人教版2019高中生物选择性必修3 同步练习题--第3章 基因工程拔高练(含解析）
文档属性
| 名称 | 人教版2019高中生物选择性必修3 同步练习题--第3章 基因工程拔高练(含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 1.5MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-10-24 00:00:36 | ||
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文档简介
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2024人教版高中生物选择性必修3同步
综合拔高练
五年高考练
考点1 DNA的粗提取与鉴定
1.(2022山东,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是( )
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
2.(2019江苏单科,10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述,错误的是( )
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中,搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
考点2 基因工程的基本工具
3.(2021湖北,7)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割 双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
4.(2023新课标,6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
考点3 基因工程的基本操作程序及应用
5.(2023湖北,4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
6.(2023全国乙,38)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ;②为 ,其作用是 ;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是 。
7.(2023山东,25)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
考点4 蛋白质工程
8.(2022湖南,22)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 (填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是
。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 。
三年模拟练
应用实践
1.(2023山西太原五中阶段练习)PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基,5'端无严格限制,可用于添加限制酶识别序列。下列叙述正确的是( )
A.PCR第4个循环,消耗了15对引物
B.脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到引物的5'端
C.耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上
D.用图中引物扩增至少四个循环后才能获得两端均添加限制酶识别序列的目的产物
2.(2023山东潍坊昌乐一中阶段测试)研究人员将GNA基因和ACA基因连接成融合基因后再与pBI121质粒载体结合并导入玉米细胞,最终获得了抗蚜虫玉米新品种,部分操作如图所示。下列相关叙述错误的是( )
A.提取GNA基因和ACA基因至少需要两种限制酶,①②过程均需要使用DNA连接酶
B.为了保证基因转录方向正确,需要用限制酶KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体
C.只要检测出玉米细胞中含有融合基因,就说明抗蚜虫玉米培育成功
D.在加入了卡那霉素的培养基上存活下来的玉米细胞,说明其成功导入了重组载体
3.(2023福建厦门一中月考)研究人员用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶处理某DNA分子,图1为EcoRⅠ切割该DNA分子后的结果;图2是酶切后的凝胶电泳图谱,其中1号泳道是DNA Marker,2号、3号、4号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是( )
A.据图1可知EcoRⅠ的识别序列为-GAATTC-,切割位点在G和A之间
B.据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在B端,且连着电泳槽的负极
C.据图2可知该DNA分子可能是含1 000个碱基对的环状DNA
D.EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶的酶切位点不同
4.(2023山东济北中学期中)受伤的双子叶植物产生的酚类化合物可诱导毒力效应蛋白(Vir)基因表达产生Vir蛋白,其中VirD1/D2蛋白复合体可将Ti质粒上的一段T-DNA单链(T链)切下并形成VirD2-T链复合物。转移至植物细胞中的VirD2-T链复合物结合VirE2等蛋白形成T复合体进入细胞核,将T链随机整合到植物染色体上。相关叙述错误的是( )
A.农杆菌转化法将目的基因导入水稻细胞,可用酚类化合物处理提高转化效率
B.VirD2-T链复合物结合VirE2等蛋白形成T复合体可避免T-DNA的胞内降解
C.T-DNA的整合具有随机性,需经过筛选(抗性、荧光等)获得符合要求的转化苗
D.T-DNA整合至植物细胞染色体上的过程不需要DNA聚合酶和DNA连接酶
5.(2023江苏镇江期中)转基因重组酵母乙肝疫苗是一种乙肝表面抗原(HBsAg)亚单位疫苗。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母,能以甲醇作为唯一碳源,该酵母是组氨酸脱氢酶基因(His)缺失突变体,在添加了组氨酸的培养基上才能存活。图示质粒中的5'AOX1、3'AOX1(TT)是强启动子序列和终止子序列,请回答下列问题。
注:HBsAg基因中的箭头表示基因转录的方向。
限制酶的识别序列和切割位点
限制酶 SnaBⅠ BglⅡ AvrⅡ SacⅠ
识别序 列及切 割位点 TAC↓GTA A↓GATCT C↓CTAGG C↓TCGAG
(1)图示质粒中含有的卡那霉素抗性基因KanR、氨苄青霉素抗性基因AmpR在基因工程中一般作为 ,有利于重组质粒的筛选。质粒中需具有一个或多个限制酶切割位点,其作用是 。
(2)据图和表分析,构建重组质粒时,需选择图中的 限制酶切割质粒,其优点为 。HBsAg基因的B位置需接上 (填相应末端的碱基序列)。经过限制酶酶切的质粒与HBsAg基因在进行连接时,可选用 连接。
(3)图中步骤1一般先用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于 的生理状态。由步骤2的结果分析,步骤1将重组质粒先导入大肠杆菌有利于HBsAg基因在受体细胞中 。
(4)以巴斯德毕赤酵母细胞为受体,步骤3中应选用限制酶 切割从大肠杆菌中分离的重组质粒,从而获得图示重组DNA片段,然后将其整合到酵母细胞基因组中,在不含 的培养基中筛选出成功导入了HBsAg基因的酵母细胞。
(5)转化成功的巴斯德毕赤酵母在培养基上培养一段时间后,需向培养基中加入 以维持其生活。与细菌相比,酵母菌更适宜作为受体细胞制备HBsAg亚单位疫苗,原因是 。
迁移创新
6.(2022湖北十一校联考)CRISPR/Cas9基因组编辑系统由向导RNA(也叫sgRNA)和Cas9蛋白组成,向导RNA识别并结合靶基因DNA,Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失,从而实现基因敲除,如图所示,回答下列问题。
(1)向导RNA识别靶基因DNA时遵循碱基互补配对原则,Cas9蛋白相当于 酶,Cas9蛋白切断靶基因DNA形成的两个末端重新连接时所必需的一种酶是 。
(2)CCR5是人体的正常基因,其编码的细胞膜CCR5蛋白是HIV入侵T淋巴细胞的主要通道“入口”。科研人员依据 的部分序列设计sgRNA,导入骨髓 细胞中,构建sgRNA/Cas9复合体,以实现对CCR5基因的定向切割,变异的CCR5蛋白无法装配到细胞膜上,即可有效阻止HIV侵染新分化生产的T淋巴细胞。
(3)CRISPR/Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶,试分析脱靶最可能的原因是 ,造成向导RNA(sgRNA)错误结合而脱靶,而且sgRNA的序列越短,脱靶率会越 (填“高”或“低”)。
答案与分层梯度式解析
五年高考练
1.B 2.A 3.C 4.C 5.D
1.B 离心研磨液是为了使蛋白质等沉淀,得到含DNA的上清液,B错误;本实验只是对DNA进行了粗提取,提取的DNA中可能含有蛋白质等其他物质,D正确。
2.A 兔属于哺乳动物,其成熟红细胞没有细胞核及众多细胞器,提取不到DNA,而鸡属于鸟类,其红细胞内含有细胞核与众多细胞器,DNA含量较多,A错误;DNA分子是非常容易断裂的,轻柔搅拌的目的是获得较完整的DNA分子,B正确;DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,所以冷却的体积分数为95%的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA,C正确;将析出的DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色,D正确。
3.C 由题可知,EcoRⅠ的识别序列由6个核苷酸组成,由于DNA分子的碱基组成为A、T、C、G,则DNA片段上出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4 096,即约4 000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRⅠ的识别序列,则用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度约为4 000个碱基对。
4.C 酶4切割位点位于抗生素抗性基因(标记基因)内部,酶切后会破坏标记基因,D不符合题意;酶3切割后产生平末端,E.coli DNA连接酶仅能连接黏性末端,故E.coli DNA连接酶无法连接酶3切割产生的平末端,A不符合题意;若用酶3切割质粒、酶1切割目的基因,两者产生的末端无法连接在一起,B不符合题意;酶1和酶2切割后产生不同的黏性末端,T4 DNA连接酶既可连接黏性末端,也可连接平末端,若用酶1和酶2同时切割质粒和目的基因,并用T4 DNA连接酶连接,则既可避免质粒和目的基因的自身环化,又能保证目的基因正确插入质粒,C符合题意。
5.D 若用HindⅢ酶切,目的基因可能正接或反接,所以目的基因转录的产物可能不同,A正确;若用PvuⅠ酶切,在含有Tet(四环素)的培养基中的菌落不一定含有目的基因,因为导入空白质粒的受体菌也可在该培养基中形成菌落,B正确;若用SphⅠ酶切,检测重组质粒是否构建成功可选择恰当的引物使重组质粒和空白质粒的扩增产物不同,通过DNA凝胶电泳技术加以区分,C正确;若用SphⅠ酶切,则会破坏质粒中四环素抗性基因,故携带目的基因的受体菌在含有Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含有Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。
6.答案 (1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA 鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子具有简并性,突变后基因编码的蛋白质氨基酸序列没有发生变化 (4)将真核生物的启动子与YFP基因重组后构建基因表达载体,并将其导入真核细胞,检测其能否发出黄色荧光
解析 (1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。(2)由题图分析可知,GFP突变基因的转录方向是②→①,因此②为启动子,①为终止子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动基因转录出mRNA。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。(3)大肠杆菌发出绿色荧光,说明大肠杆菌细胞内存在GFP,从密码子特点的角度分析,出现该情况的可能原因是密码子具有简并性,突变后基因编码的蛋白质氨基酸序列没有发生变化,从而使GFP突变基因表达出绿色荧光蛋白。(4)若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,则需要将真核生物的启动子与YFP基因重组后构建基因表达载体,并将其导入真核细胞,检测其能否发出黄色荧光。
7.答案 (1)RNA聚合酶 标记基因、复制原点 (2)F2和R1(或“F1和R2”) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体,需要有启动子、终止子、复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计一对引物,一个引物与目的基因序列互补,另一个引物与质粒序列互补,两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链,启动子在左侧,所以转录方向为从左到右,由于转录沿模板链3'端到5'端方向合成RNA,所以J基因b链左侧为3'端,引物要与DNA的3'端互补配对,所以F1与b链互补,a链也与b链互补,由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1,说明条带1为J-V5融合蛋白,条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到,说明该蛋白仅含J蛋白,不含V5标签,故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
8.答案 (1)多肽链 mRNA 密码子具有简并性 (2)从基因文库中获取 人工合成 DNA双链复制 (3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同,导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)取3支试管,并编号为1、2、3,分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素;用酒精消毒,用注射器取同一种动物(如家兔)血液,立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中,静置相同时间,统计三支试管中血液凝固时间
解析 (1)蛋白质工程的基本思路是:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。在生产过程中,mRNA可能不同,但合成的蛋白质空间构象却相同,原因是密码子具有简并性,即一种氨基酸可能对应多种密码子。(3)据题图可知,将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升,且差别不大;而经酶甲处理后,随着酶解时间的延长,抗凝血活性先上升后相对稳定;经酶乙处理后,随着酶解时间的延长,抗凝血活性先上升后下降,且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性。据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、题述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,实验的自变量为水蛭素的差别和有无,因变量为血液凝固时间,实验设计时应遵循对照原则与单一变量原则,其中无关变量应保持相同且适宜。
三年模拟练
1.C 2.CD 3.B 4.D
1.C 第4个循环由8个DNA分子复制形成16个DNA分子,需要8对引物;而PCR经过4个循环,共消耗了15对引物,A错误。脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到引物的3'端,B错误。由于两个引物均不在该片段的端点,因此第一、二个循环产生的DNA分子的两条链均不等长,第三个循环产生的DNA分子中,存在两条核苷酸链等长的DNA分子,即用图中引物扩增至少三个循环后才能获得两端均添加限制酶识别序列的目的产物,D错误。
2.CD 由图可知,提取GNA基因需要限制酶KpnⅠ和BsaBⅠ,提取ACA基因需要限制酶BsaBⅠ和KpnⅠ(或XhoⅠ);①过程为获得融合基因,②过程为构建基因表达载体,两过程均需要使用DNA连接酶,A正确。融合基因和载体都含有限制酶KpnⅠ和XhoⅠ切割位点,且KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点不同,用KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体,只有基因方向正确才能形成重组载体,从而保证基因转录方向正确,B正确。检测出玉米细胞中含有融合基因,不一定能说明抗蚜虫玉米培育成功,因为融合基因可能不能正常表达,C错误。在加入卡那霉素的培养基上存活下来的玉米细胞,可能是成功导入重组载体的玉米细胞,也可能是导入含有卡那霉素抗性基因的非重组载体的玉米细胞,D错误。
3.B DNA片段长度会影响其在电泳时的迁移速率,DNA分子越大,迁移就越慢,据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端,B错误;图2中2号、3号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理后的电泳结果,两个泳道均只出现一种DNA片段,且碱基对数均为1 000,说明该DNA分子可能是含1 000个碱基对的环状DNA,C正确;图2中4号是EcoRⅠ和SmaⅠ两种酶共同处理后的电泳结果,显示800 bp和200 bp两个条带,1 000 bp=800 bp+200 bp,说明在该DNA分子中,两种限制酶的酶切位点不同,如下图所示,D正确。
4.D 分析题干过程,如下所示:
①酚类化合物Vir蛋白产生
②
③
根据以上分析可知,用酚类化合物处理最终可促进T链整合到植物染色体上;农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有侵染能力,因为多数单子叶植物不能合成酚类化合物,而水稻是单子叶植物,因此,可以通过酚类化合物处理提高转化效率,A正确。据以上②③的分析,T-DNA最终整合到植物染色体上,避免了T-DNA在细胞内被降解,B正确。因为T-DNA的整合是随机的,经过转化的植物不一定符合要求,还需经过筛选(抗性、荧光等)才能获得符合要求的转化苗,C正确。据题干信息可知,VirD1/D2蛋白复合体可将Ti质粒上的一段T-DNA单链(T链)切下(不需要限制酶),但T-DNA进入细胞核整合至植物细胞染色体上的过程需要DNA聚合酶和DNA连接酶,D错误。
5.答案 (1)标记基因 以便与外源基因连接 (2)SnaBⅠ和AvrⅡ 防止质粒自身环化以及避免目的基因反向接入质粒 5'-CCTAGG-3' T4 DNA连接酶 (3)能吸收周围环境中DNA分子 复制 (4)BglⅡ 组氨酸 (5)甲醇 酵母菌为真核生物,具有内质网和高尔基体等细胞器,能够对蛋白质进行加工,而细菌没有各种细胞器(除了核糖体),不能形成分泌蛋白
解析 (1)质粒作为基因工程的载体,需含有标记基因,以便于重组质粒的筛选;质粒具有一个或多个限制酶切割位点,以便与外源基因连接。(2)图中质粒含有SnaBⅠ、BglⅡ、AvrⅡ和SacⅠ限制酶切割位点,其中限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ位于启动子和终止子之间,可用这两种酶切割质粒,则在HBsAg基因两侧的A和B位置添加的碱基序列分别是5'-TACGTA-3'、5'-CCTAGG-3';用双酶切的优点是防止质粒自身环化,同时避免目的基因反向接入质粒(保证目的基因定向接入质粒)。用SnaBⅠ酶切得到的是平末端,用AvrⅡ酶切得到的是黏性末端,故应用T4 DNA连接酶将HBsAg基因连接到质粒上。(3)由步骤2的结果(得到较多的重组质粒)分析,步骤1将重组质粒先导入大肠杆菌有利于HBsAg基因在受体细胞中复制。(4)由图可知,SnaBⅠ、AvrⅡ会切下目的基因,SacⅠ会破坏启动子,因此从大肠杆菌中分离的重组质粒经过步骤3得到重组DNA(含有启动子、目的基因和终止子),应选用限制酶BglⅡ来切割。巴斯德毕赤酵母是组氨酸脱氢酶基因(His)缺失突变体,在添加了组氨酸的培养基上才能存活,在不含组氨酸的培养基中可筛选出成功导入了HBsAg基因的酵母细胞。(5)巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母,能以甲醇作为唯一碳源,所以酵母菌在培养基上培养一段时间后,需要向其中加入甲醇以维持其生活。酵母菌为真核生物,细胞内具有对分泌蛋白进行加工的内质网和高尔基体等细胞器,细菌等原核生物不具有内质网和高尔基体等细胞器,不能形成分泌蛋白,所以生产乙肝疫苗的过程中,与细菌相比,酵母菌更适合作为受体细胞。
6.答案 (1)限制性内切核酸(限制) DNA连接酶 (2)CCR5基因 造血干 (3)其他DNA序列也含有与向导RNA(sgRNA)互补配对的序列 高
解析 (1)根据题意“Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端”可知,Cas9蛋白可以识别特定的脱氧核苷酸序列并对其进行切割,其作用相当于限制性内切核酸酶(限制酶);Cas9蛋白切断靶基因DNA形成的两个末端重新连接时需要DNA连接酶。(2)T淋巴细胞是由造血干细胞分裂、分化形成的,则可依据CCR5基因的部分序列设计sgRNA序列,导入骨髓造血干细胞中,构建sgRNA/Cas9复合体,以实现对CCR5基因的定向切割。(3)CRISPR/Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶,其最可能的原因是其他DNA序列也含有与向导RNA(sgRNA)互补配对的序列,造成向导RNA(sgRNA)错误结合而脱靶;sgRNA的序列越短,则能与sgRNA互补配对的DNA序列出现的概率越高,脱靶率会越高。
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五年高考练
考点1 DNA的粗提取与鉴定
1.(2022山东,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是( )
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
2.(2019江苏单科,10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述,错误的是( )
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中,搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
考点2 基因工程的基本工具
3.(2021湖北,7)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割 双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
4.(2023新课标,6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
考点3 基因工程的基本操作程序及应用
5.(2023湖北,4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
6.(2023全国乙,38)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ;②为 ,其作用是 ;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是 。
7.(2023山东,25)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
考点4 蛋白质工程
8.(2022湖南,22)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 (填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是
。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 。
三年模拟练
应用实践
1.(2023山西太原五中阶段练习)PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基,5'端无严格限制,可用于添加限制酶识别序列。下列叙述正确的是( )
A.PCR第4个循环,消耗了15对引物
B.脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到引物的5'端
C.耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上
D.用图中引物扩增至少四个循环后才能获得两端均添加限制酶识别序列的目的产物
2.(2023山东潍坊昌乐一中阶段测试)研究人员将GNA基因和ACA基因连接成融合基因后再与pBI121质粒载体结合并导入玉米细胞,最终获得了抗蚜虫玉米新品种,部分操作如图所示。下列相关叙述错误的是( )
A.提取GNA基因和ACA基因至少需要两种限制酶,①②过程均需要使用DNA连接酶
B.为了保证基因转录方向正确,需要用限制酶KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体
C.只要检测出玉米细胞中含有融合基因,就说明抗蚜虫玉米培育成功
D.在加入了卡那霉素的培养基上存活下来的玉米细胞,说明其成功导入了重组载体
3.(2023福建厦门一中月考)研究人员用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶处理某DNA分子,图1为EcoRⅠ切割该DNA分子后的结果;图2是酶切后的凝胶电泳图谱,其中1号泳道是DNA Marker,2号、3号、4号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是( )
A.据图1可知EcoRⅠ的识别序列为-GAATTC-,切割位点在G和A之间
B.据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在B端,且连着电泳槽的负极
C.据图2可知该DNA分子可能是含1 000个碱基对的环状DNA
D.EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶的酶切位点不同
4.(2023山东济北中学期中)受伤的双子叶植物产生的酚类化合物可诱导毒力效应蛋白(Vir)基因表达产生Vir蛋白,其中VirD1/D2蛋白复合体可将Ti质粒上的一段T-DNA单链(T链)切下并形成VirD2-T链复合物。转移至植物细胞中的VirD2-T链复合物结合VirE2等蛋白形成T复合体进入细胞核,将T链随机整合到植物染色体上。相关叙述错误的是( )
A.农杆菌转化法将目的基因导入水稻细胞,可用酚类化合物处理提高转化效率
B.VirD2-T链复合物结合VirE2等蛋白形成T复合体可避免T-DNA的胞内降解
C.T-DNA的整合具有随机性,需经过筛选(抗性、荧光等)获得符合要求的转化苗
D.T-DNA整合至植物细胞染色体上的过程不需要DNA聚合酶和DNA连接酶
5.(2023江苏镇江期中)转基因重组酵母乙肝疫苗是一种乙肝表面抗原(HBsAg)亚单位疫苗。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母,能以甲醇作为唯一碳源,该酵母是组氨酸脱氢酶基因(His)缺失突变体,在添加了组氨酸的培养基上才能存活。图示质粒中的5'AOX1、3'AOX1(TT)是强启动子序列和终止子序列,请回答下列问题。
注:HBsAg基因中的箭头表示基因转录的方向。
限制酶的识别序列和切割位点
限制酶 SnaBⅠ BglⅡ AvrⅡ SacⅠ
识别序 列及切 割位点 TAC↓GTA A↓GATCT C↓CTAGG C↓TCGAG
(1)图示质粒中含有的卡那霉素抗性基因KanR、氨苄青霉素抗性基因AmpR在基因工程中一般作为 ,有利于重组质粒的筛选。质粒中需具有一个或多个限制酶切割位点,其作用是 。
(2)据图和表分析,构建重组质粒时,需选择图中的 限制酶切割质粒,其优点为 。HBsAg基因的B位置需接上 (填相应末端的碱基序列)。经过限制酶酶切的质粒与HBsAg基因在进行连接时,可选用 连接。
(3)图中步骤1一般先用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于 的生理状态。由步骤2的结果分析,步骤1将重组质粒先导入大肠杆菌有利于HBsAg基因在受体细胞中 。
(4)以巴斯德毕赤酵母细胞为受体,步骤3中应选用限制酶 切割从大肠杆菌中分离的重组质粒,从而获得图示重组DNA片段,然后将其整合到酵母细胞基因组中,在不含 的培养基中筛选出成功导入了HBsAg基因的酵母细胞。
(5)转化成功的巴斯德毕赤酵母在培养基上培养一段时间后,需向培养基中加入 以维持其生活。与细菌相比,酵母菌更适宜作为受体细胞制备HBsAg亚单位疫苗,原因是 。
迁移创新
6.(2022湖北十一校联考)CRISPR/Cas9基因组编辑系统由向导RNA(也叫sgRNA)和Cas9蛋白组成,向导RNA识别并结合靶基因DNA,Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失,从而实现基因敲除,如图所示,回答下列问题。
(1)向导RNA识别靶基因DNA时遵循碱基互补配对原则,Cas9蛋白相当于 酶,Cas9蛋白切断靶基因DNA形成的两个末端重新连接时所必需的一种酶是 。
(2)CCR5是人体的正常基因,其编码的细胞膜CCR5蛋白是HIV入侵T淋巴细胞的主要通道“入口”。科研人员依据 的部分序列设计sgRNA,导入骨髓 细胞中,构建sgRNA/Cas9复合体,以实现对CCR5基因的定向切割,变异的CCR5蛋白无法装配到细胞膜上,即可有效阻止HIV侵染新分化生产的T淋巴细胞。
(3)CRISPR/Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶,试分析脱靶最可能的原因是 ,造成向导RNA(sgRNA)错误结合而脱靶,而且sgRNA的序列越短,脱靶率会越 (填“高”或“低”)。
答案与分层梯度式解析
五年高考练
1.B 2.A 3.C 4.C 5.D
1.B 离心研磨液是为了使蛋白质等沉淀,得到含DNA的上清液,B错误;本实验只是对DNA进行了粗提取,提取的DNA中可能含有蛋白质等其他物质,D正确。
2.A 兔属于哺乳动物,其成熟红细胞没有细胞核及众多细胞器,提取不到DNA,而鸡属于鸟类,其红细胞内含有细胞核与众多细胞器,DNA含量较多,A错误;DNA分子是非常容易断裂的,轻柔搅拌的目的是获得较完整的DNA分子,B正确;DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,所以冷却的体积分数为95%的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA,C正确;将析出的DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色,D正确。
3.C 由题可知,EcoRⅠ的识别序列由6个核苷酸组成,由于DNA分子的碱基组成为A、T、C、G,则DNA片段上出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4 096,即约4 000个碱基对可能出现一个限制酶EcoRⅠ的识别序列,则用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度约为4 000个碱基对。
4.C 酶4切割位点位于抗生素抗性基因(标记基因)内部,酶切后会破坏标记基因,D不符合题意;酶3切割后产生平末端,E.coli DNA连接酶仅能连接黏性末端,故E.coli DNA连接酶无法连接酶3切割产生的平末端,A不符合题意;若用酶3切割质粒、酶1切割目的基因,两者产生的末端无法连接在一起,B不符合题意;酶1和酶2切割后产生不同的黏性末端,T4 DNA连接酶既可连接黏性末端,也可连接平末端,若用酶1和酶2同时切割质粒和目的基因,并用T4 DNA连接酶连接,则既可避免质粒和目的基因的自身环化,又能保证目的基因正确插入质粒,C符合题意。
5.D 若用HindⅢ酶切,目的基因可能正接或反接,所以目的基因转录的产物可能不同,A正确;若用PvuⅠ酶切,在含有Tet(四环素)的培养基中的菌落不一定含有目的基因,因为导入空白质粒的受体菌也可在该培养基中形成菌落,B正确;若用SphⅠ酶切,检测重组质粒是否构建成功可选择恰当的引物使重组质粒和空白质粒的扩增产物不同,通过DNA凝胶电泳技术加以区分,C正确;若用SphⅠ酶切,则会破坏质粒中四环素抗性基因,故携带目的基因的受体菌在含有Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含有Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。
6.答案 (1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA 鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子具有简并性,突变后基因编码的蛋白质氨基酸序列没有发生变化 (4)将真核生物的启动子与YFP基因重组后构建基因表达载体,并将其导入真核细胞,检测其能否发出黄色荧光
解析 (1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。(2)由题图分析可知,GFP突变基因的转录方向是②→①,因此②为启动子,①为终止子。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动基因转录出mRNA。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。(3)大肠杆菌发出绿色荧光,说明大肠杆菌细胞内存在GFP,从密码子特点的角度分析,出现该情况的可能原因是密码子具有简并性,突变后基因编码的蛋白质氨基酸序列没有发生变化,从而使GFP突变基因表达出绿色荧光蛋白。(4)若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,则需要将真核生物的启动子与YFP基因重组后构建基因表达载体,并将其导入真核细胞,检测其能否发出黄色荧光。
7.答案 (1)RNA聚合酶 标记基因、复制原点 (2)F2和R1(或“F1和R2”) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因的转录。质粒作为载体,需要有启动子、终止子、复制原点、一个至多个限制酶切割位点和便于重组质粒筛选的标记基因等。(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计一对引物,一个引物与目的基因序列互补,另一个引物与质粒序列互补,两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链,启动子在左侧,所以转录方向为从左到右,由于转录沿模板链3'端到5'端方向合成RNA,所以J基因b链左侧为3'端,引物要与DNA的3'端互补配对,所以F1与b链互补,a链也与b链互补,由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1,说明条带1为J-V5融合蛋白,条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到,说明该蛋白仅含J蛋白,不含V5标签,故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
8.答案 (1)多肽链 mRNA 密码子具有简并性 (2)从基因文库中获取 人工合成 DNA双链复制 (3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同,导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)取3支试管,并编号为1、2、3,分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素;用酒精消毒,用注射器取同一种动物(如家兔)血液,立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中,静置相同时间,统计三支试管中血液凝固时间
解析 (1)蛋白质工程的基本思路是:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。在生产过程中,mRNA可能不同,但合成的蛋白质空间构象却相同,原因是密码子具有简并性,即一种氨基酸可能对应多种密码子。(3)据题图可知,将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升,且差别不大;而经酶甲处理后,随着酶解时间的延长,抗凝血活性先上升后相对稳定;经酶乙处理后,随着酶解时间的延长,抗凝血活性先上升后下降,且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性。据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、题述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,实验的自变量为水蛭素的差别和有无,因变量为血液凝固时间,实验设计时应遵循对照原则与单一变量原则,其中无关变量应保持相同且适宜。
三年模拟练
1.C 2.CD 3.B 4.D
1.C 第4个循环由8个DNA分子复制形成16个DNA分子,需要8对引物;而PCR经过4个循环,共消耗了15对引物,A错误。脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到引物的3'端,B错误。由于两个引物均不在该片段的端点,因此第一、二个循环产生的DNA分子的两条链均不等长,第三个循环产生的DNA分子中,存在两条核苷酸链等长的DNA分子,即用图中引物扩增至少三个循环后才能获得两端均添加限制酶识别序列的目的产物,D错误。
2.CD 由图可知,提取GNA基因需要限制酶KpnⅠ和BsaBⅠ,提取ACA基因需要限制酶BsaBⅠ和KpnⅠ(或XhoⅠ);①过程为获得融合基因,②过程为构建基因表达载体,两过程均需要使用DNA连接酶,A正确。融合基因和载体都含有限制酶KpnⅠ和XhoⅠ切割位点,且KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点不同,用KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体,只有基因方向正确才能形成重组载体,从而保证基因转录方向正确,B正确。检测出玉米细胞中含有融合基因,不一定能说明抗蚜虫玉米培育成功,因为融合基因可能不能正常表达,C错误。在加入卡那霉素的培养基上存活下来的玉米细胞,可能是成功导入重组载体的玉米细胞,也可能是导入含有卡那霉素抗性基因的非重组载体的玉米细胞,D错误。
3.B DNA片段长度会影响其在电泳时的迁移速率,DNA分子越大,迁移就越慢,据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端,B错误;图2中2号、3号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理后的电泳结果,两个泳道均只出现一种DNA片段,且碱基对数均为1 000,说明该DNA分子可能是含1 000个碱基对的环状DNA,C正确;图2中4号是EcoRⅠ和SmaⅠ两种酶共同处理后的电泳结果,显示800 bp和200 bp两个条带,1 000 bp=800 bp+200 bp,说明在该DNA分子中,两种限制酶的酶切位点不同,如下图所示,D正确。
4.D 分析题干过程,如下所示:
①酚类化合物Vir蛋白产生
②
③
根据以上分析可知,用酚类化合物处理最终可促进T链整合到植物染色体上;农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有侵染能力,因为多数单子叶植物不能合成酚类化合物,而水稻是单子叶植物,因此,可以通过酚类化合物处理提高转化效率,A正确。据以上②③的分析,T-DNA最终整合到植物染色体上,避免了T-DNA在细胞内被降解,B正确。因为T-DNA的整合是随机的,经过转化的植物不一定符合要求,还需经过筛选(抗性、荧光等)才能获得符合要求的转化苗,C正确。据题干信息可知,VirD1/D2蛋白复合体可将Ti质粒上的一段T-DNA单链(T链)切下(不需要限制酶),但T-DNA进入细胞核整合至植物细胞染色体上的过程需要DNA聚合酶和DNA连接酶,D错误。
5.答案 (1)标记基因 以便与外源基因连接 (2)SnaBⅠ和AvrⅡ 防止质粒自身环化以及避免目的基因反向接入质粒 5'-CCTAGG-3' T4 DNA连接酶 (3)能吸收周围环境中DNA分子 复制 (4)BglⅡ 组氨酸 (5)甲醇 酵母菌为真核生物,具有内质网和高尔基体等细胞器,能够对蛋白质进行加工,而细菌没有各种细胞器(除了核糖体),不能形成分泌蛋白
解析 (1)质粒作为基因工程的载体,需含有标记基因,以便于重组质粒的筛选;质粒具有一个或多个限制酶切割位点,以便与外源基因连接。(2)图中质粒含有SnaBⅠ、BglⅡ、AvrⅡ和SacⅠ限制酶切割位点,其中限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ位于启动子和终止子之间,可用这两种酶切割质粒,则在HBsAg基因两侧的A和B位置添加的碱基序列分别是5'-TACGTA-3'、5'-CCTAGG-3';用双酶切的优点是防止质粒自身环化,同时避免目的基因反向接入质粒(保证目的基因定向接入质粒)。用SnaBⅠ酶切得到的是平末端,用AvrⅡ酶切得到的是黏性末端,故应用T4 DNA连接酶将HBsAg基因连接到质粒上。(3)由步骤2的结果(得到较多的重组质粒)分析,步骤1将重组质粒先导入大肠杆菌有利于HBsAg基因在受体细胞中复制。(4)由图可知,SnaBⅠ、AvrⅡ会切下目的基因,SacⅠ会破坏启动子,因此从大肠杆菌中分离的重组质粒经过步骤3得到重组DNA(含有启动子、目的基因和终止子),应选用限制酶BglⅡ来切割。巴斯德毕赤酵母是组氨酸脱氢酶基因(His)缺失突变体,在添加了组氨酸的培养基上才能存活,在不含组氨酸的培养基中可筛选出成功导入了HBsAg基因的酵母细胞。(5)巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母,能以甲醇作为唯一碳源,所以酵母菌在培养基上培养一段时间后,需要向其中加入甲醇以维持其生活。酵母菌为真核生物,细胞内具有对分泌蛋白进行加工的内质网和高尔基体等细胞器,细菌等原核生物不具有内质网和高尔基体等细胞器,不能形成分泌蛋白,所以生产乙肝疫苗的过程中,与细菌相比,酵母菌更适合作为受体细胞。
6.答案 (1)限制性内切核酸(限制) DNA连接酶 (2)CCR5基因 造血干 (3)其他DNA序列也含有与向导RNA(sgRNA)互补配对的序列 高
解析 (1)根据题意“Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端”可知,Cas9蛋白可以识别特定的脱氧核苷酸序列并对其进行切割,其作用相当于限制性内切核酸酶(限制酶);Cas9蛋白切断靶基因DNA形成的两个末端重新连接时需要DNA连接酶。(2)T淋巴细胞是由造血干细胞分裂、分化形成的,则可依据CCR5基因的部分序列设计sgRNA序列,导入骨髓造血干细胞中,构建sgRNA/Cas9复合体,以实现对CCR5基因的定向切割。(3)CRISPR/Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶,其最可能的原因是其他DNA序列也含有与向导RNA(sgRNA)互补配对的序列,造成向导RNA(sgRNA)错误结合而脱靶;sgRNA的序列越短,则能与sgRNA互补配对的DNA序列出现的概率越高,脱靶率会越高。
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