3.1.1 重组DNA技术的基本工具 课件（42张ppt）-高二生物学（人教版2019选择性必修3）
文档属性
| 名称 | 3.1.1 重组DNA技术的基本工具 课件（42张ppt）-高二生物学（人教版2019选择性必修3） |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 1.8MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-08-08 19:07:20 | ||
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文档简介
(共42张PPT)
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植
过程中,常常会受到一些害虫的侵袭,其中以棉铃 虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之 一,严重时,甚至能使一片棉田绝收。大量施用农 药杀虫不仅会提高生产成本,还可能造成农产品 和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害 的棉花新品种,这一问题就会迎刀而解,我国拥有
自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景
下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出 抗虫棉,基因工程却可以呢 基因工程是如何进行 操作的 它给我们的生产和生活带来了怎样的影 响
普通棉花和转基因抗虫棉
为了棉花姓“中国
●1992年 ，一场史无前例的棉铃 灾害吞噬着中国的棉田 ，我国棉花产
业遭遇灭顶之灾；
● 国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术 ，到1999年外国抗虫棉已占领我国 95%的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速流失。
●1998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种—— 中棉 所29，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%；
●2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种—— 中棉所4 1，该品种能够缓解棉铃虫抗药性，
我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家！
第3章 基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物 新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。 从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施 工的，因此又叫作重组DNA技术。
( 1)原理： 基因重组。
(2)操作水平： 分子水平。
(3)操作环境： 生物体外。
(4)操作对象： 基因。
( 5)结果： 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 新的生物类型和生物制品。
1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是 DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年， 埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。 2年后，桑格首次完成了 对胰岛素氨基酸序列的测定。
1953年， 沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复 制的假说。
1958年， 梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克 里克提出中心法则。
1961年， 尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。 截至1966年， 64个密码子均被成功破译。
1967年， 科学家发现， 在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可 以在细菌细胞间转移。
科技探索之路 基因工程的诞生和发展
科技探索之路 基因工程的诞生和发展
1970年， 科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶(简称限制酶)。
20世纪70年代初， 多种限制酶、 DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这 些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1972年， 伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功构建了第一个体外重 组DNA分子。
1973年， 科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入 受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。 至此，基因工程正式问世。
1977年， 桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提 供了可能。此后， DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年， 第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成 为世界各国研究和投资开发的热点。
1983年， 科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后， 基因工程进入了迅速发展的阶段。
21世纪以来， 科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大 量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年， 华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术— —CRISPR (成簇规律间隔短回文重复)技术编辑了哺乳动物基因组。该技 术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
1984年， 我国科学家朱作言领导的团队培育出世 界上第一条转基因鱼。
1985年， 穆里斯等人发明了PCR，为获取目的基因 提供了有效手段。
1990年， 人类基因组计划启动。 2003年，该计划 的测序任务顺利完成。
科技探索之路 基因工程的诞生和发展
第1节 重组DNA技术的基本工具
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木
瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家
通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因
番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子
进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门
的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些
“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特
征呢？ 非转基因番木瓜 与转基因番木瓜
分子手术刀 限制性内切核酸酶： 准确切割DNA分子
DNA连接酶：将DNA片段连接起来
载体：将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
)
)
右
左
(
(
从社会中来
将体外重组好的 DNA分子导入受体 细胞
将DNA片
段连接起 来
重组DNA技术所需的三种基本工具
准确切割 DNA分子
“分子运输车”
“分子缝合针”
“分子手术刀”
2.为什么一种生物的基因可以在另一种生
物细胞内表达？
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位
② 遗传信息的传递都遵循中心法则
③ 生物界共同一套遗传密码
② DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
① DNA是生物的主要遗传物质
思考讨论
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.简称： 限制酶
2.来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要 作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过 程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。 当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保 证自身安全。
所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：
切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
3.作用： 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中
特定部位的磷酸二酯键断开。 (特异性)
4.作用部位： 磷酸二酯键，限制酶只
切割两个核苷酸之间的 磷酸二酯键。
G
磷酸二酯键
A
T
C
G
3
’
磷 酸 二 酯 键
5’
4’
3’
1’
2’
4’
3’
1’
2’
3
’
5
’
5
’
A
G
A
C
5’
T
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
5.限制酶的命名：
用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略 语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从 大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如 果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成 EcoRI。
两种常用的限制酶： EcoRⅠ和SmaⅠ
●EcoRⅠ：大肠杆菌(Escherichiacoli) R型菌株中分离出的 第一个限制酶；
●SmaⅠ：粘质沙雷氏菌 (Serratiamarcescens) 中分离出的 第一个限制酶。
粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcesens)中分离的
第一种限制酶即 SmaⅠ
_______
仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？
思 考
EcoRⅠ ……G-A-A-T-T-C……
……C-T-T-A-A-G……
HindⅢ ……A-A-G-C-T-T……
……T-T-C-G-A-A……
BamHⅠ ……G-G-A-T-C-C……
……C-C-T-A-G-G……
TaqⅠ ………T-C-G-A………
………A-G-C-T………
6.限制酶所识别的序列的特点：
呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还 是4个碱基，都可以找到一条中心轴线， 中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向 对称重复排列的 ，称为 回文序列。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
7.切割结果： DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两 种形式——_ _ _ _ _和_ _ _ _
①当限制酶在它识别序列的
_ _ _ _ _将DNA分子的两条
链分别切开时，产生的是
_ 黏性末端 ；
②当限制酶在它识别序列的
_ _轴__ _ 切开时，产生的是
_平__末__端_；
形成黏性末端
实例2——SmaⅠ 限制酶：
识别序列为CCCGGG
切割部位为CG之间的磷酸二酯键。
形成平末端
2023/4/18
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
实例1—EcoRⅠ 限制酶：
识别序列为GAATTC，
切割部位为GA之间的磷酸二酯键。
黏性末端
黏性末端
平末端
思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠG_A_TC__
HindⅢAGCT___
EcoR ⅠAA_TT__
BglⅡ GATC___
思考：你从中发现什么现象了？
相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的
以下黏性末端是由_ 种限制酶作用产生的
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
AATTCCCTAA……
GGGATT……
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
……CTACGATG
……GATGCTACTTAA
练习使用EcoRI剪切目的基因
黏性 末端
目的基因
要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性(平)末端？
要切2个切口，产生4 个黏性(平)末端。
如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
会产生相同的黏性(平)末端
思 考
G A A T T C C T T A A G
A T A T T C G
T A A
G A A T T
C T T A A
G A A T
C T T A A
T C
G
C
G
把两种来源不同的
DNA
进行重组，应该怎样处理
用同种限制酶切割(EcoR Ⅰ)
思 考
G
C
？
G A A T T
C T T A A
G A A
C T T A A
T T C
G
C
G
缺口怎么办？
思 考
1.作用： 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
两DNA片段要具有互补的黏性末
端才能拼起来
注意：用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键 不是连接氢键(氢键的形成不需要酶的催化)
二、分子缝合针—DNA连接酶
A T T
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA聚合 NA聚 N 聚D 聚合酶
A
A
A
A
A
G
C
T
T
T
T
DNA连接酶
DNA聚合酶
相 同 作用实质 都能催化形成磷酸二酯键
化学本质 都是蛋白质
不 同 点 模板 不需要
需要DNA的一条
链作模板
作用对象 在两个DNA片段之间 形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接
到已有的DNA片段上，形
成磷酸二酯键
作用结果 形成完整的重组 DNA分子
形成DNA的一条链
用途 基因工程
DNA复制
DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
名称 作用部位 作用底物
作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA
形成具有黏性末端或平末端的DNA片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段
形成重组DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸
以单链DNA为模板， 将单个脱氧核苷酸依次 连接到单链末端，形成子代DNA
DNA水解酶 磷酸二酯键 DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之 间的氢键 DNA
将双链DNA分子局部解旋为单链， 形成两
条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸
以单链DNA为模板， 将单个核糖核苷酸依次
连接到单链末端，形成单链RNA
与DNA分子相关的几种酶的比较
根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
A.切断a处的酶为__①_____ B.连接a处的酶为_ __④___ C.切断b处的酶为__②_____
a ：磷酸二酯键； b：氢键
b
a
种类 E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌
T4噬菌体
功能特 性 只能连接黏性末端
既可以连接黏性末端，又可 以连接平末端 (但连接平末 端的效率相对较低)
相同点 恢复的都是磷酸二酯键
二、分子缝合针—DNA连接酶
2.分类：
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
E ·coli DNA
连接酶或
T
DNA
连接酶连接粘性末端
(
1
)
4
(2) T4 DNA连接酶连接平末端，效率低
种类 用途
不同点
质粒、噬 菌体 将外源基因导入大 肠杆菌等受体细胞
来源不同，在 大小、结构、 复制方式以及 可以插入外源 DNA片段的大 小也有很大差 别
植物病毒 将外源基因导入植物 细胞
动物病毒 将外源基因导入动物 细胞
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用： 将外源基因送入受体细胞 2.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.作为载体需具备的条件
(1) 有一个至多个限制酶切割位点
目的： 供外源DNA片段(基因)插入其中。
(2)能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上， 随受体DNA同步复制。
(3) 常有特殊的标记基因
(如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等)
目的： 便于重组DNA分子的鉴定和筛选。
(4) 对受体细胞无害，大小合适、方便操作。
大肠杆菌及质粒结构模式图
利用标记基因进行筛选示例：
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
4.最常用的运载体——质粒
(1)质粒的化学本质：
质粒是一种 _的、 结构简
单的、独立于_真__核__细__胞__细__胞__核_或
之外，并具有自
我复制能力的_环__状__双__链_ _分子
(2)基因工程中使用质粒的特点：
在基因工程操作中，真正被用
作载体的质粒，都是天然质粒的基
础上进行过_ _工__ _ _的； 这些质
粒上常有特殊的标记基因，便于
重___组DNA _ _ _ _选__；
基因工程中的载体
细胞膜上的载体蛋白
本质 DNA分子
蛋白质
作用 携带外源基因进入受体细胞中，并 在受体细胞中进行自我复制，或整 合到受体DNA上，随受体DNA同步 复制
运载要进出细胞的 特定物质
基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别
…TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…
…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG…
…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…
重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶 ；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能， 可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点 或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA GAGCCATACTTAA GCCGTATG…
5.从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切
割__2_次此DNA分子， 断 4 个磷酸二酯键,产生__4__个末端,出现__4__个游离
的磷酸基团。
6.切割目的基因和载体时， 需要用 同种___限制酶,目的是_产__生__相__同__的__黏__性__末端 7.目的片段翻转过来，可以连接吗？ _可__以_ 注意： 同种限制酶不一定是同一种限制酶(比
8.目的片段可以自身环化吗？ _可__以__ 的酶相同，这样才能进行下一步的拼接。
9.如何防止目的基因自身环化、防止目的基因反向连接到载体：
用不同的限制酶(通常两种)切割目的基因的两侧及质粒，使之产生不同的黏性末端。
重组DNA分子
AATTCTCGGTATG AATTCGGCATAC…
如同两种)。要保证切割目的片段和载体用
…ATAGCATGCTATCCATG
1.在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应选择的限制酶为_①___或__②
2.在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应选择的限制酶为___①___
注意：酶③也会切割酶②识别的序列，因此不能选择酶③
选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来
下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子最好？
(注： AmpR表示氨苄青霉素抗性基因， neo表示新霉素抗性基因)
HindⅢ和PstⅠ
防止目的基因的自身环化；防止目的基因反向连接到载体
来源： 主要来源于原核生物
特点： 具有专一性
作用部位： 磷酸二酯键
结果： 形成黏性末端或平末端
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、 T4 DNA连接酶
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体 的条件
DNA连接酶
限制酶
种类:
载体
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植
过程中,常常会受到一些害虫的侵袭,其中以棉铃 虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之 一,严重时,甚至能使一片棉田绝收。大量施用农 药杀虫不仅会提高生产成本,还可能造成农产品 和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害 的棉花新品种,这一问题就会迎刀而解,我国拥有
自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景
下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出 抗虫棉,基因工程却可以呢 基因工程是如何进行 操作的 它给我们的生产和生活带来了怎样的影 响
普通棉花和转基因抗虫棉
为了棉花姓“中国
●1992年 ，一场史无前例的棉铃 灾害吞噬着中国的棉田 ，我国棉花产
业遭遇灭顶之灾；
● 国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术 ，到1999年外国抗虫棉已占领我国 95%的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速流失。
●1998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种—— 中棉 所29，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%；
●2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种—— 中棉所4 1，该品种能够缓解棉铃虫抗药性，
我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家！
第3章 基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物 新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。 从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施 工的，因此又叫作重组DNA技术。
( 1)原理： 基因重组。
(2)操作水平： 分子水平。
(3)操作环境： 生物体外。
(4)操作对象： 基因。
( 5)结果： 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的 新的生物类型和生物制品。
1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是 DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年， 埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。 2年后，桑格首次完成了 对胰岛素氨基酸序列的测定。
1953年， 沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复 制的假说。
1958年， 梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克 里克提出中心法则。
1961年， 尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。 截至1966年， 64个密码子均被成功破译。
1967年， 科学家发现， 在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可 以在细菌细胞间转移。
科技探索之路 基因工程的诞生和发展
科技探索之路 基因工程的诞生和发展
1970年， 科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶(简称限制酶)。
20世纪70年代初， 多种限制酶、 DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这 些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1972年， 伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功构建了第一个体外重 组DNA分子。
1973年， 科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入 受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。 至此，基因工程正式问世。
1977年， 桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提 供了可能。此后， DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年， 第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成 为世界各国研究和投资开发的热点。
1983年， 科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后， 基因工程进入了迅速发展的阶段。
21世纪以来， 科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大 量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年， 华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术— —CRISPR (成簇规律间隔短回文重复)技术编辑了哺乳动物基因组。该技 术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
1984年， 我国科学家朱作言领导的团队培育出世 界上第一条转基因鱼。
1985年， 穆里斯等人发明了PCR，为获取目的基因 提供了有效手段。
1990年， 人类基因组计划启动。 2003年，该计划 的测序任务顺利完成。
科技探索之路 基因工程的诞生和发展
第1节 重组DNA技术的基本工具
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木
瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家
通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因
番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子
进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门
的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些
“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特
征呢？ 非转基因番木瓜 与转基因番木瓜
分子手术刀 限制性内切核酸酶： 准确切割DNA分子
DNA连接酶：将DNA片段连接起来
载体：将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
)
)
右
左
(
(
从社会中来
将体外重组好的 DNA分子导入受体 细胞
将DNA片
段连接起 来
重组DNA技术所需的三种基本工具
准确切割 DNA分子
“分子运输车”
“分子缝合针”
“分子手术刀”
2.为什么一种生物的基因可以在另一种生
物细胞内表达？
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位
② 遗传信息的传递都遵循中心法则
③ 生物界共同一套遗传密码
② DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
① DNA是生物的主要遗传物质
思考讨论
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.简称： 限制酶
2.来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要 作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过 程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。 当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保 证自身安全。
所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：
切割外源DNA、使之失效，以保证自身安全
试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？
原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
3.作用： 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中
特定部位的磷酸二酯键断开。 (特异性)
4.作用部位： 磷酸二酯键，限制酶只
切割两个核苷酸之间的 磷酸二酯键。
G
磷酸二酯键
A
T
C
G
3
’
磷 酸 二 酯 键
5’
4’
3’
1’
2’
4’
3’
1’
2’
3
’
5
’
5
’
A
G
A
C
5’
T
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
5.限制酶的命名：
用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略 语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从 大肠杆菌( Escherichia coli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如 果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成 EcoRI。
两种常用的限制酶： EcoRⅠ和SmaⅠ
●EcoRⅠ：大肠杆菌(Escherichiacoli) R型菌株中分离出的 第一个限制酶；
●SmaⅠ：粘质沙雷氏菌 (Serratiamarcescens) 中分离出的 第一个限制酶。
粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcesens)中分离的
第一种限制酶即 SmaⅠ
_______
仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？
思 考
EcoRⅠ ……G-A-A-T-T-C……
……C-T-T-A-A-G……
HindⅢ ……A-A-G-C-T-T……
……T-T-C-G-A-A……
BamHⅠ ……G-G-A-T-C-C……
……C-C-T-A-G-G……
TaqⅠ ………T-C-G-A………
………A-G-C-T………
6.限制酶所识别的序列的特点：
呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还 是4个碱基，都可以找到一条中心轴线， 中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向 对称重复排列的 ，称为 回文序列。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
7.切割结果： DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两 种形式——_ _ _ _ _和_ _ _ _
①当限制酶在它识别序列的
_ _ _ _ _将DNA分子的两条
链分别切开时，产生的是
_ 黏性末端 ；
②当限制酶在它识别序列的
_ _轴__ _ 切开时，产生的是
_平__末__端_；
形成黏性末端
实例2——SmaⅠ 限制酶：
识别序列为CCCGGG
切割部位为CG之间的磷酸二酯键。
形成平末端
2023/4/18
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
实例1—EcoRⅠ 限制酶：
识别序列为GAATTC，
切割部位为GA之间的磷酸二酯键。
黏性末端
黏性末端
平末端
思考：你从中发现什么现象了？
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠG_A_TC__
HindⅢAGCT___
EcoR ⅠAA_TT__
BglⅡ GATC___
思考：你从中发现什么现象了？
相同的黏性末端也可能是由不同限制酶作用形成的
以下黏性末端是由_ 种限制酶作用产生的
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
AATTCCCTAA……
GGGATT……
AATTCCGTAG
GGCATCTTAA
……CTACGATG
……GATGCTACTTAA
练习使用EcoRI剪切目的基因
黏性 末端
目的基因
要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性(平)末端？
要切2个切口，产生4 个黏性(平)末端。
如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？
会产生相同的黏性(平)末端
思 考
G A A T T C C T T A A G
A T A T T C G
T A A
G A A T T
C T T A A
G A A T
C T T A A
T C
G
C
G
把两种来源不同的
DNA
进行重组，应该怎样处理
用同种限制酶切割(EcoR Ⅰ)
思 考
G
C
？
G A A T T
C T T A A
G A A
C T T A A
T T C
G
C
G
缺口怎么办？
思 考
1.作用： 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
两DNA片段要具有互补的黏性末
端才能拼起来
注意：用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键 不是连接氢键(氢键的形成不需要酶的催化)
二、分子缝合针—DNA连接酶
A T T
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA聚合 NA聚 N 聚D 聚合酶
A
A
A
A
A
G
C
T
T
T
T
DNA连接酶
DNA聚合酶
相 同 作用实质 都能催化形成磷酸二酯键
化学本质 都是蛋白质
不 同 点 模板 不需要
需要DNA的一条
链作模板
作用对象 在两个DNA片段之间 形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接
到已有的DNA片段上，形
成磷酸二酯键
作用结果 形成完整的重组 DNA分子
形成DNA的一条链
用途 基因工程
DNA复制
DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
名称 作用部位 作用底物
作用结果
限制酶 磷酸二酯键 DNA
形成具有黏性末端或平末端的DNA片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 DNA片段
形成重组DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 脱氧核苷酸
以单链DNA为模板， 将单个脱氧核苷酸依次 连接到单链末端，形成子代DNA
DNA水解酶 磷酸二酯键 DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之 间的氢键 DNA
将双链DNA分子局部解旋为单链， 形成两
条长链
RNA聚合酶 磷酸二酯键 核糖核苷酸
以单链DNA为模板， 将单个核糖核苷酸依次
连接到单链末端，形成单链RNA
与DNA分子相关的几种酶的比较
根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
A.切断a处的酶为__①_____ B.连接a处的酶为_ __④___ C.切断b处的酶为__②_____
a ：磷酸二酯键； b：氢键
b
a
种类 E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌
T4噬菌体
功能特 性 只能连接黏性末端
既可以连接黏性末端，又可 以连接平末端 (但连接平末 端的效率相对较低)
相同点 恢复的都是磷酸二酯键
二、分子缝合针—DNA连接酶
2.分类：
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
E ·coli DNA
连接酶或
T
DNA
连接酶连接粘性末端
(
1
)
4
(2) T4 DNA连接酶连接平末端，效率低
种类 用途
不同点
质粒、噬 菌体 将外源基因导入大 肠杆菌等受体细胞
来源不同，在 大小、结构、 复制方式以及 可以插入外源 DNA片段的大 小也有很大差 别
植物病毒 将外源基因导入植物 细胞
动物病毒 将外源基因导入动物 细胞
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.作用： 将外源基因送入受体细胞 2.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.作为载体需具备的条件
(1) 有一个至多个限制酶切割位点
目的： 供外源DNA片段(基因)插入其中。
(2)能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上， 随受体DNA同步复制。
(3) 常有特殊的标记基因
(如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等)
目的： 便于重组DNA分子的鉴定和筛选。
(4) 对受体细胞无害，大小合适、方便操作。
大肠杆菌及质粒结构模式图
利用标记基因进行筛选示例：
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
4.最常用的运载体——质粒
(1)质粒的化学本质：
质粒是一种 _的、 结构简
单的、独立于_真__核__细__胞__细__胞__核_或
之外，并具有自
我复制能力的_环__状__双__链_ _分子
(2)基因工程中使用质粒的特点：
在基因工程操作中，真正被用
作载体的质粒，都是天然质粒的基
础上进行过_ _工__ _ _的； 这些质
粒上常有特殊的标记基因，便于
重___组DNA _ _ _ _选__；
基因工程中的载体
细胞膜上的载体蛋白
本质 DNA分子
蛋白质
作用 携带外源基因进入受体细胞中，并 在受体细胞中进行自我复制，或整 合到受体DNA上，随受体DNA同步 复制
运载要进出细胞的 特定物质
基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别
…TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…
…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG…
…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…
重组DNA分子
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶 ；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能， 可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点 或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA GAGCCATACTTAA GCCGTATG…
5.从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切
割__2_次此DNA分子， 断 4 个磷酸二酯键,产生__4__个末端,出现__4__个游离
的磷酸基团。
6.切割目的基因和载体时， 需要用 同种___限制酶,目的是_产__生__相__同__的__黏__性__末端 7.目的片段翻转过来，可以连接吗？ _可__以_ 注意： 同种限制酶不一定是同一种限制酶(比
8.目的片段可以自身环化吗？ _可__以__ 的酶相同，这样才能进行下一步的拼接。
9.如何防止目的基因自身环化、防止目的基因反向连接到载体：
用不同的限制酶(通常两种)切割目的基因的两侧及质粒，使之产生不同的黏性末端。
重组DNA分子
AATTCTCGGTATG AATTCGGCATAC…
如同两种)。要保证切割目的片段和载体用
…ATAGCATGCTATCCATG
1.在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应选择的限制酶为_①___或__②
2.在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应选择的限制酶为___①___
注意：酶③也会切割酶②识别的序列，因此不能选择酶③
选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来
下列操作中选用哪种限制酶切割构建重组DNA分子最好？
(注： AmpR表示氨苄青霉素抗性基因， neo表示新霉素抗性基因)
HindⅢ和PstⅠ
防止目的基因的自身环化；防止目的基因反向连接到载体
来源： 主要来源于原核生物
特点： 具有专一性
作用部位： 磷酸二酯键
结果： 形成黏性末端或平末端
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、 T4 DNA连接酶
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体 的条件
DNA连接酶
限制酶
种类:
载体