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第1节 重组DNA技术的基本工具
第3章 基因工程
课标内容要求
核心素养对接
必备知识·自主预习储备
01
生物体外
转基因
遗传特性
生物类型
DNA分子
遗传物质是DNA
DNA可以在同种生物的不同个体
之间转移
DNA双螺旋结构
遗传物质自我复制
第一个编码氨基酸的密码子
多种限制
DNA连接
逆转录
质粒
重组DNA
重组人胰岛素
世界上第一
条转基因鱼
PCR
人类基因组
高通量测序技术
基因组编辑
原核生物
核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
平末端
碱基序列
不同
专一性
磷酸二酯键
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
平末端
真核细胞细
胞核
原核细胞拟核DNA
自我复制
限制酶切割
进行自我复制
整合到受体DNA上
受体DNA
标记基因
重组DNA分子
的筛选
物理和化学性质
酒精
2
二苯胺
研磨液
上清液
上清液
DNA
一个
沉淀物
二苯胺
沸水中
蓝色
√
×
×
√
×
√
关键能力·重难探究达成
02
核心点一
核心点二
应用创新·问题情境探究
03
学习效果·随堂评估自测
04
点击右图进入…
课
时
分
层
作
业
谢谢观看 THANK YOU!第1节 重组DNA技术的基本工具
1．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 1．生命观念——运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。2．社会责任——关注基因工程的诞生和发展历程，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。
一、基因工程及其诞生与发展
1．基因工程的概念
(1)操作场所：生物体外。
(2)操作技术：转基因等技术。
(3)操作结果：赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(4)操作水平：DNA分子水平。
2．基因工程的诞生和发展
(1)基因工程的诞生
①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
②1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
③1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
④20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
⑤1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。
(2)基因工程的发展
①1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。
②1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
③1985年，穆里斯等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。
④1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。
⑤21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。
⑥2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。
二、重组DNA技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”
(1)来源：主要来自原核生物。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(3)结果：产生黏性末端或平末端。
(4)应用：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
(2)种类[填表]
种类比较 E．coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
特点 只能连接黏性末端 既可以连接黏性末端，又可以连接平末端
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)质粒
①质粒的本质：是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②质粒适于作基因运载体的特点
a．质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
b．携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
c．人工改造的质粒常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
(2)噬菌体、动植物病毒等。
三、DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
(1)DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
②DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液。
(2)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2．方法步骤
(1)研磨：取30 g洋葱切碎，倒入10 mL研磨液研磨。
(2)除杂：漏斗中垫上纱布过滤后，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液，也可以在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取上清液。
(3)提取：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。
方法一：用玻璃棒沿一个(填“一个”或“两个”)方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
方法二：10 000 r/min的转速下离心5 min，取沉淀物晾干。
(4)鉴定：
项目 A B
2 mol/L的NaCl溶液5 mL
丝状物或沉淀物 不加 加入
二苯胺试剂4 mL
沸水中加热5 min
现象 无色 蓝色
1．用不同的限制酶切割DNA分子可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
提示：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶，同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。
2．DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。
提示：不相同。DNA连接酶连接的是DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。
(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。 (√)
2．DNA聚合酶也可以用作重组DNA技术的工具。 (×)
提示：重组DNA技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，没有DNA聚合酶。
3．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。 (×)
提示：限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源DNA，使之失效，从而保护自身。
4．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。 (√)
5．DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。 (×)
提示：E．coli DNA连接酶不能连接平末端。
6．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。 (√)
基因工程的工具酶
1．限制性内切核酸酶
(1)作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面。
①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。
②能够切割特定序列中的特定位点。
(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。
(3)作用产物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时形成的，如图所示：
②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的，如图所示：
2．DNA连接酶
(1)作用：将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段“缝合”成新的DNA分子。
(2)连接方式：DNA连接酶可把黏性末端和平末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来，形成两个磷酸二酯键。DNA连接酶与碱基之间的氢键形成无关。
3．与DNA相关的五种酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
1．为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
2．限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？
提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E．coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。
1．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是( )
A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C．E．coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
B [DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A项错误；限制酶只能切割双链DNA片段而不能切割RNA，烟草花叶病毒的核酸为RNA，B项正确；E．coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C项错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D项错误。]
2．下列各种酶及其作用对应关系不正确的是( )
A．限制酶——识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
B．RNA聚合酶——与基因的特定位点结合，催化遗传信息的翻译
C．DNA连接酶——将分开的DNA片段通过特定末端连接在一起
D．DNA聚合酶——将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上
B [限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，A正确；RNA聚合酶与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录，B错误；DNA连接酶将分开的DNA片段通过特定的末端连接在一起，在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，C正确；DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键，D正确。]
几种酶的作用部位图解
(1)作用于a(磷酸二酯键)的酶：限制酶(断开)、DNA连接酶(形成)和DNA聚合酶(形成)。
(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶(断开)。
基因工程中常用的载体
1．特点
质粒是一种裸露的、结构简单、具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
2．本质
质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的小型DNA分子，不是细胞器。
3．质粒作为载体所具备的条件
条件 分析
稳定并能复制 目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因 便于重组DNA的鉴定和选择
无毒害作用 避免受体细胞受到损伤
4．标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。
将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体的受体细胞。如图所示：
细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如动植物病毒、噬菌体等。
(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
1．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( )
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切割位点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA的鉴定和选择
A [作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便于重组DNA的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。]
2．某细菌质粒如图所示，通过标记基因可以推知外源基因插入的位置，图示中的a、b、c是外源基因插入位置，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )
细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A．①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
A [①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，所以插入点是c；②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因正常而抗四环素基因被破坏，故插入点为b；③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏，故插入点为a。]
某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。
A酶切割产物(bp) b酶再次切割产物(bp)
2 100；1 400；1 000；500 1 900；200；800；600；1 000；500
本案例考查演绎与推理的科学思维。
(1)该DNA分子上有几个a酶识别和切割的位点？有几个b酶识别和切割的位点？(科学思维)
(2)a酶和b酶切出的黏性末端能相互连接吗？(科学思维)
提示：(1)该DNA分子上有3个a酶识别和切割的位点；有2个b酶识别和切割的位点。
(2)a酶和b酶切出的黏性末端相同，因此能相连。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 要 点 强 化 识 记
结论语句(1)基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。(2)重组DNA技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。(3)限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。(4)E．coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。(5)质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。(6)在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
1．下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是( )
A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B．限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA
C．限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同
D．限制酶只能从原核生物中提取
B [一种限制酶能识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子，既可以切割目的基因又可以切割质粒，体现了酶的专一性，A错误；限制酶与DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C错误；限制酶主要从原核生物中提取，D错误。]
2．下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．DNA连接酶连接的是两个DNA片段碱基对之间的氢键
B．DNA连接酶连接的是DNA单链上的磷酸和脱氧核糖
C．DNA连接酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端
D．E．coli DNA连接酶能将双链DNA片段互补的平末端连接起来
B [DNA连接酶连接的是两个DNA片段之间的磷酸二酯键，A错误；DNA连接酶连接的是DNA双链片段两个脱氧核苷酸之间的磷酸和脱氧核糖，B正确、C错误；E．coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，D错误。]
3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核(区)外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制
A [质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒；质粒作为载体时，应具有标记基因和多个限制酶切割位点；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制。]
4．下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精溶液可用来粗提取DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热
A [兔属于哺乳动物，其成熟红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，A项错误；DNA分子从细胞中被释放出来且除去蛋白质后是非常容易断裂的，如果太过剧烈的搅拌，DNA链可能会被破坏，因此沿一个方向轻柔搅拌的目的是获得较完整的DNA分子，B项正确；在预冷的体积分数为95%的酒精溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大，C项正确；将析出的DNA溶解在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要沸水浴加热才会呈现蓝色，D项正确。]
5．下表所示为4种限制酶的识别序列及其切割位点，请回答下列问题。
(1)从表中4种酶的切割位点看，可以切出平末端的酶是________。
(2)限制酶切割的DNA片段的缝合依靠的是________酶，它的作用是形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过________连接起来。
(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶________切割。
图1
图2
(4)在相关酶的作用下，图1中的甲与图2中的乙______________(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由：__________________________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)由表中4种限制酶的切割位点可知，SmaⅠ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段缝合时用DNA连接酶进行连接，形成磷酸二酯键；两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割，切割后形成链状DNA。(4)由图可知，甲和乙的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
[答案] (1)SmaⅠ (2)DNA连接 氢键 (3)EcoRⅠ (4)能 二者具有相同的黏性末端
14/14课时分层作业(12) 重组DNA技术的基本工具
题组一 基因工程及其诞生和发展
1．科学家经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体的DNA分子
B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向地改造生物的遗传性状
D [该题的关键词是“最终目的”，A、B、C三项都是基因工程的技术手段，这些手段的目的是定向改造生物的遗传性状，故选D项。]
2．(2022·福建厦门月考)下列有关基因工程诞生的说法，错误的是( )
A．基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的
B．工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能
C．遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据
D．基因工程必须在同物种间进行
D [基因工程又叫重组DNA技术，是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的，A正确；工具酶(限制酶和DNA连接酶)和载体的发现使基因工程的实施成为可能，B正确；尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码为基因的分离和合成提供了理论依据，与基因工程直接相关，C正确；1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，打破了物种间的障碍，实现物种间的基因交流，D错误。]
题组二 基因工程的工具酶
3．某DNA分子中含有某限制酶的一个识别序列，用该限制酶切割该DNA分子，可能形成的两个DNA片段是( )
序号 片段1 片段2
①
②
③
④
A．①② B．③④ C．①③ D．②④
B [限制酶识别序列的中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，若切割形成的是黏性末端，则黏性末端碱基应该互补配对。分析图中片段可知，③④中的片段可能由同一种限制酶切割所得，B正确。]
4．下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E．coli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸
C [DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来。E．coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。]
5．根据图表的内容回答下列问题。
几种限制酶识别序列切割位点
(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到_________种DNA片段。如果将质粒载体和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_________、_________、_________。
(2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是_________、_________。
[解析] (1)含目的基因的DNA分子上含有2个EcoRⅠ和1个PstⅠ的酶切位点，3个切点全部切开，则形成4种DNA片段。质粒与含目的基因的DNA片段都用EcoRⅠ酶切，目的基因两端和质粒切口处的黏性末端相同，只考虑两个DNA片段相连，则会形成3种连接产物，即质粒与质粒相连、质粒与目的基因相连、目的基因与目的基因相连。(2)为了防止任意连接，可选用EcoRⅠ和SmaⅠ两种酶同时切割。
[答案] (1)4 质粒载体—质粒载体连接物 目的基因—目的基因连接物 质粒载体—目的基因连接物 (2)EcoRⅠ SmaⅠ
题组三 基因工程的载体
6．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是。如图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是( )
A B C D
A [用限制酶MunⅠ切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体。C、D质粒含有标记基因，但用限制酶切割后会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体。]
7．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，ampr为氨苄青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是( )
A B C D
C [A项破坏了复制必需的序列。B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。]
题组四 DNA的粗提取与鉴定
8．以洋葱为材料进行DNA的粗提取与鉴定实验，相关叙述错误的是( )
A．可将洋葱换成哺乳动物的血液进行该实验
B．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液，有利于去除杂质
C．向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液，有利于获得较纯净的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA时进行沸水浴，有利于显色反应的发生
A [哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体等，提取不到DNA，不宜作为该实验的材料，A错误；在2 mol/L 的NaCl溶液中，DNA的溶解度较大，进而可去除不溶的杂质，B正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液，有利于获得较纯净的DNA，C正确；DNA与二苯胺试剂在沸水浴下反应呈蓝色，D正确。]
9．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃、另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
(1)DNA粗提取结果如表：
材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
(注：“＋”越多表示蓝色越深)
(2)该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同________对DNA提取量的影响”。
(3)DNA的鉴定可用________试剂在________的条件下进行。
(4)根据实验结果分析：
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量更________(填“多”或“少”)。
结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从________中提取的DNA量最多。
②针对结论1，请提出合理的解释：低温抑制了________的活性，DNA降解速度减慢。
[解析] (2)根据表格可知，该实验的自变量是温度和不同材料，因此该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同(保存)温度对DNA提取量的影响”。(3)鉴定DNA时可用二苯胺试剂，在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。(4)①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，与二苯胺进行沸水浴加热后蓝色更深，说明DNA的提取量更多。结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多，因此其与二苯胺进行沸水浴加热后蓝色最深。②出现结论1的原因是低温抑制了(核酸水解)酶的活性，DNA降解速度减慢。
[答案] (2)(保存)温度 (3)二苯胺 沸水浴 (4)①多 蒜黄 ②(核酸水解)酶
10．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③
C．①④②③ D．①④③②
C [限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。]
11．限制酶BamHⅠ和BglⅡ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为G↓GATCC和A↓GATCT。研究中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅡ切割质粒，并用DNA连接酶连接得到重组质粒。下列相关叙述正确的是( )
A．限制酶切割DNA过程中会将碱基对之间的氢键切断
B．含目的基因的DNA片段经BamHⅠ切割后形成的是平末端
C．经BamHⅠ和BglⅡ两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别
D．分别用BamHⅠ和BglⅡ两种限制酶切割，能保证目的基因定向插入质粒
C [限制酶切断的是磷酸二酯键，A错误；含目的基因的DNA片段经BamHⅠ切割后形成的是黏性末端，B错误；两种限制酶切割产生的黏性末端互补，经过DNA连接酶处理后获得的重组序列是，该序列不能被BamHⅠ和BglⅡ识别，C正确；BamHⅠ和BglⅡ两种限制酶切割产生的黏性末端互补，仍然会出现自身环化和反向连接现象，不能保证目的基因定向插入质粒，D错误。]
12．(不定项)如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析以下说法正确的是( )
限制酶 BamH Ⅰ EcoR Ⅰ Hind Ⅱ
识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC GTY↓RAC
限制酶 Kpn Ⅰ Sau3A Ⅰ Sma Ⅰ
识别序列和切割位点 GGTAC↓C ↓GATC CCC↓GGG
(注：Y表示C或T，R表示A或G)
A．一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列
B．限制酶的切割位点一定位于识别序列的内部
C．不同限制酶切割后可形成相同的黏性末端
D．限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端
CD [由于Y表示C或T，R表示A或G，说明一种限制性内切核酸酶能识别一种或多种特定的脱氧核苷酸序列，A错误；限制酶的切割位点不一定在识别序列的内部，如Sau3AⅠ，B错误；不同限制酶切割后形成的黏性末端不一定相同，如EcoRⅠ、HindⅡ、KpnⅠ切割后形成的黏性末端各不相同，而BamHⅠ和Sau3AⅠ切割后形成的黏性末端相同，C正确；限制酶切割后可形成平末端，D正确。]
13．(不定项)(2021·南京模拟)下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，不正确的是( )
A．用蒸馏水使家兔的红细胞涨破，可获取富含DNA的滤液
B．植物材料需先用洗涤剂破坏细胞壁再吸水胀破，释放DNA
C．DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2 mol/L的NaCl溶液
D．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴
ABD [兔属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；植物材料需先用洗涤剂溶解细胞膜，B错误；DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精和0.14 mol/L的NaCl溶液，而溶于2 mol/L的NaCl溶液，C正确；将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，沸水浴冷却后呈蓝色，D错误。]
14．目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于____________________________。
(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。_____________________________________________________________________。
(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶的作用恢复________键，成功地获得了重组质粒，这说明____________________
____________________________________________________________________。
(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是____________________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是________。
[解析] (1)构建人工质粒时要有抗性基因作为标记基因，用于重组DNA的鉴定和筛选或便于鉴别目的基因是否导入受体细胞。(2)EcoRⅠ只能识别核酸序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。根据限制酶的识别序列和切割位点进行解答。(3)DNA连接酶的作用是恢复磷酸二酯键；由题干可知，两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同，这样才能进行相应的碱基互补配对。(4)与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素；图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是能抗氨苄青霉素和四环素的人工质粒即pBR322质粒。
[答案] (1)重组DNA的鉴定和筛选(鉴别目的基因是否导入受体细胞)
(2)
(3)磷酸二酯 两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同
(4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322质粒
4/8课时分层作业(12) 重组DNA技术的基本工具
题组一 基因工程及其诞生和发展
1．科学家经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体的DNA分子
B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向地改造生物的遗传性状
2．(2022·福建厦门月考)下列有关基因工程诞生的说法，错误的是( )
A．基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的
B．工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能
C．遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据
D．基因工程必须在同物种间进行
题组二 基因工程的工具酶
3．某DNA分子中含有某限制酶的一个识别序列，用该限制酶切割该DNA分子，可能形成的两个DNA片段是( )
序号 片段1 片段2
①
②
③
④
A．①② B．③④ C．①③ D．②④
4．下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E．coli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸
5．根据图表的内容回答下列问题。
几种限制酶识别序列切割位点
(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到_________种DNA片段。如果将质粒载体和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_________、_________、_________。
(2)为了防止目的基因和质粒表达载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是_________、_________。
题组三 基因工程的载体
6．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是。如图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是( )
A B C D
7．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，ampr为氨苄青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性内切核酸酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是( )
A B C D
题组四 DNA的粗提取与鉴定
8．以洋葱为材料进行DNA的粗提取与鉴定实验，相关叙述错误的是( )
A．可将洋葱换成哺乳动物的血液进行该实验
B．向含DNA的滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液，有利于去除杂质
C．向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液，有利于获得较纯净的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA时进行沸水浴，有利于显色反应的发生
9．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃、另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
(1)DNA粗提取结果如表：
材料保存温度 花菜 辣椒 蒜黄
20 ℃ ＋＋ ＋ ＋＋＋
－20 ℃ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋
(注：“＋”越多表示蓝色越深)
(2)该探究性实验课题的名称可能是“探究不同材料和不同________对DNA提取量的影响”。
(3)DNA的鉴定可用________试剂在________的条件下进行。
(4)根据实验结果分析：
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量更________(填“多”或“少”)。
结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从________中提取的DNA量最多。
②针对结论1，请提出合理的解释：低温抑制了________的活性，DNA降解速度减慢。
10．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③
C．①④②③ D．①④③②
11．限制酶BamHⅠ和BglⅡ是两种常见的工具酶，它们的识别序列及切割位点依次为G↓GATCC和A↓GATCT。研究中用BamHⅠ切割DNA获得目的基因，用BglⅡ切割质粒，并用DNA连接酶连接得到重组质粒。下列相关叙述正确的是( )
A．限制酶切割DNA过程中会将碱基对之间的氢键切断
B．含目的基因的DNA片段经BamHⅠ切割后形成的是平末端
C．经BamHⅠ和BglⅡ两种酶处理得到的重组质粒不能再被这两种酶所识别
D．分别用BamHⅠ和BglⅡ两种限制酶切割，能保证目的基因定向插入质粒
12．(不定项)如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析以下说法正确的是( )
限制酶 BamH Ⅰ EcoR Ⅰ Hind Ⅱ
识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC GTY↓RAC
限制酶 Kpn Ⅰ Sau3A Ⅰ Sma Ⅰ
识别序列和切割位点 GGTAC↓C ↓GATC CCC↓GGG
(注：Y表示C或T，R表示A或G)
A．一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列
B．限制酶的切割位点一定位于识别序列的内部
C．不同限制酶切割后可形成相同的黏性末端
D．限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端
13．(不定项)(2021·南京模拟)下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，不正确的是( )
A．用蒸馏水使家兔的红细胞涨破，可获取富含DNA的滤液
B．植物材料需先用洗涤剂破坏细胞壁再吸水胀破，释放DNA
C．DNA不溶于95%的冷酒精，但可溶于2 mol/L的NaCl溶液
D．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴
14．目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于____________________________。
(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。_____________________________________________________________________。
(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶的作用恢复________键，成功地获得了重组质粒，这说明____________________
____________________________________________________________________。
(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是____________________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是________。
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