第3章 第1节
基 础 题 组
一、选择题
1．下列关于DNA的粗提取和鉴定实验的叙述，正确的是( )
A．用猪血作为材料，原因是猪血红细胞有细胞核
B．用二苯胺试剂进行鉴定，原因是DNA溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色
C．用酒精进行提纯，原因是DNA溶于酒精，蛋白质不溶于酒精
D．用不同浓度的NaCl溶液进行DNA粗提取，原因是DNA在其中溶解度不同
2．(2023·河南高二实验中学校考期中)有关限制性内切核酸酶的描述，错误的是( )
A．化学本质是蛋白质
B．活性受温度影响
C．能识别和切割RNA
D．可从原核生物中提取
3．下列关于质粒的叙述，正确的是( )
A．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B．质粒是细菌细胞质中能够自主复制的小型环状DNA分子
C．细菌质粒和真核细胞DNA的基本结构单位不同
D．细菌质粒的复制过程一定是在细胞外独立进行的
4．(2023·吉林长春高二第八中学校考阶段练习)下列关于如图所示黏性末端的叙述，不正确的是( )
A．①与③是由相同限制酶切割产生的
B．DNA连接酶可催化①与③的连接
C．经酶切形成④需要2分子水
D．DNA聚合酶不能作用于上述黏性末端
5．下列关于生物学实验的相关叙述，正确的是( )
A．提取绿叶中色素的实验中，研磨时加入过量的CaCO3会破坏叶绿素
B．观察洋葱根尖细胞有丝分裂时，可观察到一个细胞连续分裂过程
C．显微镜观察黑藻细胞分裂时，中心体会在间期复制，前期发出星射线形成纺锤体
D．鉴定还原性糖的斐林试剂和鉴定DNA的二苯胺试剂都需要现配现用
6．(2023·陕西省神木中学校考阶段练习)研究人员从萤火虫腹部提取出荧光酶基因并将它转入到植物体细胞内，创造出夜晚能发出荧光的植物。下列相关叙述错误的是( )
A．荧光植物的育种方法为基因工程，需要使用限制酶和DNA聚合酶
B．该荧光酶基因表达产物能催化萤火虫腹部的一系列反应从而发光
C．荧光植物的诞生证明基因可通过控制酶的合成控制生物性状
D．荧光酶基因能在植物细胞内表达，证明生物共用同一套遗传密码子
二、非选择题
7．(2023·河北张家口尚义县第一中学校考阶段练习)下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，回答下列问题：
(1)1970年，阿尔伯(W.Arber)等在细菌中发现了第一个限制酶，而在该细菌中没有此限制酶的识别序列，推测该限制酶在细菌细胞中的作用可能是___。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为 —A
—TGCGC，则与之连接的目的基因切割末端应为 ；可使用___把质粒和目的基因连接在一起。若“缝合”两个双链DNA片段的平末端，需用___酶连接。
(3)常用的载体除质粒外，还有___(填两种)。
能 力 提 升
一、选择题
1．(2023·河北省滦州市第二中学校考期中)DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( )
A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C．只能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D．T4 DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，也能连接平末端
2．下列有关基因工程中使用的工具酶的叙述，正确的是( )
A．DNA连接酶是从T4噬菌体中分离出来的酶
B．限制酶主要是从真核生物细胞中分离纯化出来的
C．识别不同核苷酸序列的限制酶，切割的末端可能相同
D．T4 DNA连接酶连接黏性末端和平末端的效率相同
3．(2023·江苏徐州高二统考阶段练习)生物工程是一门生物科学与工程技术有机结合而兴起的一门综合性的科学技术，近些年来发展迅猛，硕果累累，下列关于生物工程的说法，不正确的是( )
A．植物体细胞杂交和动物细胞融合技术的原理是一样的，植物组织培养和动物细胞培养技术的原理是不同的
B．从理论上讲，基因工程和细胞工程都可以定向改造生物的遗传物质和克服远缘杂交不亲和的障碍
C．基因工程的工具酶有限制酶、DNA连接酶等，细胞工程的工具酶有纤维素酶、胰蛋白酶等
D．通过基因工程和发酵工程可以生产出乙肝疫苗、胰岛素、某些种类的单克隆抗体
4．科学家卡彭蒂耶和杜德纳因利用CRISPR/Cas9系统编辑生物的基因组DNA而被授予诺贝尔化学奖。该技术需要向细胞中加入人工合成的引导RNA和一种来自细菌的Cas9蛋白，工作原理如图所示。下列相关叙述错误的是( )
A．Cas9是一种能使磷酸二酯键发生断裂的蛋白质分子
B．细菌可凭借细胞中的CRISPR/Cas9抵抗噬菌体入侵
C．在引导RNA中存在着A—T、G—C碱基互补配对方式
D．人为改变引导RNA的序列可改变Cas9的切割部位
5．(2023·陕西延安高二校考期中)下表为常用的限制性内切核酸酶及其识别序列和切割位点，有关说法正确的是( )
限制性内切核酸酶 识别序列和切割位点 限制性核酸内切酶 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ G↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
(注：Y表示C或T，R表示A或G)
A．限制性内切核酸酶的切点位于识别序列的内部
B．限制性内切核酸酶切割后不一定形成黏性末端
C．一种限制性内切核酸酶只能识别一种脱氧核苷酸序列
D．不同限制性内切核酸酶切割后一定形成不同的黏性末端
6．下图是4种限制酶的识别序列及其酶切位点，下列叙述错误的是( )
A．不同类型的限制酶切割后，有的产生黏性末端，有的产生平末端
B．不同类型的限制酶切割后可能产生相同的黏性末端
C．用酶1和酶2分别切割目的基因和质粒，连接形成重组DNA分子后，重组DNA分子不能被酶2识别
D．用酶3和酶4分别切割目的基因和质粒后，其产物经T4 DNA连接酶催化能连接形成重组DNA分子
7．(2023·安徽六安舒城中学校考期中)下列关于各种酶作用的叙述，错误的是( )
A．解旋酶的作用是把两条螺旋的双链解开
B．DNA连接酶连接不同脱氧核苷酸的磷酸基和脱氧核糖
C．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，并催化遗传信息的转录
D．一种限制性内切核酸酶能识别多种核苷酸序列，可切割出多种目的基因
二、非选择题
8．(2023·黑龙江大庆高二铁人中学校考期中)家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒作为载体，图2为含W基因的DNA片段。回答下列问题：
(1)常见的乳酸菌除乳酸杆菌外，还有___。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产生酸性物质，抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的正常功能，请写出相关的反应式： 。
(2)利用PCR技术扩增W基因时，用到的DNA聚合酶与普通的酶相比，具有的特点是___。扩增完成后，常采用___法来鉴定PCR的产物。为得到含W基因的乳酸杆菌，可采用平板划线法纯化乳酸杆菌，进行划线操作要注意：___(写出2点即可)。
(3)W基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA自身延伸的方向为5′→3′。下表是几种限制酶的识别序列及切割位点，图1、图2标注了相关限制酶的酶切位点。为获得能正确表达W基因的重组质粒，应分别使用哪些限制酶对质粒和含W基因的DNA片段进行切割？
质粒：_限__，含W基因的DNA片段：___。
限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ KpnⅠ Mfe Ⅰ Hind Ⅲ
识别序列及切割位点
第3章 第1节
基 础 题 组
一、选择题
1．下列关于DNA的粗提取和鉴定实验的叙述，正确的是( D )
A．用猪血作为材料，原因是猪血红细胞有细胞核
B．用二苯胺试剂进行鉴定，原因是DNA溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色
C．用酒精进行提纯，原因是DNA溶于酒精，蛋白质不溶于酒精
D．用不同浓度的NaCl溶液进行DNA粗提取，原因是DNA在其中溶解度不同
解析： 猪是哺乳动物，做DNA粗提取和鉴定实验时，实验材料用鸡血而不用猪血，原因是哺乳动物的成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不含DNA，A错误；DNA溶液加入二苯胺试剂必须在沸水浴条件下才呈现蓝色，B错误；在对DNA提纯时，由于DNA不溶于酒精，而其他杂质可以溶于酒精，因此可以除去溶于酒精的杂质，C错误；由于DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，根据此原理可以对DNA粗提取，D正确。故选D。
2．(2023·河南高二实验中学校考期中)有关限制性内切核酸酶的描述，错误的是( C )
A．化学本质是蛋白质
B．活性受温度影响
C．能识别和切割RNA
D．可从原核生物中提取
解析： 限制酶的化学本质是蛋白质，A正确；酶的作用条件温和，受温度、pH等条件的影响，B正确；限制酶只能识别和切割DNA，C错误；限制酶主要从原核生物中提取，D正确。故选C。
3．下列关于质粒的叙述，正确的是( B )
A．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B．质粒是细菌细胞质中能够自主复制的小型环状DNA分子
C．细菌质粒和真核细胞DNA的基本结构单位不同
D．细菌质粒的复制过程一定是在细胞外独立进行的
解析： 质粒广泛存在于细菌细胞中，是细菌细胞质中能够自主复制的小型环状DNA分子，不是细胞器，A错误；质粒是细菌细胞质中能够自主复制的小型环状DNA分子，B正确；细菌质粒是环状DNA分子，和真核细胞DNA的基本结构单位相同，均为脱氧核苷酸，C错误；有的质粒可以整合到宿主细胞的染色体DNA上，伴随宿主细胞一起复制，如Ti质粒的T－DNA，D错误。故选B。
4．(2023·吉林长春高二第八中学校考阶段练习)下列关于如图所示黏性末端的叙述，不正确的是( A )
A．①与③是由相同限制酶切割产生的
B．DNA连接酶可催化①与③的连接
C．经酶切形成④需要2分子水
D．DNA聚合酶不能作用于上述黏性末端
解析： 不同限制酶切割生成的黏性末端也会相同，因此①与③不一定是由相同限制酶切割产生的，A错误；由于①与③的黏性末端相同，所以DNA连接酶可催化①与③的拼接，B正确；形成④需要断裂两个磷酸二酯键，因此需要消耗2分子的水，C正确；DNA聚合酶无法作用于黏性末端，它是在DNA复制时连接单个脱氧核苷酸，D正确。故选A。
5．下列关于生物学实验的相关叙述，正确的是( D )
A．提取绿叶中色素的实验中，研磨时加入过量的CaCO3会破坏叶绿素
B．观察洋葱根尖细胞有丝分裂时，可观察到一个细胞连续分裂过程
C．显微镜观察黑藻细胞分裂时，中心体会在间期复制，前期发出星射线形成纺锤体
D．鉴定还原性糖的斐林试剂和鉴定DNA的二苯胺试剂都需要现配现用
解析： 提取绿叶中色素的实验中，研磨时加入的CaCO3是为了保护叶绿素，A错误；制作洋葱根尖细胞有丝分裂临时装片，其中的细胞均为死细胞，不能观察到一个细胞连续分裂过程，B错误；黑藻是高等植物，不含有中心体，C错误；斐林试剂和二苯胺试剂都是现配现用的，否则将无法得到相应的实验现象，D正确。故选D。
6．(2023·陕西省神木中学校考阶段练习)研究人员从萤火虫腹部提取出荧光酶基因并将它转入到植物体细胞内，创造出夜晚能发出荧光的植物。下列相关叙述错误的是( A )
A．荧光植物的育种方法为基因工程，需要使用限制酶和DNA聚合酶
B．该荧光酶基因表达产物能催化萤火虫腹部的一系列反应从而发光
C．荧光植物的诞生证明基因可通过控制酶的合成控制生物性状
D．荧光酶基因能在植物细胞内表达，证明生物共用同一套遗传密码子
解析： 荧光植物采用基因工程育种的方法，需要使用限制酶和DNA连接酶，A错误；酶具有催化作用，荧光酶基因表达产物能催化萤火虫腹部的一系列反应从而发光，B正确；题中信息体现了基因可通过控制酶的合成来控制细胞代谢，进而控制生物的性状，C正确；所有生物通用一套遗传密码子，保证了生物之间的基因能够进行转移并表达，荧光酶基因能在植物细胞内表达，证明生物共用同一套遗传密码子，D正确。故选A。
二、非选择题
7．(2023·河北张家口尚义县第一中学校考阶段练习)下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，回答下列问题：
(1)1970年，阿尔伯(W.Arber)等在细菌中发现了第一个限制酶，而在该细菌中没有此限制酶的识别序列，推测该限制酶在细菌细胞中的作用可能是_切割外来DNA，起到防御作用__。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为 —A
—TGCGC，则与之连接的目的基因切割末端应为 CGCGT—
A— ；可使用_DNA连接酶__把质粒和目的基因连接在一起。若“缝合”两个双链DNA片段的平末端，需用_T4_DNA连接__酶连接。
(3)常用的载体除质粒外，还有_噬菌体、动植物病毒__(填两种)。
解析：(1)细菌中没有此限制酶的识别序列，该限制酶在细菌细胞中的作用可能是切割外来DNA，起到防御作用。(2)若质粒DNA分子的切割末端为 —A
—TGCGC，根据碱基互补配对原则，则与之连接的目的基因切割末端应为 CGCGT—
A—；可使用DNA连接酶把质粒和目的基因连接在一起。若“缝合”两个双链DNA片段的平末端，需用T4 DNA连接酶连接。(3)常用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒。
能 力 提 升
一、选择题
1．(2023·河北省滦州市第二中学校考期中)DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( D )
A．能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B．能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C．只能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D．T4 DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，也能连接平末端
解析： DNA连接酶连接的是磷酸二酯键，A错误；DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键，B错误；DNA连接酶能连接用不同种限制酶切开的具有相同黏性末端的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键，C错误；T4 DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，D正确。故选D。
2．下列有关基因工程中使用的工具酶的叙述，正确的是( C )
A．DNA连接酶是从T4噬菌体中分离出来的酶
B．限制酶主要是从真核生物细胞中分离纯化出来的
C．识别不同核苷酸序列的限制酶，切割的末端可能相同
D．T4 DNA连接酶连接黏性末端和平末端的效率相同
解析： DNA连接酶按来源不同分为E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，而T4 DNA连接酶是从T4噬菌体中分离纯化出来的酶，A错误；限制酶主要是从原核生物细胞中分离纯化出来的，B错误；识别不同核苷酸序列的限制酶，切割后露出的末端可能相同，C正确；T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，但是连接平末端的效率低，D错误。故选C。
3．(2023·江苏徐州高二统考阶段练习)生物工程是一门生物科学与工程技术有机结合而兴起的一门综合性的科学技术，近些年来发展迅猛，硕果累累，下列关于生物工程的说法，不正确的是( A )
A．植物体细胞杂交和动物细胞融合技术的原理是一样的，植物组织培养和动物细胞培养技术的原理是不同的
B．从理论上讲，基因工程和细胞工程都可以定向改造生物的遗传物质和克服远缘杂交不亲和的障碍
C．基因工程的工具酶有限制酶、DNA连接酶等，细胞工程的工具酶有纤维素酶、胰蛋白酶等
D．通过基因工程和发酵工程可以生产出乙肝疫苗、胰岛素、某些种类的单克隆抗体
解析： 植物体细胞杂交包括两大步骤，一是细胞融合，其原理是细胞膜的流动性，二是植物组织培养，其原理是植物细胞的全能性，动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性和细胞的增殖，A错误；基因工程和细胞工程都可以定向改造生物的遗传性状，B正确；植物体细胞杂交时，需要采用纤维素酶和果胶酶去壁；动物细胞培养时，需要采用胰蛋白酶对组织进行消耗处理，获得单个细胞；基因工程需要限制酶和DNA连接酶，C正确；利用基因工程和发酵工程可以生产生物药品，如乙肝疫苗、胰岛素、单克隆抗体等，D正确。故选A。
4．科学家卡彭蒂耶和杜德纳因利用CRISPR/Cas9系统编辑生物的基因组DNA而被授予诺贝尔化学奖。该技术需要向细胞中加入人工合成的引导RNA和一种来自细菌的Cas9蛋白，工作原理如图所示。下列相关叙述错误的是( C )
A．Cas9是一种能使磷酸二酯键发生断裂的蛋白质分子
B．细菌可凭借细胞中的CRISPR/Cas9抵抗噬菌体入侵
C．在引导RNA中存在着A—T、G—C碱基互补配对方式
D．人为改变引导RNA的序列可改变Cas9的切割部位
解析： 据图可知，Cas9蛋白功能类似于基因工程中限制酶的作用，Cas9能够切割DNA，是一种能使磷酸二酯键断裂的酶，化学本质为蛋白质，A正确；Cas9蛋白功能类似于限制酶，可切割外源DNA，保护自身，B正确；据图可知，引导RNA有折叠成双链的片段，故在单链引导RNA中也存在碱基互补配对，但RNA没有碱基T，不存在A—T配对，C错误；引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，人为改变引导RNA的序列可实现对特定基因的切割，D正确。故选C。
5．(2023·陕西延安高二校考期中)下表为常用的限制性内切核酸酶及其识别序列和切割位点，有关说法正确的是( B )
限制性内切核酸酶 识别序列和切割位点 限制性核酸内切酶 识别序列和切割位点
BamHⅠ G↓GATCC KpnⅠ GGTAC↓C
EcoRⅠ G↓AATTC Sau3AⅠ ↓GATC
HindⅡ GTY↓RAC SmaⅠ CCC↓GGG
(注：Y表示C或T，R表示A或G)
A．限制性内切核酸酶的切点位于识别序列的内部
B．限制性内切核酸酶切割后不一定形成黏性末端
C．一种限制性内切核酸酶只能识别一种脱氧核苷酸序列
D．不同限制性内切核酸酶切割后一定形成不同的黏性末端
解析： 根据表格分析，限制性内切核酸酶的切点不一定位于识别序列的内部，也可能在识别位点的外部，如Sau3AⅠ，A错误；限制性内切核酸酶切割后不一定形成黏性末端，也可能是平末端，如HindⅡ、SmaⅠ，B正确；一种限制性内切核酸酶不一定只能识别一种脱氧核苷酸序列，如HindⅡ能识别多种序列，C错误；不同限制性内切核酸酶切割后也可以形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3AⅠ，D错误。故选B。
6．下图是4种限制酶的识别序列及其酶切位点，下列叙述错误的是( C )
A．不同类型的限制酶切割后，有的产生黏性末端，有的产生平末端
B．不同类型的限制酶切割后可能产生相同的黏性末端
C．用酶1和酶2分别切割目的基因和质粒，连接形成重组DNA分子后，重组DNA分子不能被酶2识别
D．用酶3和酶4分别切割目的基因和质粒后，其产物经T4 DNA连接酶催化能连接形成重组DNA分子
解析： 结合图示可知，不同类型的限制酶切割后，有的产生黏性末端(酶1和酶2)，有的产生平末端(酶3和酶4)，A正确；不同类型的限制酶切割后可能产生相同的黏性末端，如图中的酶1和酶2，B正确；用酶1和酶2分别切割目的基因和质粒，形成的末端序列相同，连接形成重组DNA分子后，重组DNA分子仍能被酶2识别，C错误；用酶3和酶4分别切割目的基因和质粒后，产生的是平末端，而T4 DNA连接酶能将平末端连接起来，即用酶3和酶4切割目的基因和质粒形成的产物经T4 DNA连接酶催化可以连接形成重组DNA分子，D正确。故选C。
7．(2023·安徽六安舒城中学校考期中)下列关于各种酶作用的叙述，错误的是( D )
A．解旋酶的作用是把两条螺旋的双链解开
B．DNA连接酶连接不同脱氧核苷酸的磷酸基和脱氧核糖
C．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，并催化遗传信息的转录
D．一种限制性内切核酸酶能识别多种核苷酸序列，可切割出多种目的基因
解析： DNA解旋酶的作用是作用于氢键，把两条链解开，A正确；DNA连接酶连接不同脱氧核苷酸的磷酸基和脱氧核糖，形成磷酸二酯键，B正确；RNA聚合酶与基因非编码区上的特定位点结合，催化基因转录，C正确；一种限制性内切核酸酶只能识别特定的核苷酸序列，D错误。故选D。
二、非选择题
8．(2023·黑龙江大庆高二铁人中学校考期中)家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌能分泌一种可降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因，需使用图1中质粒作为载体，图2为含W基因的DNA片段。回答下列问题：
(1)常见的乳酸菌除乳酸杆菌外，还有_乳酸链球菌__。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产生酸性物质，抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的正常功能，请写出相关的反应式： C6H12O62C3H6O3＋能量 。
(2)利用PCR技术扩增W基因时，用到的DNA聚合酶与普通的酶相比，具有的特点是_耐高温__。扩增完成后，常采用_琼脂糖凝胶电泳__法来鉴定PCR的产物。为得到含W基因的乳酸杆菌，可采用平板划线法纯化乳酸杆菌，进行划线操作要注意：_从第一次划线的末端开始进行第二次划线；不要将最后一次的划线与第一次的划线相连；每次划线前要灼烧接种环；在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环__(写出2点即可)。
(3)W基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA自身延伸的方向为5′→3′。下表是几种限制酶的识别序列及切割位点，图1、图2标注了相关限制酶的酶切位点。为获得能正确表达W基因的重组质粒，应分别使用哪些限制酶对质粒和含W基因的DNA片段进行切割？
质粒：_限制酶HindⅢ、MfeⅠ__，含W基因的DNA片段：_限制酶HindⅢ、EcoRⅠ__。
限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ KpnⅠ Mfe Ⅰ Hind Ⅲ
识别序列及切割位点
解析：(1)乳酸菌属于原核生物，常见的乳酸菌除乳酸杆菌外，还有乳酸链球菌；乳酸杆菌在无氧条件下进行无氧呼吸，产生乳酸，其反应式为：C6H12O62C3H6O3＋能量。(2)PCR是一项体外扩增DNA的技术，该过程中温度可能达到90 ℃左右，故用到的DNA聚合酶与普通的酶相比，具有的特点是耐高温；PCR的产物为DNA，其鉴定方法是琼脂糖凝胶电泳法；用平板划线法纯化乳酸杆菌，目的是得到单菌落，且该过程应注意无菌操作，故进行划线操作要注意的是：从第一次划线的末端开始进行第二次划线；不要将最后一次的划线与第一次的划线相连；每次划线前要灼烧接种环；在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。(3)选择限制酶时应注意：不能破坏目的基因，质粒要确保至少含有一个完整的标记基因，目的基因和质粒切割后形成的黏性末端还要能互补配对，据图分析，BamHⅠ会切割到启动子，EcoRⅠ在质粒上有两个酶切位点，故均不能选择，MfeⅠ与EcoRⅠ切割后产生的黏性末端相同，但MfeⅠ会破坏目的基因，故质粒使用限制酶MfeⅠ、HindⅢ切割，含W基因的DNA片段使用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ切割(能切下目的基因)。(共71张PPT)
第3章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
1．简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
2．认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3．进行DNA的粗提取与鉴定。
1．科学思维——模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。
2．社会责任——关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生了基因工程。
知识点一
课堂达标 巩固训练
指点迷津 拨云见日
知识点二
知识点三
知识点四
知识点一 基因工程的概念与限制性内切核酸酶
基础知识 双基夯实
一、基因工程的概念
1．操作场所：___________。
2．操作技术：_________等技术。
3．操作结果：赋予生物新的___________，创造出更符合人们需要的新的___________和生物产品。
4．操作水平：_____________水平。
生物体外
转基因
遗传特性
生物类型
DNA分子
二、重组DNA技术的基本工具
限制性内切核酸酶(又称限制酶)——“分子手术刀”
1．来源：主要来自___________。
2．功能：能够识别双链DNA分子的某种特定_____________，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_____________断开。
3．结果：产生___________或_________。
原核生物
核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
平末端
活 | 学 | 巧 | 练
1.基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。( )
2．限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。( )
3．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。( )
√
×
√
合 | 作 | 探 | 究
为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？
提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵，原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA而保护自身。原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子，因为酶具有专一性或自己的DNA分子已被修饰而不被识别。
课内探究 名师点睛
1．限制酶作用特点
(1)切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，从而达到保护自身的目的。
(2)专一性：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
2．限制酶作用结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
(1)黏性末端：错位切，在识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开，产生的是黏性末端，如下图。
(2)平末端：平切，沿着识别序列的中心轴线切开，产生的是平末端，如下图。
如图表示限制酶切割某DNA分子的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切割位点是( )
A．5′－CTTAAG－3′，切点在C和T之间
B．5′－CTTAAG－3′，切点在G和A之间
C．5′－GAATTC－3′，切点在G和A之间
D．5′－CTTAAC－3′，切点在C和T之间
典例1
C
解析：两条链均按照5′→3′方向分析，由题图可知该限制酶识别的碱基序列为5′－GAATTC－3′，并在G与A之间断开磷酸二酯键，故选C。
对下图所示黏性末端的说法，正确的是( )
A．甲、乙、丙黏性末端是由两种限制性内切核酸酶作用产生的
B．图乙中的酶切位点在A与G之间
C．如果甲中的G突变为A，则原限制性内切核酸酶不能识别该切割位点
D．构建基因表达载体所用的限制酶和DNA连接酶分别作用于a处和b处
变式训练
C
解析： 根据题图结果可知，切割甲的限制酶的识别序列是—GAATTC—，切割乙的限制酶的识别序列是—CAATTG—，切割丙的限制酶的识别序列是—CTTAAG—，故甲、乙、丙三个黏性末端是由三种限制酶作用产生的，A项错误；图乙中的酶切位点在A与C之间，而不是A与G之间，B项错误；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，如果甲中的G发生突变，则限制酶不能识别该切割位点，C项正确；构建基因表达载体所用的限制酶和DNA连接酶的作用位点均是磷酸二酯键即a处，b处为氢键，D项错误。
知识点二 DNA连接酶及与DNA分子相关的几种酶的分析
基础知识 双基夯实
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_____________。
(2)种类[填表]
种类 比较 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 ___________ _____________
特点 只能连接___________ 既可以连接黏性末端，
又可以连接_________
磷酸二酯键
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
平末端
活 | 学 | 巧 | 练
1.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。( )
2．DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键形成重组DNA。( )
3．DNA连接酶能连接所有相同或互补的黏性末端，故该酶没有专一性。( )
×
×
×
合 | 作 | 探 | 究
限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？
提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，体现了酶的专一性。E.coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA分子的平末端，都对末端的碱基序列没有要求，因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。
课内探究 名师点睛
1．限制酶与DNA连接酶的比较
项目 限制酶 DNA连接酶
不 同 点 作用 使特定部位的磷酸二酯键断裂 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键
应用 用于提取目的基因和切割载体 用于基因表达载体的构建
关系 2.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
种类 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 催化形成磷酸二酯键 不 同 点 模板 不需要模板 需要以DNA的一条链为模板
作用 过程 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键
作用 结果 形成完整的DNA分子 形成DNA的一条链
用途 基因工程等 DNA复制
3.限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、DNA水解酶、解旋酶的作用部位图解
(1)作用于磷酸二酯键的酶：限制酶(a断开)、DNA连接酶(a形成)和DNA聚合酶(a形成)、DNA水解酶(a断开)。
(2)作用于b(氢键)的酶：解旋酶。
氢键的形成是由于分子间的作用力，其断裂与重新形成均与限制酶、DNA连接酶无关。
下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E.coli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接
C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸
典例2
C
解析：T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，A错误；E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接，B错误；DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接起来，C正确，D错误。
在基因工程操作过程中，DNA连接酶的作用是( )
A．将任意两个DNA片段连接起来
B．将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来，包括DNA片段和碱基对之间的氢键
C．连接具有互补黏性末端或平末端的DNA片段，即形成磷酸二酯键
D．只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键
解析：DNA连接酶将具有互补的黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
变式训练
C
知识点三 基因进入受体细胞的载体
基础知识 双基夯实
1．质粒
(1)质粒的本质：是一种裸露的、结构简单，独立于__________ _________或_____________________之外，并具有___________能力的环状双链DNA分子。
(2)质粒适于作基因运载体的特点
①质粒分子上有一个至多个_____________位点，供外源DNA片段插入其中。
真核细胞的
细胞核
原核细胞拟核DNA
自我复制
限制酶切割
②携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中_______________，或_____________________，随_________________同步复制。
③人工改造的质粒常带有___________，便于________________ _______。
2．噬菌体、动植物病毒等。
进行自我复制
整合到受体DNA上
受体细胞DNA
标记基因
重组DNA分子的
筛选
活 | 学 | 巧 | 练
1.载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。( )
2．所有的质粒都可以作为载体。( )
3．基因工程中的载体与细胞膜上的载体成分一样。( )
√
×
×
合 | 作 | 探 | 究
1.所有载体都是质粒吗？为什么？
提示：不是；除了质粒外，载体还有动植物病毒和噬菌体。
2．将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
提示：不可行；因为如果没有载体，导入受体细胞后，目的基因无法进行自我复制和稳定存在以及表达。
3．质粒上的一些抗生素抗性基因有什么作用？
提示：作为标记基因，对重组DNA进行筛选，检测目的基因是否导入受体细胞。
课内探究 名师点睛
1．载体的功能
(1)作为运载工具将目的基因转运到宿主细胞内。
(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2．常用的载体——质粒
(1)存在场所：细菌、真菌等生物的细胞质。
(2)本质：环状DNA分子。
(3)特点：含有标记基因。
(4)载体必须具备的条件
①能在受体细胞内稳定保存并大量复制。
②有一至多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。
③具有某些标记基因，以便进行筛选。
④载体应对受体细胞无毒害作用，否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
基因工程中的载体与载体蛋白的区别
基因工程中的载体 载体蛋白
来源 质粒、噬菌体、动植物病毒 细胞膜上的蛋白质
作用 将目的基因转移到宿主细胞中，并能在宿主细胞中对目的基因进行大量复制 运载要进出细胞的某些物质
质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于原核细胞的细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
典例3
D
解析：质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布，A项错误；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点而成为合适的运载目的基因的工具，B项错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C项错误；质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择，D项正确。
某研究所的研究人员拟将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，已知质粒中存在两个抗性基因：A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，目的基因要插入到基因B中，且大肠杆菌本身不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是( )
A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒
B．抗生素抗性基因是目的基因表达的必要条件
C．成功导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基上生长
D．能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌不一定符合生产要求
变式训练
D
解析：导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒，也可能为普通质粒，A错误；抗生素抗性基因是标记基因，是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，与目的基因表达无关，B错误；由于目的基因要插入到基因B中，即抗氨苄青霉素基因被破坏，工程菌不能抗氨苄青霉素，因此成功导入重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，C错误；能在含链霉素的培养基中生长的大肠杆菌可能含有重组质粒或普通质粒，因此不一定符合生产要求，D正确。
知识点四 DNA的粗提取与鉴定
基础知识 双基夯实
1．实验原理
(1)_________不溶于酒精，_________溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于__________________________溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇_________试剂会呈现蓝色。
DNA
蛋白质
2 mol/L的NaCl
二苯胺
2．实验步骤
(1)称取30 g洋葱，切碎，加入10 mL研磨液，充分研磨。
↓
(2)漏斗中垫_______，将研磨液过滤到烧杯中，_____ ℃处理，取上清液。
↓
(3)在上清液中加入体积相等的、预冷的_______溶液，静置2～3 min，用玻璃棒沿同一方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去水分。
↓
纱布
4
酒精
(4)取两支20 mL的试管编号A、B，各加入2 mol/L的___________溶液5 mL，将丝状物溶于B试管的NaCl溶液中。然后向两支试管中各加入4 mL的_____________。混匀后，将试管置于_______中加热5 min。
↓
(5)结果观察：A试管_________，B试管_________。
NaCl
二苯胺试剂
沸水
不变蓝
变蓝色
活 | 学 | 巧 | 练
1.DNA与蛋白质都溶于酒精。( )
2．在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。( )
3．DNA能溶于2 mol/L的NaCl溶液。( )
×
×
√
合 | 作 | 探 | 究
1.鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？请说明理由。
提示：鸟类适合而哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，不适合作材料提取DNA。
2．实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状物或沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
3．实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
课内探究 名师点睛
1．实验材料的选取
原则上，凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。选取的材料不同，提取DNA的方法可能稍有不同。
2．方法步骤
(1)粗提取DNA
(2)鉴定DNA
试管编号 A(对照组) B(实验组)
步骤1 2 mol·L－1的NaCl溶液5 mL 2 mol·L－1的NaCl溶液5 mL
步骤2 不进行任何处理 加丝状物或沉淀物
步骤3 加4 mL二苯胺试剂，混匀 加4 mL二苯胺试剂，混匀
步骤4 沸水浴5 min 沸水浴5 min
实验现象 溶液不变蓝色 溶液逐渐变为蓝色
实验结论 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色 特别提醒：(1)粗提取的DNA中可能含有少量的蛋白质和脂质。
(2)不用哺乳动物的血液作为实验材料，这是因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，不含DNA。
(3)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(4)沉淀DNA时必须用冷酒精。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是可抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( )
A．用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，用玻璃棒沿同一方向轻轻搅拌
C．预冷的乙醇可用来溶解蛋白质
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
典例4
A
解析： 猪属于哺乳动物，其红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，A项错误；在除去相关蛋白后，DNA是非常容易断裂的，如果太过剧烈地搅拌，DNA链可能会被破坏，因此轻柔搅拌的目的是为了获得较完整的DNA分子，B项正确；在冷的95%酒精溶液中DNA的溶解度低，DNA的沉淀量大，C项正确；将析出的DNA溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色，D项正确。
如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列有关叙述错误的是( )
A．图1中的丝状物含有DNA
B．图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
C．图2所示实验操作完成后，最好待试管中溶液冷却后观察颜色变化
D．图2中的溶液b能够溶解DNA
变式训练
B
解析：图1中的丝状物含有DNA，A正确；图1所示操作的原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质溶于酒精，B错误；图2所示实验操作完成后，最好待试管中溶液冷却后观察颜色变化，C正确；图2中的溶液b是NaCl溶液，能够溶解DNA，D正确。
指点迷津 拨云见日
选择限制酶的方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、正向连接、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和选择，如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。
不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别如下图所示(已知这三种限制酶切割产生的黏性末端不同)。下列分析错误的是( )
典例5
A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组 DNA
D
解析： 构建重组DNA时，如果用BglⅡ和HindⅢ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A项正确；分析图甲，HindⅢ的酶切位点在第二个EcoRⅠ的酶切位点的左侧，因此用EcoRⅠ和HindⅢ切割目的基因所在片段，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用EcoRⅠ和HindⅢ切割P1噬菌体载体也形成这两种黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B项正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为链状DNA分子，因每条DNA单链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C项正确；用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可正向连接或反向连接，不止能产生一种重组DNA，D项错误。
学 | 霸 | 记 | 忆
1.基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
2．DNA重组技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。
3．限制性内切核酸酶可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。
4．E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端。
5．质粒作为基因工程的载体需具备的条件有：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。
6．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
8．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。
9．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
课堂达标 巩固训练
1．下列关于E.coli DNA连接酶的叙述，正确的是( )
①催化具有相同黏性末端的DNA片段之间的连接
②催化具有互补黏性末端的DNA片段之间的连接
③催化具有平末端的DNA片段之间的连接
④催化单个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
A．①② B．②④
C．②③ D．①④
A
解析：E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，可用于连接相同或互补的黏性末端，不能连接平末端；T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接平末端的效率相对较低。DNA连接酶不能连接单个的脱氧核苷酸，在DNA复制时，靠DNA聚合酶将单个的脱氧核苷酸聚合在一起。
2．用X酶切割DNA分子后，得到黏性末端①，用Y酶切割DNA分子后，得到黏性末端②，如图所示，以下说法不正确的是( )
A．X与Y通常是不同的限制酶
B．限制酶与DNA水解酶破坏的化学键相同
C．限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
D．具有①②的两个DNA片段可连接成重组分子，重组后还可以被X或Y切割
D
解析：由题图可知，X与Y识别的核苷酸序列不同，因此X与Y是不同的限制酶，A正确；限制酶与DNA水解酶破坏的化学键相同，都是磷酸二酯键，B正确；限制性内切核酸酶将一个DNA分子片段切成两个片段，即断裂两个磷酸二酯键，因此需消耗两个水分子，C正确；具有①②的两个DNA片段可连接成重组分子，核苷酸序列发生了改变，所以重组后不能被X或Y切割，D错误。
3．下图中甲、乙分别表示质粒和含目的基因的DNA片段。几种可供选择使用的限制酶识别序列及其切割位点为
注：tetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
回答下列问题：
(1)限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的_____________断开。题中可供使用的限制酶，切割相应DNA片段后能产生黏性末端的有_____________________________________________。
(2)经限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以与上述其余限制酶中的_____________________________ (填限制酶名称)切割后得到的DNA片段连接，理由是________________________________________。图中甲质粒经Sau3AⅠ完全切割后可得到_____种DNA片段。
(3)图甲中的tetR和AmpR在运载体上可作为___________，用于重组DNA的鉴定和选择。
磷酸二酯键
EcoRⅠ、BamHⅠ、BclⅠ、Sam3AⅠ
BamHⅠ、BclⅠ
它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端
3
标记基因
解析：(1)限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。题中可供使用的限制酶切割相应片段后都会产生黏性末端。(2)经限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以与其余限制酶中的BamHⅠ、BclⅠ切割后得到的DNA片段连接，理由是它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端。图中甲质粒有3个Sau3AⅠ的酶切位点(terR上有1个，而AmpR上有2个)，所以经Sau3AⅠ完全切割后可得到3种DNA片段。(3)图中甲的tetR和AmpR都是抗性基因，在运载体上可以作为标记基因，用于重组DNA的鉴定和选择。
