1.2.2微生物的选择培养与计数课件(共33张PPT)2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3
文档属性
| 名称 | 1.2.2微生物的选择培养与计数课件(共33张PPT)2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3 |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 7.5MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-10-31 18:08:21 | ||
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文档简介
(共33张PPT)
第2节
第2课时 微生物的选择培养和计数
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。
1、实例：
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
寻找耐高温的DNA聚合酶
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
一、选择培养基
美国黄石公园
2.概念：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
3.原理：
人为提供_________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时___________________________。
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
4.实验室中微生物的筛选：
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养型微生物
④加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
⑤石油是唯一碳源
能消除石油污染的微生物
③不加含碳有机物的无碳培养基
②不加氮源的无氮培养基
①加入青霉素的培养基
思考：那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
思考讨论：
选择培养基配方的设计
尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。
尿素的立体结构
土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶：
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
配方一：培养细菌
配方二：培养可以分解尿素的细菌
（1）从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？
固体培养基。
配方二是以尿素作唯一氮源的选择培养基
（2）此培养基中共有哪些成分？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源： 葡萄糖、尿素 氮源：尿素
成分：
碳源、氮源、水、无机盐
二、微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
2、实验的具体操作：
(2)土壤取样：
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
注：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
(1)制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
1、稀释涂布平板法:
是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
基本操作：
（1）梯度稀释；（2）涂布平板。
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
(3)样品梯度稀释：
微量移液器
稀释10倍菌液
101
土壤10g
在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰1 ∽2cm处。
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
滴
①取少量稀释液（不超过0.1ml ），滴加到培养基表面
灼
③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。
涂
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注：各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照
浸
(4)取样涂布平板：
（5）培养与观察：
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
2.用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
提示 不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
3.当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。用稀释涂布平板法接种培养结果的图片如下。与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
提示 稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数。
小结：两种接种方法的比较平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具单菌落的获得用途接种效果图相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落接种环涂布器从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。案例:两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、
212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
——间接计数法
1.稀释涂布平板法
（1）原理：
当样品的稀释度足够___时，培养基表面生长的一个____，来源于__________中的一个____；通过计数平板上的____数，就能推测出样品中大约含有多少_____。
高
菌落
样品稀释液
活菌
菌落
活菌
（2）计数原则
①选择菌落数为_______的平板计数
30-300
②同一稀释度下，应至少对___个平板进行重复计数，然后求出______；
3
平均值
样品的______将直接影响平板上的菌落数目；
稀释度
三、微生物的数量测定
（3）结果分析：
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目____；
原因：__________________________________________
______________
②统计结果一般用_______而不是用活菌数来表示；
少
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
菌落数
（4）计算公式：
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M代表稀释倍数
例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
B
2.显微镜直接计数
——直接计数法
（1）方法：
利用特定的___________或_____________在______下观察、计数，然后再计算_________的样品中微生物的数量；
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
血细胞计数板常用于_______________________________等的计数
相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子
细菌计数板可对_________________进行观察和计数；
细菌等较小的细胞
（2）优点：
快速直观
（3）缺点：
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。（数值偏大）
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂且有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌株数＝400×1 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝
平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数
3. 比较直接计数法与间接计数法
(1)选择培养基只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物的生长( )
(2)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基( )
(3)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源( )
判断正误
√
√
×
1.(2021·沂源县第二中学高二期中)下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，正确的是
A.实验中采集的土样经高温灭菌后，可以用于制取土壤稀释液
B.分离土壤中能分解尿素的细菌时，应选择以尿素为唯一氮源的培养基
C.利用显微镜进行直接计数时，可使用普通的载玻片完成计数
D.接种土壤微生物稀释液时，平板划线法通过连续划线的操作使微生
物均匀分布
典题应用
及时反馈 知识落实
√
2.下图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，下列有关叙述错误的是
A.在配制步骤②③的培养基时，应先调pH后湿热灭菌
B.步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较不同种细菌分解尿素的
能力
√
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.提出问题（实验目的）
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
3.实验步骤
（1）土壤取样
①取样地点要求：
酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
②取样过程：
铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源。
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
③KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
提供无机盐；
调节pH。
（3）样品的稀释与涂布平板
（稀释涂布平板法）
注：测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
①判断培养基中是否有杂菌污染：
将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基是否具有筛选作用：
完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）接种后培养观察菌落数目。
主要目的是排除实验组中非测试因素（无关变量）对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
设置对照
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）
（5）结果分析
现象
分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
*防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
不同菌落的颜色与形状
(6)操作提示
②无菌操作
③做好标记
本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
④制定计划
对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。
①不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
a、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
b、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入
锥形瓶中，塞好棉塞。
c、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
3.利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？
提示 不一定。因为有些微生物可以利用尿素分解菌的代谢产物进行生长繁殖。
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
（6）进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
①原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
②方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况；
固体培养基：
(1)稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数( )
(2)测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同( )
(3)菌落特征是鉴别菌种的重要依据( )
(4)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量( )
判断正误
√
×
√
×
3.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏
蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后
不会使酚红指示剂变红
典题应用
及时反馈 知识落实
√
4.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，其中正确的是
A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是13、234和254，取平均值167
D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别为210、240和250，取平均值233
√
搁置斜面
1.临时保藏：
接种到试管固体斜面培养基上，培养长成菌落，4℃冰箱保存。（菌种易被污染、变异）
2.长期保存：
（1ml甘油（灭菌）＋1ml菌液）
课题延伸（菌种的保藏）
采用甘油管藏法， -20℃保存
第2节
第2课时 微生物的选择培养和计数
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。
1、实例：
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。
寻找耐高温的DNA聚合酶
筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
一、选择培养基
美国黄石公园
2.概念：
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
3.原理：
人为提供_________________的条件（包括_____、_____和_____等），同时___________________________。
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
4.实验室中微生物的筛选：
分离酵母菌、霉菌等真菌
分离固氮菌
分离自养型微生物
④加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
⑤石油是唯一碳源
能消除石油污染的微生物
③不加含碳有机物的无碳培养基
②不加氮源的无氮培养基
①加入青霉素的培养基
思考：那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
思考讨论：
选择培养基配方的设计
尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。
尿素的立体结构
土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶：
CO(NH2)2+H2O
脲酶
CO2+2NH3
1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
配方一：培养细菌
配方二：培养可以分解尿素的细菌
（1）从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？
固体培养基。
配方二是以尿素作唯一氮源的选择培养基
（2）此培养基中共有哪些成分？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源： 葡萄糖、尿素 氮源：尿素
成分：
碳源、氮源、水、无机盐
二、微生物的选择培养
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
2、实验的具体操作：
(2)土壤取样：
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
注：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
(1)制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
1、稀释涂布平板法:
是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
基本操作：
（1）梯度稀释；（2）涂布平板。
6支试管，分别加入9ml无菌水
1ml
102
1ml
103
1ml
104
1ml
105
1ml
106
1ml
107
(3)样品梯度稀释：
微量移液器
稀释10倍菌液
101
土壤10g
在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰1 ∽2cm处。
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
滴
①取少量稀释液（不超过0.1ml ），滴加到培养基表面
灼
③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。
涂
④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
注：各梯度分别涂布3个平板,1个不涂布作空白对照
浸
(4)取样涂布平板：
（5）培养与观察：
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
稀释涂布平板法除可以分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。
2.用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
提示 不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。
3.当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。用稀释涂布平板法接种培养结果的图片如下。与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
提示 稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数。
小结：两种接种方法的比较平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具单菌落的获得用途接种效果图相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落接种环涂布器从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。案例:两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、
212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
——间接计数法
1.稀释涂布平板法
（1）原理：
当样品的稀释度足够___时，培养基表面生长的一个____，来源于__________中的一个____；通过计数平板上的____数，就能推测出样品中大约含有多少_____。
高
菌落
样品稀释液
活菌
菌落
活菌
（2）计数原则
①选择菌落数为_______的平板计数
30-300
②同一稀释度下，应至少对___个平板进行重复计数，然后求出______；
3
平均值
样品的______将直接影响平板上的菌落数目；
稀释度
三、微生物的数量测定
（3）结果分析：
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目____；
原因：__________________________________________
______________
②统计结果一般用_______而不是用活菌数来表示；
少
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
菌落数
（4）计算公式：
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M代表稀释倍数
例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
B
2.显微镜直接计数
——直接计数法
（1）方法：
利用特定的___________或_____________在______下观察、计数，然后再计算_________的样品中微生物的数量；
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
血细胞计数板常用于_______________________________等的计数
相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子
细菌计数板可对_________________进行观察和计数；
细菌等较小的细胞
（2）优点：
快速直观
（3）缺点：
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。（数值偏大）
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具 显微镜、细菌计数板或血细胞计数板 涂布器
计数依据 细菌个数 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 不能区分死菌与活菌 操作较复杂且有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌株数＝400×1 000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数＝
平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数
3. 比较直接计数法与间接计数法
(1)选择培养基只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物的生长( )
(2)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基( )
(3)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源( )
判断正误
√
√
×
1.(2021·沂源县第二中学高二期中)下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，正确的是
A.实验中采集的土样经高温灭菌后，可以用于制取土壤稀释液
B.分离土壤中能分解尿素的细菌时，应选择以尿素为唯一氮源的培养基
C.利用显微镜进行直接计数时，可使用普通的载玻片完成计数
D.接种土壤微生物稀释液时，平板划线法通过连续划线的操作使微生
物均匀分布
典题应用
及时反馈 知识落实
√
2.下图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，下列有关叙述错误的是
A.在配制步骤②③的培养基时，应先调pH后湿热灭菌
B.步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，以获得单菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较不同种细菌分解尿素的
能力
√
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.提出问题（实验目的）
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
2.实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
3.实验步骤
（1）土壤取样
①取样地点要求：
酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。
②取样过程：
铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。
③注意事项：
取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。
（2）制备培养基
①选择培养基：
以尿素为唯一氮源。
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
②牛肉膏蛋白胨培养基：
作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
③KH2PO4和Na2HPO4的作用是：
提供无机盐；
调节pH。
（3）样品的稀释与涂布平板
（稀释涂布平板法）
注：测细菌时，一般选用104、105、106倍稀释的稀释液进行平板培养
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
①判断培养基中是否有杂菌污染：
将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基是否具有筛选作用：
完全培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）接种后培养观察菌落数目。
主要目的是排除实验组中非测试因素（无关变量）对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
设置对照
（4）微生物的培养与观察
①培养条件：
不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
（细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d）
②观察：
每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等）
（5）结果分析
现象
分析
未涂布培养基上无菌落生长
未涂布培养基上有菌落生长
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目
培养基未被杂菌污染
培养基被杂菌污染
选择培养基具有选择作用
*防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
不同菌落的颜色与形状
(6)操作提示
②无菌操作
③做好标记
本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。
④制定计划
对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。
①不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
a、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。
b、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入
锥形瓶中，塞好棉塞。
c、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。
3.利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？
提示 不一定。因为有些微生物可以利用尿素分解菌的代谢产物进行生长繁殖。
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
（6）进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定
①原理：
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
②方法：
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红：
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况；
固体培养基：
(1)稀释涂布平板法能分离细菌，也能计数( )
(2)测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同( )
(3)菌落特征是鉴别菌种的重要依据( )
(4)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量( )
判断正误
√
×
√
×
3.下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，错误的是
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置未接种的牛肉膏
蛋白胨培养基作为对照
C.该实验应采用稀释涂布平板法
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后
不会使酚红指示剂变红
典题应用
及时反馈 知识落实
√
4.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，其中正确的是
A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是13、234和254，取平均值167
D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别为210、240和250，取平均值233
√
搁置斜面
1.临时保藏：
接种到试管固体斜面培养基上，培养长成菌落，4℃冰箱保存。（菌种易被污染、变异）
2.长期保存：
（1ml甘油（灭菌）＋1ml菌液）
课题延伸（菌种的保藏）
采用甘油管藏法， -20℃保存