(共80张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
第3章 基因工程
课标内容要求
核心素养对接
必备知识·自主预习储备
01
受体细胞性状
预期表达产物
Bt抗虫蛋白
基因
已知结构
功能清晰
序列信息
Bt抗虫蛋白
DNA测序
遗传序列
序列比对
DNA半保留复制
解旋酶
模板
DNA聚合酶
3′
变性
90 ℃
单链
复性
50 ℃
碱基互补配对
延伸
72 ℃
DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
3′
PCR扩增仪
电泳缓冲液
沸水浴
核酸染料
电泳槽
1 mm
微量移液器
受体细胞
表达
启动子
目的基因
终止子
复制原点
标记基因
一定
限制酶
同种
末端
DNA连接
维持稳定
表达
子房
花粉管通道
胚囊
双子叶
裸子
T DNA
染色体DNA
Ti质粒的T DNA
显微注射
受精卵
Ca2＋
PCR
抗原—抗体
√
×
×
√
×
√
关键能力·重难探究达成
02
核心点一
核心点二
应用创新·问题情境探究
03
学习效果·随堂评估自测
04
点击右图进入…
课
时
分
层
作
业
谢谢观看 THANK YOU!
W
5'
5
3'
3
待扩增的DNA片段
5
5
5'
3'
3
5'
3'
5'
浅仰芹
变性
(90℃以上)
目的基因DNA受热变性后解聚为单链
重复循环
复性
两种引物通过碱基互补配对与两条
(50℃左右)
单链DNA结合
延伸
以单链DNA为模板，在耐高温的DNA
(72℃左右)
聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱
氧核苷酸加到引物的3端
我仰
h
团结守纪勤学春
完整的目
的基因
完整的目
的基因
第1轮
第2轮
第3轮
分子量标准参照物R1R2
R1+R2
负极
bp
1000
800
600
400
200
十
正极
缓冲液
目的基因的
筛选合适的目的基因
筛选与获取
利用PCR技术扩增目的基因
组成：启动子、目的基因
基因表达载
终止子、标记基因等
DNA
体的构建
构建：限制酶切割、DNA
基因工程的基太操作程序
连接酶连接
植物细胞：花粉管通道法、
增电鉴
段扩及泳定
农杆菌转化法
将目的基因导
入受体细胞
动物细胞：显微注射法
原核生物细胞：Ca2处理法等
目的基因的
分子水平的检测
检测与鉴定
个体生物学水平的鉴定第2节 基因工程的基本操作程序
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 1．科学思维——结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。2．生命观念——运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。
一、目的基因的筛选与获取(第一步)
1．目的基因
(1)概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。
2．筛选合适的目的基因
(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
(3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理：DNA半保留复制。
(2)DNA复制所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
(3)过程
基于PCR的过程，回答下列问题：
过程Ⅰ为变性，该阶段的温度为90 ℃以上，目的是使双链DNA解聚为单链。
过程Ⅱ为复性，该阶段的温度为50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
过程Ⅲ为延伸，该阶段的温度为72 ℃左右，该过程需要在耐高温的DNA聚合酶的催化下，利用4种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则从子链的3′端延伸合成新的子链DNA。
(4)仪器：PCR扩增仪。
(5)鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳。
①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2% 的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
二、基因表达载体的构建(第二步)
1．基因表达载体的作用
(1)使基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
基于基因表达载体的结构模式图，回答下列问题：
基因表达载体的模式图
(1)[A]启动子，RNA聚合酶识别和结合的部位，可以驱动基因转录出mRNA，[B]目的基因。
(2)[C]终止子，转录停止的部位。
(3)[D]复制原点，[E]标记基因。
3．构建过程
(1)用一定的限制酶切割载体。
(2)用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
三、将目的基因导入受体细胞(第三步)
1．转化
指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．将目的基因导入受体细胞的方法
(1)目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
a．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
b．在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
②农杆菌转化法
a．农杆菌的特点：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物；农杆菌的Ti质粒上的T DNA能够整合到所侵染细胞的染色体DNA上。
b．转化方法：将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA中，让农杆菌侵染植物细胞。
(2)目的基因导入动物细胞
①常用方法：显微注射法。
②常用受体细胞：受精卵。
(3)目的基因导入微生物细胞
①方法：用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核生物(使用最广泛的是大肠杆菌)。
四、目的基因的检测与鉴定(第四步)
1．分子水平的检测
(1)通过PCR等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA。
(2)从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译成蛋白质等。
2．个体生物学水平的鉴定：如饲喂法等。
1．确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度，要从个体生物学水平进行鉴定，具体怎样操作？
提示：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫的生活情况。
2．如果将某种抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递遵循孟德尔分离定律。判断依据是什么？
提示：仅一条染色体含有抗性基因，另一条没有其等位基因。
(正确的打“√”，错误的打“×”)
1．从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。 (√)
2．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。 (×)
提示：Taq酶是耐高温的DNA聚合酶。
3．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。 (×)
提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
4．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。 (√)
5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。 (×)
提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。
6．可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。 (√)
PCR
1．PCR扩增的过程(如图)
2．PCR扩增的计算：理论上DNA数目呈指数扩增。
(1)若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为2n个。
(2)若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。
3．比较PCR扩增和体内DNA复制的异同
项目 DNA复制 PCR
解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温作用下变性解旋
场所 细胞内(主要在细胞核内) 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、普通的DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶
温度条件 细胞内温和条件 需控制温度，在较高温度下进行
合成的对象 DNA分子 DNA片段或目的基因
相同点 ①模板：均需要DNA的两条单链作为模板②原料：均为4种脱氧核苷酸③酶：均需DNA聚合酶
1．PCR过程中为什么需要引物？
提示：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的聚合酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。
2．某同学认为不同的DNA片段PCR过程变性时温度是不同的，你认为他的说法正确吗？说明你的理由。
提示：正确。变性的目的是通过升高温度破坏氢键，将DNA分子双链变成单链，不同片段的DNA分子中氢键的数量不同导致稳定性不同，因此所需的温度不同。
3．在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？
提示：第3轮
1．下列关于PCR的叙述，正确的是( )
A．PCR是体外复制DNA技术，关键酶是解旋酶和DNA聚合酶
B．DNA聚合酶从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸
C．第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段
D．延伸过程需要酶、ATP和4种核糖核苷酸
C [PCR体外复制DNA不需要解旋酶，需要耐高温的DNA聚合酶，A错误；DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，B错误；第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段，这段固定长度的序列的数量呈指数扩增，C正确；PCR是在较高温度条件下进行的，该过程需要耐高温的DNA聚合酶，且PCR反应的产物是DNA，因此原料是4种游离的脱氧核苷酸，而不是核糖核苷酸，也不需要ATP，D错误。]
2．如图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是( )
A．片段a、b、c的长度均相同
B．片段a、b只是第一次循环的产物
C．片段c最早出现在第二次循环的产物中
D．经过30次循环后，片段c的数量为230
C [图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A项不正确。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B项不正确。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则c最早出现在第二次循环的产物中，C项正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，故D项不正确。]
3．(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。请回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________________，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是__________________________。
(3)为了作出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与________特异性结合。
(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指__________________________________
____________________________________________________________________。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
[解析] (1)为了检测病人是否感染了某种病原菌，首先应采集病人组织样本，然后从病人组织样本中提取DNA，利用PCR扩增DNA片段后，再分析PCR扩增结果，所以正确的操作顺序是④②③①。(2)PCR技术中用到的酶是耐高温的DNA聚合酶，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性和延伸三步。复性是温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)PCR反应所用引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计，要检测是否感染病原菌，应根据该病原菌的DNA碱基序列合成引物，这样PCR反应所用的引物会与某种病原菌的DNA特异性结合。(4)PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。
[答案] (1)④②③① (2)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶) 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 (3)病原菌DNA (4)在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定
1．将目的基因导入受体细胞的方法
生物类型 方法 受体细胞 转化过程 特点
植物 农杆菌转化法 体细胞或受精卵 目的基因插入Ti质粒的T DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达 适用于双子叶植物和裸子植物
花粉管通道法 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 适用于任何开花植物
动物 显微注射法 受精卵 目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物 是采用最多、最有效的方法
微生物 Ca2＋处理法 原核生物 Ca2＋处理微生物细胞→使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→一定温度下促使该细胞吸收DNA分子 原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，从而成为最常用的受体细胞
2．目的基因的检测与鉴定
3．常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法
转基因生物 检测方法 观察目标
抗虫植物 饲喂害虫 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
1．农杆菌转化法为什么要将目的基因插入农杆菌质粒的T DNA片段上？
提示：Ti质粒的T DNA片段可以整合到受体细胞的染色体上。
2．用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞，与农杆菌转化法相比有什么优点？
提示：(1)操作简便；(2)直接将目的基因导入受精卵，无须组织培养即可获得植株。(答出一个即可，其他答案合理也可)
3．将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？
提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。
1．下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是( )
A．可利用花粉管通道法培育转基因植物
B．用Ca2＋处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态
C．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵
D．将目的基因转入微生物细胞常用显微注射法
D [可利用花粉管通道法培育转基因植物，A正确；用Ca2＋处理大肠杆菌，使之处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性易于表现，C正确；将目的基因转入动物细胞常用显微注射法，将目的基因转入微生物细胞常用Ca2＋处理法，D错误。]
2．目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是( )
A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA
B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
C [目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物(染色体)DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，A错误；PCR可用于检测目的基因是否转录，检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术，B错误；抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体生物学水平的鉴定，D错误。]
在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同识别序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。
本案例考查学生演绎与推理的科学思维及对实验结果交流与讨论的科学探究能力。
(1)该载体是环形DNA还是链状DNA？说明理由。(科学思维)
(2)两种限制酶在载体上的酶切位点各有几个？(科学思维)
(3)限制酶R1与R2的酶切位点的最短距离是多少？(科学思维)
提示：(1)该载体应为环形DNA，因为仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度为800 bp的DNA片段。
(2)两种限制酶在载体上的酶切位点各有1个。
(3)限制酶R1与R2的酶切位点的最短距离为200 bp。
[课堂小结]
知 识 网 络 构 建 要 点 强 化 识 记
结论语句(1)基因工程的基本操作程序有：①目的基因的筛选与获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。(2)PCR反应液中需要提供DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。(3)PCR反应中每次循环一般可分为变性、复性、延伸三步。(4)基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子以及标记基因等。(5)将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法。(6)将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。
1．基因工程主要操作步骤的顺序是( )
①基因表达载体的构建
②将目的基因导入受体细胞
③目的基因的检测与鉴定
④目的基因的获取
A．③②④① B．②④①③ C．④①②③ D．③④①②
C [基因工程的主要操作步骤顺序是：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。]
2．(2021·辽宁省适应性测试) PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，与人体细胞内DNA分子复制相比，下列有关叙述错误的是( )
A．都遵循碱基互补配对原则
B．DNA聚合酶作用的最适温度不同
C．都是边解旋边复制的过程
D．复制方式都是半保留复制
C [DNA分子的体外复制和体内复制都遵循碱基互补配对原则，A正确；PCR技术是在较高温度条件下进行的，因此PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，B正确；PCR技术是在较高温度条件下打开双链后进行扩增的，不是边解旋边复制的，C错误；DNA复制方式都是半保留复制，D正确。]
3．(2022·山东枣庄月考)以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是( )
A．基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的
B．表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA
C．基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等
D．表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因
B [基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，D错误。]
4．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是( )
A．培育“黄金大米”可用花粉管通道法导入目的基因
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2＋处理法
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
A [水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，C正确；将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法，D正确。]
5．如图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图。请据图回答下列问题。
(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在________酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在________的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的______________序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的________序列，再通过化学方法合成所需基因。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有________、________、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为________________。
(4)在基因工程中，常用Ca2＋处理D，其目的是_______________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)利用逆转录法合成目的基因的过程是以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，再通过化学方法合成所需基因。(2)PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。(3)目的基因和载体结合，形成基因表达载体。(4)在利用大肠杆菌作受体细胞时，需要先用Ca2＋处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。
[答案] (1)逆转录 DNA聚合酶 氨基酸 脱氧核苷酸 (2)引物 模板(A基因) (3)基因表达载体 (4)使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态
15/15课时分层作业(13) 基因工程的基本操作程序
题组一 目的基因的筛选与获取
1．下列有关获取目的基因的叙述错误的是( )
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
A [目的基因主要指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因可作为培育转基因抗虫棉用到的目的基因，C正确；随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。]
2．下列关于PCR的说法，错误的是( )
A．PCR是体外复制DNA的技术
B．PCR过程中只需要一个模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料
C．Taq酶要具有耐高温的特点
D．PCR利用的是DNA的热变性原理
B [PCR是体外复制DNA的技术，A正确；PCR过程中需要一种模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料，还需要缓冲液、Taq酶等，B错误；Taq酶具有耐高温的特点，C正确；PCR利用的是DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，D正确。]
3．基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。请回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解聚为单链的条件是__________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(2)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
[解析] (1)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90 ℃以上进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(2)在PCR过程中，要加热至90 ℃以上，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
[答案] (1)解旋酶 加热至90 ℃以上 氢键
(2)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
题组二 基因表达载体的构建
4．图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
图(a)
图(b)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_________________________________________________
___________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是_______________________________________
___________________________________________________________________。
图(c)
[解析] (1)由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切核酸酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的上游，终止子应位于目的基因的下游，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。
[答案] (1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
题组三 将目的基因导入受体细胞
5．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，正确的是( )
A．可以通过显微注射法直接将目的基因导入动物的受精卵中
B．通过基因工程大量获得胰岛素时，受体细胞选择大肠杆菌比酵母菌更有优势
C．可以用PEG处理大肠杆菌将目的基因导入其细胞内
D．可以使用病毒将目的基因导入受体细胞
D [目的基因导入受体细胞前必须进行基因表达载体的构建，不能直接将目的基因导入，A错误；酵母菌细胞中有多种细胞器，作为受体细胞生产胰岛素(分泌蛋白)比大肠杆菌更有优势，B错误；大肠杆菌作为受体细胞时应使用Ca2＋进行处理，C错误；可以利用部分病毒将自身DNA整合到宿主细胞染色体上的特点构建病毒表达载体，并通过病毒的侵染将目的基因导入相关受体细胞，D正确。]
6．基因工程中，受体细胞的不同，导入目的基因的方法也不同。请回答下列问题。
(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入________细胞，具体操作时，先要将目的基因插入农杆菌________质粒的T DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞。农杆菌在自然条件下，不容易感染________植物。农杆菌侵染植物，能够将目的基因插入植物细胞的______________上。
(2)将重组质粒导入动物细胞，常采用________的方法。若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以，用表达载体转化大肠杆菌时，常先用________处理大肠杆菌，使较多的细胞成为________细胞以利于表达载体的进入。
(3)目的基因导入受体细胞引起生物性状的改变，属于可遗传变异中的________(变异类型)。
[解析] (1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入植物细胞，具体操作时，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞。农杆菌在自然条件下，不容易感染单子叶植物。农杆菌侵染植物后，能够将Ti质粒上的T DNA携带的目的基因插入植物细胞的染色体DNA上。
(2)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射法。若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以，用表达载体转化大肠杆菌时，常先用Ca2＋处理大肠杆菌，使较多的细胞成为感受态细胞以利于表达载体的进入。(3)基因工程的原理为基因重组。
[答案] (1)植物 Ti 单子叶 染色体DNA
(2)显微注射 Ca2＋ 感受态
(3)基因重组
题组四 目的基因的检测与鉴定
7．下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达( )
A．在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B．通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C．提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测
D．抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
A [检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。①分子水平上的检测：通过PCR等技术检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原—抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定：检测是否具有抗性及抗性程度；检测基因工程产品与天然产品的活性是否相同。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，故选A。]
8．基因工程是在DNA分子水平上进行设计操作的，在基因工程操作的基本步骤中，一定不进行碱基互补配对的是( )
A．利用PCR技术扩增目的基因
B．目的基因与载体的黏性末端结合
C．抗原—抗体杂交检测目的基因表达
D．DNA探针检测受体细胞的目的基因
C [抗原—抗体杂交利用的是抗原与抗体特异性结合的原理，没有进行碱基互补配对。]
9．为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是( )
A．①＋③ B．①＋② C．③＋② D．③＋④
B [图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，即B正确，A、C、D错误。]
10．利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列叙述正确的是( )
A．过程①需使用原料是四种核糖核苷酸
B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因
C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备
D．过程④可利用PCR技术鉴定目的基因是否已导入受体细胞
D [过程①是以mRNA为模板合成DNA的过程，即逆转录过程，需要使用的原料是四种游离的脱氧核苷酸，A错误；过程②表示利用PCR技术，扩增目的基因，在此过程中，不需要解旋酶，是通过控制温度来达到解旋的目的，B错误；利用氯化钙处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，C错误；检测目的基因是否成功导入受体细胞的染色体DNA上，可以采用PCR技术，D正确。]
11．(不定项)(2021·河北衡水中学检测)RT PCR是将RNA的逆转录(RT)和cDNA聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。下列说法错误的是( )
A． 该技术中遗传信息的流动途径是RNA→DNA→DNA
B．该技术中需要逆转录酶、解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．该技术的前提是要以RNA全部碱基序列为模板设计并合成引物
D．该技术可用来检测组织细胞中基因的表达水平或RNA病毒的含量
BC [由分析可知：该技术包括从mRNA到cDNA的逆转录过程和从cDNA到DNA的扩增过程，故遗传信息的流动途径是RNA→DNA→DNA，A正确；该过程需要用到逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，无需用到解旋酶，B错误；该技术中PCR扩增的DNA为cDNA，利用PCR技术扩增目的基因片段的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，C错误；RT PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列，D正确。]
12．(不定项)如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是( )
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
AD [构建表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，故A项正确。③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA不是整合到受体细胞的染色体上，而是整合到受体细胞染色体的DNA分子上，故B项错误。染色体上含有目的基因，但目的基因也可能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，故C项错误。若植株表现出抗虫性状，说明目的基因成功导入受体细胞并成功表达，该过程中发生了基因重组，为可遗传变异，故D项正确。]
13．农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T DNA插入植物基因组中。图示为利用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图回答下列问题。
(1)剪除Ti质粒的某些片段、替换复制原点O与添加抗生素的抗性基因T的过程①中，需用多种限制酶处理，原因是_________________________，需用________________“缝合”双链DNA片段的平末端。
(2)目的基因是指________________。由过程②形成的基因表达载体中， 目的基因的上游具有________，它是________识别和结合的部位。
(3)过程③常用________处理使农杆菌成为感受态细胞。抗生素抗性基因T的作用是________________________________________。
(4)可通过________技术检测试管苗的染色体DNA上是否插入了目的基因。
[解析] (1)Ti质粒具有多种限制酶切割位点，不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列。连接平末端应选用T4 DNA连接酶。(2)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。目的基因的首端具有启动子，以便于RNA聚合酶识别和结合。(3)过程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)处理农杆菌，以增大农杆菌细胞壁的通透性。抗生素抗性基因T用于检测受体细胞中是否含有基因表达载体。(4)检测农杆菌和愈伤组织细胞中是否有目的基因常采用PCR技术。
[答案] (1)不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列 T4 DNA连接酶 (2)编码蛋白质的基因 启动子 RNA聚合酶 (3)Ca2＋(CaCl2溶液) 用于鉴定和筛选导入了基因表达载体的农杆菌 (4)PCR
8/8课时分层作业(13) 基因工程的基本操作程序
题组一 目的基因的筛选与获取
1．下列有关获取目的基因的叙述错误的是( )
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
2．下列关于PCR的说法，错误的是( )
A．PCR是体外复制DNA的技术
B．PCR过程中只需要一个模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料
C．Taq酶要具有耐高温的特点
D．PCR利用的是DNA的热变性原理
3．基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。请回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解聚为单链的条件是__________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(2)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
题组二 基因表达载体的构建
4．图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
图(a)
图(b)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_________________________________________________
___________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是_______________________________________
___________________________________________________________________。
图(c)
题组三 将目的基因导入受体细胞
5．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，正确的是( )
A．可以通过显微注射法直接将目的基因导入动物的受精卵中
B．通过基因工程大量获得胰岛素时，受体细胞选择大肠杆菌比酵母菌更有优势
C．可以用PEG处理大肠杆菌将目的基因导入其细胞内
D．可以使用病毒将目的基因导入受体细胞
6．基因工程中，受体细胞的不同，导入目的基因的方法也不同。请回答下列问题。
(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入________细胞，具体操作时，先要将目的基因插入农杆菌________质粒的T DNA中，然后用该农杆菌感染植物细胞。农杆菌在自然条件下，不容易感染________植物。农杆菌侵染植物，能够将目的基因插入植物细胞的______________上。
(2)将重组质粒导入动物细胞，常采用________的方法。若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以，用表达载体转化大肠杆菌时，常先用________处理大肠杆菌，使较多的细胞成为________细胞以利于表达载体的进入。
(3)目的基因导入受体细胞引起生物性状的改变，属于可遗传变异中的________(变异类型)。
题组四 目的基因的检测与鉴定
7．下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达( )
A．在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B．通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C．提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测
D．抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
8．基因工程是在DNA分子水平上进行设计操作的，在基因工程操作的基本步骤中，一定不进行碱基互补配对的是( )
A．利用PCR技术扩增目的基因
B．目的基因与载体的黏性末端结合
C．抗原—抗体杂交检测目的基因表达
D．DNA探针检测受体细胞的目的基因
9．为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是( )
A．①＋③ B．①＋② C．③＋② D．③＋④
10．利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列叙述正确的是( )
A．过程①需使用原料是四种核糖核苷酸
B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因
C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备
D．过程④可利用PCR技术鉴定目的基因是否已导入受体细胞
11．(不定项)(2021·河北衡水中学检测)RT PCR是将RNA的逆转录(RT)和cDNA聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。下列说法错误的是( )
A． 该技术中遗传信息的流动途径是RNA→DNA→DNA
B．该技术中需要逆转录酶、解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．该技术的前提是要以RNA全部碱基序列为模板设计并合成引物
D．该技术可用来检测组织细胞中基因的表达水平或RNA病毒的含量
12．(不定项)如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是( )
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
13．农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T DNA插入植物基因组中。图示为利用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图回答下列问题。
(1)剪除Ti质粒的某些片段、替换复制原点O与添加抗生素的抗性基因T的过程①中，需用多种限制酶处理，原因是_________________________，需用________________“缝合”双链DNA片段的平末端。
(2)目的基因是指________________。由过程②形成的基因表达载体中， 目的基因的上游具有________，它是________识别和结合的部位。
(3)过程③常用________处理使农杆菌成为感受态细胞。抗生素抗性基因T的作用是________________________________________。
(4)可通过________技术检测试管苗的染色体DNA上是否插入了目的基因。
8/8
