石油，修复土壤
D．高效石油降解菌在未被石油污染的土壤中含量较高
D [分离获得能降解石油的菌株的关键是以石油作为唯一碳源的选择培养基进行培养，A、B正确；高效石油降解菌可以降解土壤中的石油，修复土壤，C正确；高效石油降解菌在被石油污染的土壤中含量较高，D错误。]
5．下列有关微生物筛选的叙述中，不正确的是( )
A．用全营养马铃薯琼脂培养基筛选酵母菌
B．用高盐的培养基筛选抗盐突变菌
C．含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的细菌
D．利用高温条件筛选水生栖热菌
A [全营养马铃薯琼脂培养基常用于大肠杆菌的培养，该培养基对酵母菌无选择作用，筛选酵母菌应在选择培养基中培养，A错误；抗盐突变菌具有耐高盐的能力，因此可以利用高盐的培养基进行选择培养，B正确；分解尿素的细菌能将尿素分解产生氨，使培养基pH升高，因此可以利用含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的细菌，C正确；利用高温条件可以筛选水生栖热菌，D正确。]
6．(2022·山东泰安肥城检测)处理生活垃圾的有效方法之一是用微生物对其进行降解。下图表示筛选高效降解淀粉菌种的过程。相关分析正确的是( )
A．筛选所用培养基中的碳源应为牛肉膏和蛋白胨
B．将菌液接种到培养基的方法是平板划线法
C．菌落①与菌落②透明圈大小不同的原因是其对碘的分解能力不同
D．扩大培养时用不加琼脂的液体培养基效果更好
D [筛选所用培养基应以淀粉作为唯一的碳源，这样才能将降解淀粉的菌种筛选出来，A错误；由培养基上的单个菌落可知，将菌液接种到培养基的方法是稀释涂布平板法，B错误；由于培养基中的唯一碳源是淀粉，而淀粉遇碘液会变蓝，故菌落①与②周围透明圈的大小不同的原因可能是两个菌群对淀粉的分解能力不同，C错误；液体培养基可增大溶氧量，也能增加菌种与营养物质的接触面积，故扩大培养时用不加琼脂的液体培养基效果更好，D正确。]
题组三 微生物数量的测定
7．下列关于统计菌落数目的方法的叙述，不正确的是( )
A．采用稀释涂布平板法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌往往会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用菌落密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果
C [稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，值得注意的是，该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，A、B正确。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数；设计实验时，一定要至少用三个平板做重复实验，才能增强实验的说服力和准确性；分析结果时，一定要考虑所设置的重复实验的结果是否一致，差别不大时，取平均值作为统计结果，C错误，D正确。]
8．(2021·烟台高二期中)下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )
A．取1×104、1×105、1×106倍的土壤稀释液和无菌水各1 mL，分别涂布于各组平板上
B．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高压蒸汽灭菌后倒平板
C．统计的菌落数目往往比活菌的实际数目小
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300之间的实验组平板进行计数
A [取1×104、1×105、1×106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，A错误；用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，培养基经过高压蒸汽灭菌后倒平板，B正确；用活菌计数法统计菌落数目时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数目往往比活菌的实际数目小，C正确；确定对照组无菌后，通常选择菌落数在30～300的实验组平板进行计数，D正确。]
9．下面是探究如何从土壤中分离出自生固氮菌与计数的实验，请回答下列问题。
实验原理：农田的表层土壤中自生固氮菌的数量比较多。将用表层土壤制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离。
材料用具：农田的表层土壤、配制无氮培养基和牛肉膏蛋白胨培养基的材料、盛有9 mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛有90 mL无菌水的锥形瓶、恒温箱等。
(1)方法步骤
①培养基的制备：分别配制无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基，倒平板应在________________________操作。
②制备土壤稀释液：取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL，转至盛有9 mL无菌水的试管中，依次稀释到1×107倍。
③涂布平板操作：按照由1×107～1×103倍稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行涂布平板操作，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布________个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布________个。
④培养：放入恒温箱内，在28～30 ℃下培养3～4 d。
⑤计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。如果在稀释倍数为1×105的平板上测定的平均值为50，则每克样品中的菌体数是________个。
(2)预期结果：相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数________(填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。原因是________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)在酒精灯火焰旁倒平板，可以减少杂菌的污染。为了保证结果准确，一般每个稀释度下设置3个或3个以上平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值，则每克样品中的菌体数为(50÷0.1)×105＝5×107(个)。(2)可用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组来说明无氮培养基的选择作用，牛肉膏蛋白胨培养基适合其他细菌生存，所以它比无氮培养基上的菌落数目多。
[答案] (1)①酒精灯火焰附近 ③3 1 ⑤30～300 5×107 (2)多于 无氮培养基上只有土壤中的自生固氮菌能生长繁殖，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有微生物生长
10．(2022·河北石家庄期中)为了判断培养基是否被杂菌污染和选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照组的培养基分别是( )
A．未接种的选择培养基、未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
B．未接种的培养基、接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
C．接种了的选择培养基、接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D．接种了的培养基、未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
B [要判断培养基是否被杂菌污染，可将未接种的培养基放在恒温箱中培养，一段时间后，若有菌落产生，说明培养基被污染，若无菌落产生，说明培养基没有被污染。要判断选择培养基是否起到了选择作用，接种了的选择培养基是实验组，将等量的稀释相同倍数的菌液接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，作为对照组，在相同的条件下进行培养，观察比较对照组和实验组中的菌落数，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目。综上所述，B正确。]
11．(不定项)生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒入平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示。下列说法正确的是( )
A．倒入平板后直接培养可判断培养基有无污染
B．倒入平板后培养基需要进行灭菌处理
C．图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
D．生长图形法还可用于某些菌种的筛选
AD [平板上不含任何生长因子，若倒入平板后直接培养，出现菌落说明培养基已被杂菌感染，因为该嗜热菌不能在缺乏生长因子的培养基中生长，A正确；制备培养基时，先灭菌再倒平板，B错误；图中菌落生活在乙、丙区域之间，说明同时需要乙和丙，C错误；不同菌种所需生长因子不同，可利用生长图形法筛选菌种，D正确。]
12．(不定项)(2021·山东烟台月考)某生物兴趣小组尝试对土壤中分解尿素的细菌进行分离并计数，相关叙述不正确的是( )
A．制备选择培养基时，需加入尿素、琼脂、葡萄糖、硝酸盐等物质
B．用活菌计数法统计结果，活菌的实际数目往往比统计的菌落数少
C．脲酶将尿素分解成氨使培养基的pH降低，加入酚红指示剂后变红
D．测定土壤中细菌的数目，一般选用1×104、1×105、1×106倍的稀释液进行平板培养
ABC [分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要添加尿素(唯一的氮源)、琼脂(凝固剂)、葡萄糖(碳源)，尿素给分解尿素的细菌提供氮源，不需要加硝酸盐，A错误；用活菌计数法统计结果时，有的活菌在培养过程中会死亡，而有的菌落是由两个或多个活菌连在一起形成的，统计的菌落数比实际值偏小，故活菌的实际数目往往比统计的菌落数多，B错误；脲酶将尿素分解成氨使培养基的pH升高，加入酚红指示剂后变红，C错误；土壤中细菌的含量比较多，测定土壤中细菌的数量时，一般选用1×104、1×105、1×106倍的稀释液进行平板培养，D正确。]
13．为了分离和纯化高效分解石油的细菌，科研人员利用被石油污染过的土壤进行下图A所示的实验。
A
B
(1)配制好的培养基灭菌通常可以使用__________法。步骤③与步骤②中培养基成分的最大区别是________________________。这种培养基从功能上看属于________(填“选择”或“鉴别”)培养基。
(2)同学甲进行步骤④的操作，其中一个平板经培养后的菌落分布如图B所示。该同学的接种方法是________________；推测同学甲用此方法接种时出现图B结果可能的操作失误是______________；在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_______________________________
____________________________________________________________________。
(3)同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤④的操作：将1 mL样品稀释100倍，在3个平板上分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、58和57。据此可得出每升样品中的活菌数为________。这种计数方法得到的结果一般比实际值偏小，原因可能有_____________________
____________________________________________________________________。
(4)步骤⑤需要振荡培养，其目的是提高培养液溶氧量，同时使____________________________________________________________________，提高营养物质利用率。
(5)步骤⑤后取样测定石油含量的目的是______________________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)根据题意，要分离和纯化高效分解石油的细菌，配制好的培养基灭菌通常可以使用高压蒸汽灭菌法。图中步骤②是扩大培养来自被石油污染过的土壤中的细菌，步骤③是利用石油扩大培养分解石油的细菌，步骤③与步骤②中培养基成分的最大区别是步骤③的培养基中石油是唯一碳源。这种培养基从功能上看属于选择培养基。(2)步骤④是对分解石油的细菌进行分离，分析图B可知，分解石油的细菌在培养基上所形成的是单个菌落，说明同学甲进行过程④的操作中接种方法是稀释涂布平板法；图B中培养基表面左侧的菌落数目明显比右侧多，推测同学甲用此方法接种时可能涂布不均匀；在接种前随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。(3)同学乙也按照同学甲的接种方法进行了步骤④的操作，据题干信息计算，可得出每升样品中的活菌数为(56＋58＋57)÷3÷0.1×100×1 000＝5.7×107(个)。由于细菌会相互重叠，当两个或多个细菌连在一起时，形成菌落后，平板上观察到的只是一个菌落，所以导致统计的细菌数目往往比实际数目少。(4)步骤⑤需要振荡培养，其目的是提高培养液溶氧量，同时使菌体与培养液充分接触，提高营养物质利用率。(5)步骤⑤后取样测定石油含量的目的是筛选出分解石油能力最好的细菌，其中石油剩余量最少的一组所含的细菌就是分解石油能力最好的细菌。
[答案] (1)高压蒸汽灭菌(湿热灭菌) 步骤③的培养基中石油是唯一碳源 选择 (2)稀释涂布平板法 涂布不均匀 检测培养基平板灭菌是否合格 (3)5.7×107(个) 当两个或多个细菌连在一起时，形成菌落后，平板上观察到的只是一个菌落 (4)菌体和培养液充分接触 (5)筛选出分解石油能力最好的细菌
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