第3章 第2节
基 础 题 组
一、选择题
1．(2023·陕西西安高二校考期中)在胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列哪组是所需要的( )
①同一种限制酶切割两者
②不需同一种限制酶切割两者
③加入适量的DNA连接酶
④不需加DNA连接酶
A．②③ B．①④
C．②④ D．①③
2．(2023·贵州黔西高二校考阶段练习)有关PCR技术的说法，不正确的是( )
A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B．PCR技术的原理是DNA双链复制
C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
D．PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA
3．(2023·湖北省武汉市部分学校联合体联考)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。利用基因工程技术将几丁质酶基因转入植物体内，以增强其抵御真菌病害的能力。下列有关叙述错误的是( )
A．获得的转基因植株抗真菌的能力没有提高，可能的原因是目的基因的转录或翻译异常
B．将几丁质酶基因导入植物细胞常用的方法为农杆菌转化法
C．该转基因植物对真菌病害的防御机制也可用于防治烟草花叶病
D．几丁质酶基因转入植物细胞后，利用组织培养可获得具有抗病能力的完整植株
4．(2023·江苏淮安高二统考期末)下列有关基因工程的叙述正确的是( )
A．基因克隆载体的构建是基因工程的核心工作
B．将目的基因导入动物受精卵常采用显微注射法
C．限制酶能够在DNA的特定部位水解磷酸二酯键和氢键
D．RNA聚合酶只能把核糖核苷酸连续加到已有链的3′－OH端
5．(2023·陕西安康高二统考期末)如图表示构建的基因表达载体，下列叙述错误的是( )
A．基因表达载体中碱基A＋C的数量与T＋G的数量相等
B．构建基因表达载体是基因工程的核心步骤
C．抗生素抗性基因等标记基因有利于对重组DNA分子进行筛选
D．终止子位于目的基因下游，可以使翻译在所需要的地方停下来
6．基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同，下列叙述不正确的是( )
A．将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法
B．将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射技术
C．将目的基因导入大肠杆菌内常用Ca2＋处理法
D．将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法
7．(2023·江西抚州高二统考期末)PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列叙述正确的是( )
A．双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链
B．温度降低后，单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同
C．采用PCR技术对一个DNA进行扩增，第n次循环共需要引物2n个
D．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程起作用
二、非选择题
8．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)检验DNA通常使用__试剂，若存在DNA，则水浴加热后___。
(2)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，其中T4DNA连接酶与E.coliDNA连接酶的区别：___。
(3)基因导入受体细胞需要构建基因表达载体，目的是：___。
(4)PCR技术经过n轮复制，产生的同时含有两种引物的DNA分子数为___。
(5)目的基因进入受体细胞后，需要进行目的基因的___，其中，通常我们用抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译出相关蛋白质，其中我们需要加入的是___(选填“抗体”或“抗原”)。
能 力 提 升
一、选择题
1．(2023·陕西咸阳高二统考期中)下列关于PCR技术的叙述，正确的是( )
A．以脱氧核糖核苷酸为原料，以指数形式扩增
B．变性过程中破坏的是磷酸二酯键
C．该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
D．利用PCR技术扩增DNA时，设置的温度要逐步提高
2．(2023·河南开封高二校联考阶段练习)图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是( )
A．图中质粒和外源基因DNA构建重组质粒时可用BamHⅠ和HindⅢ限制酶切割
B．图乙中一个DNA分子在PCR仪中经过四轮复制得到所需目的基因的分子数为16个
C．能在含有四环素的培养基上生存的细胞全部都是成功导入重组质粒的受体细胞
D．若通过PCR技术扩增该目的基因，应该选用引物a和引物c
3．(2023·安徽滁州高二校考期末)据下图分析，下列有关基因工程的说法不正确的是( )
A．为防止目的基因与质粒任意结合而影响基因的表达，应用限制酶Ⅰ、Ⅱ同时切割二者
B．DNA聚合酶、DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键
C．与启动子结合的是RNA聚合酶
D．能够检测到标记基因表达产物的受体细胞中，也一定会有目的基因的表达产物
4．(2023·江苏淮安高二统考期末)微滴式数字PCR(ddPCR)是一种检测新冠病毒等病原体的手段，原理如图所示，分为样本分散、PCR扩增、检测三个过程。下列有关叙述错误的是( )
A．新冠病毒样本在进行ddPCR检测时，需要先进行逆转录处理
B．多孔板中如果某个孔没有核酸分子，就不需要加入引物和Taq酶
C．检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可以说明原样本中有病毒核酸
D．相对于传统手段，ddPCR更加灵敏，更容易检测出微量病毒，但成本相对较高
5．(2023·湖北孝感高二校联考期末)利用PCR能够快速扩增目的基因，也可以检测基因的表达情况。下列有关PCR的叙述，正确的是( )
A．利用PCR技术可以检测是否产生相应的蛋白质
B．PCR过程中需要用到耐高温的解旋酶
C．每一次PCR循环过程中，都需要引物与模板链相互结合
D．当温度下降到72 ℃时有利于引物和两条单链DNA结合
6．(2023·河北石家庄高二统考期末)某课题组为得到高产青蒿素的新品系，通过一定的技术使青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，过程如图所示。下列叙述错误的是( )
A．PCR过程中，温度控制在90 ℃以上的目的是破坏氢键
B．构建重组质粒过程中，fps基因需插在质粒a的T－DNA上
C．重组质粒包括目的基因、启动子、终止密码子和标记基因等
D．用PCR技术可以检测fps基因是否成功导入野生青蒿细胞中
7．(2023·陕西安康高二统考期末)在PCR扩增仪中完成DNA分子的扩增后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。实验人员用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶处理某DNA分子，得到如图所示的电泳图谱，其中1号是标准DNA样品，2号、3号、4号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。据图分析，下列相关叙述错误的是( )
A．该DNA分子可能含1 000个碱基对
B．EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶切割位点不同
C．每次PCR扩增DNA分子时均需要引物
D．EcoRⅠ和SmaⅠ的切割位点最短相距约800 bp
二、非选择题
8．(2023·陕西西安高二长安一中校考期末)干旱会影响农作物产量，科学家们对此进行了研究。如图为用探针检验某一抗旱植物基因型的原理，相关基因用R和r表示。请据图分析回答下列问题：
(1)基因R与r的本质区别是___的不同。在利用PCR技术扩增R或r基因过程中，利用____可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。
(2)若被检植物发生A现象，不发生B、C现象，则被检植物的基因型为___。
(3)用从基因文库中获取目的基因的方法获取抗旱基因时需要用到限制酶，限制酶的具体作用的化学键是___。
(4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，其依据主要是当植物受到损伤时、伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的___可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞___上。
(5)经检测，抗旱基因已经导入烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是___。
第3章 第2节
基 础 题 组
一、选择题
1．(2023·陕西西安高二校考期中)在胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列哪组是所需要的( D )
①同一种限制酶切割两者
②不需同一种限制酶切割两者
③加入适量的DNA连接酶
④不需加DNA连接酶
A．②③ B．①④
C．②④ D．①③
解析： 在胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，需先用同一种限制酶切割两者，使其露出相同的黏性末端，然后加入适量的DNA连接酶，形成重组质粒，即D正确，A、B、C错误。故选D。
2．(2023·贵州黔西高二校考阶段练习)有关PCR技术的说法，不正确的是( D )
A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B．PCR技术的原理是DNA双链复制
C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
D．PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA
解析： PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，A正确；PCR技术的原理是DNA双链复制，B正确；利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，C正确；PCR技术中通过高温解旋，不需要解旋酶，D错误。故选D。
3．(2023·湖北省武汉市部分学校联合体联考)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。利用基因工程技术将几丁质酶基因转入植物体内，以增强其抵御真菌病害的能力。下列有关叙述错误的是( C )
A．获得的转基因植株抗真菌的能力没有提高，可能的原因是目的基因的转录或翻译异常
B．将几丁质酶基因导入植物细胞常用的方法为农杆菌转化法
C．该转基因植物对真菌病害的防御机制也可用于防治烟草花叶病
D．几丁质酶基因转入植物细胞后，利用组织培养可获得具有抗病能力的完整植株
解析： 获得的转基因植株抗真菌的能力没有提高，很可能是植株中的几丁质酶并没有表达，可能的原因是目的基因的转录或翻译异常，A正确；将几丁质酶基因导入植物细胞常用的方法为农杆菌转化法，B正确；烟草花叶病是由烟草花叶病毒感染所致，并不是真菌所致，所以这种运用水解酶基因的防御机制，无法用于防治烟草花叶病，C错误；将几丁质酶基因转入植物细胞后，利用植物细胞的全能性，对植物细胞进行组织培养，从培养的植株中筛选出具有抗病能力的完整植株，D正确。故选C。
4．(2023·江苏淮安高二统考期末)下列有关基因工程的叙述正确的是( B )
A．基因克隆载体的构建是基因工程的核心工作
B．将目的基因导入动物受精卵常采用显微注射法
C．限制酶能够在DNA的特定部位水解磷酸二酯键和氢键
D．RNA聚合酶只能把核糖核苷酸连续加到已有链的3′－OH端
解析： 基因表达载体的构建是基因工程的核心工作，A错误；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，其中将目的基因导入动物受精卵常采用显微注射法，B正确；限制酶能够在DNA的特定部位水解磷酸二酯键，但不能水解氢键，C错误；DNA聚合酶只能把脱氧核糖核苷酸连续加到已有链的3′－OH端，D错误。故选B。
5．(2023·陕西安康高二统考期末)如图表示构建的基因表达载体，下列叙述错误的是( D )
A．基因表达载体中碱基A＋C的数量与T＋G的数量相等
B．构建基因表达载体是基因工程的核心步骤
C．抗生素抗性基因等标记基因有利于对重组DNA分子进行筛选
D．终止子位于目的基因下游，可以使翻译在所需要的地方停下来
解析： 基因表达载体是目的基因与质粒组成的，其本质仍是双链DNA分子，双链DNA分子中A＝T、G＝C，故基因表达载体中碱基A＋C的数量与T＋G的数量相等，A正确；构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用，B正确；抗生素抗性基因等标记基因有利于对重组DNA分子进行筛选：方法是将待筛选的重组质粒等接种到含该抗生素的培养基中，观察其生长情况，C正确；终止子位于基因的下游，使转录在所需要的地方停止下来，D错误。故选D。
6．基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同，下列叙述不正确的是( D )
A．将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法
B．将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射技术
C．将目的基因导入大肠杆菌内常用Ca2＋处理法
D．将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法
解析： 小麦是单子叶植物，其受损伤后不能分泌酚类物质，不能吸引农杆菌移向伤口处，细胞不能完成转化。
7．(2023·江西抚州高二统考期末)PCR技术是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列叙述正确的是( C )
A．双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链
B．温度降低后，单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同
C．采用PCR技术对一个DNA进行扩增，第n次循环共需要引物2n个
D．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程起作用
解析： 高温条件下，DNA分子发生变性，氢键断裂，而磷酸二酯键不会断裂，A错误；当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成2个DNA分子，此过程以4种脱氧核苷酸为原料，遵循碱基互补配对原则，单链DNA和引物结合的部分碱基序列互补，B错误；PCR技术大量扩增目的基因时，n－1次生成2n－1个DNA分子，n次复制形成2n个DNA，所以第n次循环需要的引物数目为(2n－2n－1)×2＝2n，C正确；PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，D错误。故选C。
二、非选择题
8．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)检验DNA通常使用_二苯胺__试剂，若存在DNA，则水浴加热后_溶液变蓝__。
(2)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，其中T4DNA连接酶与E.coliDNA连接酶的区别：_T4DNA连接酶可以连接平末端和互补的黏性末端，E.coli_DNA连接酶只能连接互补的黏性末端__。
(3)基因导入受体细胞需要构建基因表达载体，目的是：_让基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用__。
(4)PCR技术经过n轮复制，产生的同时含有两种引物的DNA分子数为_2n－2__。
(5)目的基因进入受体细胞后，需要进行目的基因的_检测和鉴定__，其中，通常我们用抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译出相关蛋白质，其中我们需要加入的是_抗体__(选填“抗体”或“抗原”)。
解析：(1)提取的DNA在水浴加热的条件下与二苯胺试剂反应形成蓝色，所以DNA可用二苯胺试剂进行检测。(2)DNA连接酶分为两类：E.coliDNA连接酶和从T4噬菌体分离出来的称为T4DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端。(3)基因表达载体能让基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用，所以基因导入受体细胞需要构建基因表达载体。(4)利用PCR技术扩增目的基因时，由于DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，因此要用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增，一个DNA分子n轮复制以后，含有DNA分子2n个，其中模板链不需要引物，则含有两种引物的DNA分子有2n－2个。(5)目的基因进入受体细胞后，需要进行目的基因进行检测和鉴定。检测目的基因是否成功表达可采用抗原—抗体杂交法，检测目的基因是否翻译出相关蛋白质。
能 力 提 升
一、选择题
1．(2023·陕西咸阳高二统考期中)下列关于PCR技术的叙述，正确的是( A )
A．以脱氧核糖核苷酸为原料，以指数形式扩增
B．变性过程中破坏的是磷酸二酯键
C．该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
D．利用PCR技术扩增DNA时，设置的温度要逐步提高
解析： PCR是一项体外扩增DNA分子的技术，该过程中以脱氧核糖核苷酸为原料，以指数形式扩增，A正确；变性过程中破坏的是氢键，使DNA分子解旋，B错误；该技术不需要解旋酶，DNA分子解旋时通过高温实现的，C错误；PCR过程分三步，第一步变性，升高温度至90 ℃左右，将DNA双链解聚为单链；第二步复性，降低温度至50 ℃左右，引物通过碱基互补配对结合在模板链上；第三步延伸，升高温度至72 ℃左右，通过耐高温的DNA聚合酶，将脱氧核苷酸通过碱基互补配对延伸形成子链DNA，D错误。故选A。
2．(2023·河南开封高二校联考阶段练习)图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是( D )
A．图中质粒和外源基因DNA构建重组质粒时可用BamHⅠ和HindⅢ限制酶切割
B．图乙中一个DNA分子在PCR仪中经过四轮复制得到所需目的基因的分子数为16个
C．能在含有四环素的培养基上生存的细胞全部都是成功导入重组质粒的受体细胞
D．若通过PCR技术扩增该目的基因，应该选用引物a和引物c
解析： 选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，BamHⅠ会导致两种抗性基因都被破坏，同时为防止目的基因自身环化，因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，A错误；图乙中一个DNA分子在PCR仪中经过四轮复制得到所需目的基因，即引物之间的序列的分子数为24－2－6＝8个，其中2个是指带有模板链的分子数，6个是两条链不等长的DNA片段，B错误；由于选择BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此能在含四环素的培养基上生长的是含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，即能在含有四环素的培养基上生存的细胞未必都是成功导入重组质粒的受体细胞，C错误；PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图乙中引物a和引物c，D正确。故选D。
3．(2023·安徽滁州高二校考期末)据下图分析，下列有关基因工程的说法不正确的是( D )
A．为防止目的基因与质粒任意结合而影响基因的表达，应用限制酶Ⅰ、Ⅱ同时切割二者
B．DNA聚合酶、DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键
C．与启动子结合的是RNA聚合酶
D．能够检测到标记基因表达产物的受体细胞中，也一定会有目的基因的表达产物
解析： 限制酶Ⅰ和酶Ⅱ识别的核苷酸序列不同，所以用限制酶Ⅰ和酶Ⅱ同时切割目的基因和质粒可防止二者任意结合，A正确；DNA聚合酶、DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键，前者是连接单个的脱氧核苷酸，后者是连接DNA片段，B正确；启动子和终止子都是一段有特殊结构的DNA片段，其中启动子是RNA聚合酶的结合位点，能启动转录过程，而终止子能终止转录过程，C正确；重组DNA分子上的抗性基因可用于目的基因的检测与鉴定，但是有目的基因也不一定成功表达，D错误。故选D。
4．(2023·江苏淮安高二统考期末)微滴式数字PCR(ddPCR)是一种检测新冠病毒等病原体的手段，原理如图所示，分为样本分散、PCR扩增、检测三个过程。下列有关叙述错误的是( B )
A．新冠病毒样本在进行ddPCR检测时，需要先进行逆转录处理
B．多孔板中如果某个孔没有核酸分子，就不需要加入引物和Taq酶
C．检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可以说明原样本中有病毒核酸
D．相对于传统手段，ddPCR更加灵敏，更容易检测出微量病毒，但成本相对较高
解析： PCR是一项体外扩增DNA分子的技术，新冠病毒的遗传物质是RNA，故新冠病毒样本在进行ddPCR检测时，需要先进行逆转录处理得到DNA，A正确；由于核酸分子无法肉眼观察到，即使某个孔中不含核酸分子也无法得知，故为避免有遗漏，每个多孔板中都需要加入引物和Taq酶，最终通过阳性反应进行鉴定，B错误；阳性结果意味着有核酸分子能与试剂发生碱基互补配对，故检测时只要有一个孔出现阳性结果，就可以说明原样本中有病毒核酸，C正确；相对于传统手段，ddPCR在每个孔中含有少量核酸的条件下即可检测，故更加灵敏，更容易检测出微量病毒，但成本相对较高，D正确。故选B。
5．(2023·湖北孝感高二校联考期末)利用PCR能够快速扩增目的基因，也可以检测基因的表达情况。下列有关PCR的叙述，正确的是( C )
A．利用PCR技术可以检测是否产生相应的蛋白质
B．PCR过程中需要用到耐高温的解旋酶
C．每一次PCR循环过程中，都需要引物与模板链相互结合
D．当温度下降到72 ℃时有利于引物和两条单链DNA结合
解析： PCR是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，利用PCR技术可以检测是否产生相应的DNA，但不能检测是否产生相应的蛋白质，A错误；PCR过程中需要用到耐高温的DNA聚合酶，PCR过程中不需要解旋酶，B错误；每一次PCR循环过程中，在低温复性阶段，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，C正确；PCR过程中，55 ℃时引物和两条单链DNA结合，在72 ℃时合成子链，D错误。故选C。
6．(2023·河北石家庄高二统考期末)某课题组为得到高产青蒿素的新品系，通过一定的技术使青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，过程如图所示。下列叙述错误的是( C )
A．PCR过程中，温度控制在90 ℃以上的目的是破坏氢键
B．构建重组质粒过程中，fps基因需插在质粒a的T－DNA上
C．重组质粒包括目的基因、启动子、终止密码子和标记基因等
D．用PCR技术可以检测fps基因是否成功导入野生青蒿细胞中
解析： 利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解旋为单链的条件是加热至90 ℃以上，目的是破坏DNA分子中的氢键，A正确；构建重组Ti质粒的过程中，需将目的基因(fps基因)插入Ti质粒的T－DNA上，B正确；基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；检验fps基因是否成功导入野生青蒿细胞中，可用PCR技术或DNA分子杂交法，D正确。故选C。
7．(2023·陕西安康高二统考期末)在PCR扩增仪中完成DNA分子的扩增后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物。实验人员用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶处理某DNA分子，得到如图所示的电泳图谱，其中1号是标准DNA样品，2号、3号、4号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。据图分析，下列相关叙述错误的是( D )
A．该DNA分子可能含1 000个碱基对
B．EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶切割位点不同
C．每次PCR扩增DNA分子时均需要引物
D．EcoRⅠ和SmaⅠ的切割位点最短相距约800 bp
解析： 据图可知，用EcoRⅠ单独处理(2号)或用SmaⅠ单独处理(3号)都只得到一种大小为1 000 bp的DNA片段，该DNA分子可能含1 000个碱基对，A正确；由题知，两种限制酶同时切割时则产生800 bp和200 bp两种长度的DNA片段，故EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶切割位点不同，B正确；每次PCR扩增DNA分子时均需要引物，PCR技术中引物需要和各自互补的DNA单链的3′端结合，C正确；由题知，两种限制酶同时切割时则产生800 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最少相距200 bp，D错误。故选D。
二、非选择题
8．(2023·陕西西安高二长安一中校考期末)干旱会影响农作物产量，科学家们对此进行了研究。如图为用探针检验某一抗旱植物基因型的原理，相关基因用R和r表示。请据图分析回答下列问题：
(1)基因R与r的本质区别是_脱氧核苷酸排列顺序(或碱基对排列顺序)__的不同。在利用PCR技术扩增R或r基因过程中，利用_引物__可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。
(2)若被检植物发生A现象，不发生B、C现象，则被检植物的基因型为_RR__。
(3)用从基因文库中获取目的基因的方法获取抗旱基因时需要用到限制酶，限制酶的具体作用的化学键是_磷酸二酯键__。
(4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，其依据主要是当植物受到损伤时、伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的_T－DNA__可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞_染色体DNA__上。
(5)经检测，抗旱基因已经导入烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是_基因表达载体上的目的基因首端未加入启动子__。
解析：(1)基因R和r是等位基因，本质区别是基因中脱氧核苷酸排列顺序的不同或碱基对的排列顺序不同。用PCR技术扩增R或r基因时，需要用特殊的引物寻找抗旱基因的位置。(2)被检植物发生A现象，不发生B、C现象，即r探针没有形成杂交环，所以被检植物的基因型为RR。(3)限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定脱氧核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。(4)利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞，主要利用的原理是：如果将目的基因插入到Ti质粒上的T－DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。(5)经检测，抗旱基因已经导入到烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是基因表达载体上目的基因首端未加入启动子。(共89张PPT)
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
1．阐明基因工程的原理和基本操作程序。
2．针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
3．尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
1．科学思维——结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究——针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
知识点一
课堂达标 巩固训练
指点迷津 拨云见日
知识点二
知识点三
知识点四
知识点五
知识点一 目的基因的筛选与获取
基础知识 双基夯实
1．目的基因
(1)概念：用于改变_______________或获得_______________等的基因。
(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是________________。
受体细胞性状
预期表达产物
Bt抗虫蛋白基因
2．获取方法
特别提醒：引物是依据目的基因的已知序列设计而成的，其提供3′端，以便DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸连接。
活 | 学 | 巧 | 练
1.目的基因只能是编码蛋白质的基因。( )
2．PCR需要的条件与细胞内DNA复制的条件完全一致。( )
3．PCR复性时，温度一般为72 ℃。( )
×
×
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合 | 作 | 探 | 究
1.PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方向是怎样的？
提示：DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
2．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。
提示：在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
3．在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？
提示：第3轮
课内探究 名师点睛
1．目的基因
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因。
2．目的基因的获取方法
(1)从基因文库中获取。
(2)利用PCR技术扩增。
(3)通过化学方法人工合成。
3．PCR反应
(1)条件
①模板：DNA母链(目的基因所在的DNA片段)。
②酶：耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。
③两种引物：分别与两条模板链相结合。
④原料：四种脱氧核苷酸。
(2)过程
(3)结果
上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
下列关于PCR反应体系中所加物质作用的叙述，错误的是( )
A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成
B．引物使TaqDNA聚合酶能从引物的5′端延伸DNA链
C．目标DNA母链用作合成DNA复制的模板
D．四种脱氧核苷酸为PCR提供原料
典例1
B
解析：通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA子链，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA双链复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；DNA合成的原料是四种脱氧核苷酸，D正确。
关于引物
①概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为20～30个核苷酸。
②作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，见下图：
下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是( )
A．三种方法都需要酶并均在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．三种方法均属于人工合成法
D．方法a不遵循中心法则
变式训练
A
解析：这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正确；通过方法a得到的目的基因不含有内含子，通过方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的排列顺序不一定相同，B错误；图示a和c属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基因的方法，C错误；方法a遵循中心法则，D错误。
知识点二 基因表达载体的构建
基础知识 双基夯实
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中___________，并且可以_______给下一代。
(2)使目的基因能够_______和发挥作用。
稳定存在
遗传
表达
2．基因表达载体的组成[填图]
3．基因表达载体的构建
首先用一定的_________切割载体，使它出现一个切口，然后用_______限制酶或_________________的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用_______________将目的基因片段拼接到载体的切口处。
限制酶
同种
能产生相同末端
DNA连接酶
活 | 学 | 巧 | 练
1.基因工程操作的核心步骤是目的基因的获取。( )
2．启动子位于mRNA的上游。( )
3．基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的检测与筛选。( )
×
×
√
合 | 作 | 探 | 究
分析基因表达载体模式图，回答下面问题：
1．构建基因表达载体时，目的基因应在哪个位置？为什么？
提示：由图可知，目的基因要插入启动子和终止子之间。因为启动子使转录开始，是RNA聚合酶识别和结合的部位；终止子位于基因的尾端，使转录终止；只有顺序正确目的基因才能正常转录。
2．为什么一般不能将目的基因插入载体的标记基因中？
提示：标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。
课内探究 名师点睛
1．基因表达载体构建的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．地位：基因工程的核心步骤。
3．基因表达载体的组成
4．过程
下列有关基因表达载体的构建的说法，错误的是( )
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
⑤必须在细胞内进行
A．②③⑤ B．①④⑤
C．①②⑤ D．③④
典例2
B
解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子和标记基因等，①错误；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，③正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤错误。
启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
(1)启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，与终止子一样都位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止。
(2)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是( )
变式训练
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
B
解析：图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ；抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞；基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
知识点三 将目的基因导入受体细胞
基础知识 双基夯实
1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内___________和_______的过程。
2．目的基因导入受体细胞的方法
(1)目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入_______中。
Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借_____________进入_______。
维持稳定
表达
子房
花粉管通道
胚囊
②农杆菌转化法
Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染_________植物和_______植物；农杆菌的Ti质粒上的_____________能够整合到所侵染细胞的_______________上。
Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌_______________________中，让农杆菌侵染植物细胞。
双子叶
裸子
T－DNA
染色体DNA
Ti质粒的T－DNA
(2)目的基因导入动物细胞
①常用方法：___________法。
②常用受体细胞：_________。
(3)目的基因导入微生物细胞
①方法：用____________处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。
显微注射
受精卵
Ca2＋
活 | 学 | 巧 | 练
1.将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。( )
2．农杆菌感染植物的机理：Ti质粒上的T－DNA可转移到植物受体细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起。( )
3．常用Ca2＋处理植物细胞，使细胞可以吸收周围环境中DNA。( )
√
√
×
合 | 作 | 探 | 究
1.农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。
提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。
2．将目的基因导入动物的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？
提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。
课内探究 名师点睛
1．导入的方法
受体细胞类型 方法 说明 特点
植物 细胞 农杆菌 转化法 将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达 经济、有效，适合于双子叶植物和裸子植物
花粉管 通道法 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达 简便、经济，我国科学家独创
2.目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
(1)图中a细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。
(2)图中b在进行细胞减数分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是( )
A．花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是我国科学家独创的一种方法
典例3
D
解析：花粉管通道法的操作之一是用微量注射器将含有目的基因的溶液直接注入子房中，A正确；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术，B正确；大肠杆菌最常用的转化方法是用Ca2＋处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，从而完成转化过程，C正确；我国科学家独创的方法是花粉管通道法，D错误。
在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T—DNA插入植物基因组中。图示为利用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图回答：
(1)剪除Ti质粒的某些片段、替换复制原点O与添加抗生素的抗性基因T的过程①中，需用多种限制酶处理，原因是___________________ ___________________，需用___________________“缝合”双链DNA片段的平末端。
变式训练
不同的限制酶识别并
切割不同的碱基序列
T4 DNA连接酶
(2)目的基因主要是指___________________。由过程②形成的基因表达载体中，目的基因的上游具有_________，它是_______________识别和结合的部位。
(3)过程③常用__________________处理使农杆菌成为感受态细胞。抗生素抗性基因T的作用是_____________________________________ ______。
编码蛋白质的基因
启动子
RNA聚合酶
Ca2＋(CaCl2溶液)
用于鉴定和筛选导入了基因表达载体的农
杆菌
解析：(1)Ti质粒具多种限制酶切割位点，是因为不同的限制酶识别并切割不同的碱基序列。连接平末端应选用T4 DNA连接酶。(2)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。目的基因的上游具有启动子，以便于RNA聚合酶识别和结合。(3)过程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)处理农杆菌，以增大农杆菌细胞壁的通透性。抗生素抗性基因T用于检测受体细胞中是否含有基因表达载体。
知识点四 目的基因的检测与鉴定
基础知识 双基夯实
1．分子水平检测
(1)通过_________等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。
(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行_____________杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。
2．个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
PCR
抗原—抗体
活 | 学 | 巧 | 练
1.从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。( )
2．通过PCR技术可以检测目的基因是否转录出mRNA。( )
合 | 作 | 探 | 究
鉴定导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。
×
√
课内探究 名师点睛
1．目的基因的检测与鉴定
2．不同分子检测原理的异同
(1)检测目的基因是否插入受体DNA中、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则，只是被检测的物质不同，一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。
(2)进行翻译水平的检测，通常以目的基因表达产物(蛋白质)作抗原，制备相应抗体，检测转基因生物的蛋白质，利用抗原与抗体特异性结合的原理。
(3)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
基因工程操作过程中碱基互补配对现象
基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步筛选与获取目的基因，用人工合成、PCR获取或基因文库获取，三种常用方法都涉及碱基互补配对；第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体，第四步利用分子杂交的方法检测(DNA、mRNA)，也都存在碱基互补配对现象。
在检测抗虫棉培育是否成功的方法中，不属于分子水平检测的是( )
A．观察害虫吃棉叶后是否死亡
B．通过PCR技术检测棉花的染色体上是否插入了目的基因
C．检测目的基因是否转录形成mRNA
D．从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交
解析：A项属于个体水平的鉴定，不是分子水平的检测。
典例4
A
运用现代生物技术，将苏云金杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为了检测实验是否成功，最简便的方法是检测棉花植株是否有( )
A．抗虫基因 B．抗虫基因产物
C．新的细胞核 D．相应的性状
解析：将苏云金杆菌中的抗虫基因转移到棉花的细胞中，若此棉花抗虫效果明显的话，说明其体内就具有细菌的抗虫基因，因为生物的性状是由基因控制的。
变式训练
D
知识点五 DNA片段的扩增及电泳鉴定
基础知识 双基夯实
1．实验基础
(1)PCR原理：利用了_________________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的_____________等有关。
DNA的热变性
大小和构象
2．实验步骤
活 | 学 | 巧 | 练
1.微量移液器在使用前要先消毒。( )
2．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。( )
×
√
合 | 作 | 探 | 究
1.判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？如果没有成功应该从哪些方面分析？
提示：可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来判断。没有成功的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
2．如果没有出现扩增条带，可能的原因有哪些？
提示：模板DNA含有蛋白或含有TaqDNA聚合酶的抑制剂(如蛋白酶K、苯酚、EDTA)；TaqDNA聚合酶失活；引物出现质量问题，浓度不合适；Mg2＋浓度过低；变性温度低，变性时间短；目的序列变异等。
课内探究 名师点睛
1．操作步骤
(1)加样：按照PCR反应体系的配方将所有组分加入微量离心管中，将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在离心管底部。
(2)反应：将微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应(可参照下表内容进行设置)。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94 ℃，5 min / /
30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min
(3)制胶：根据待分离DNA片段的大小，制备琼脂糖凝胶。一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。制好的凝胶放入电泳槽中，加电泳缓冲液，以没过凝胶1 mm为宜。
(4)点样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
(5)电泳：待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
(6)观察：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
2．注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A．增加模板DNA的量
B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间
D．提高复性的温度
典例5
D
解析：增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少反应非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，B、C错误；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。
利用PCR检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号泳道为DNA分子量标准样液，10号泳道为蒸馏水。PCR时加入的模
变式训练
A．PCR产物的分子大小在250 bp至500 bp之间
B．3号样品为不含目的基因的载体DNA
C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D．10号泳道的电泳结果能确定反应体系等因素对实验结果没有干扰
板DNA如图所示。下列分析错误的是( )
B
解析：PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp；3号PCR结果包含250～500 bp的片段，说明含有目的基因；9号PCR结果不包含250～500 bp的片段，所以不是所需的转基因植株；10号放入蒸馏水，是为了排除反应体系等因素对结果的干扰，由图可知，10号泳道的电泳结果能确定反应体系等因素对实验结果没有干扰。
指点迷津 拨云见日
细胞内DNA复制与PCR反应的比较
项目 体内DNA复制 PCR反应
不同点 时期 细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期 体外随时进行
场所 活细胞内 微量离心管内
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
解旋 在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开 加热至90 ℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶
引物 一小段RNA 可以是RNA或单链DNA分子片段
项目 体内DNA复制 PCR反应
不 同 点 合成子链 在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成 分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72 ℃左右
特点 边解旋边复制，半保留复制 体外迅速扩增
循环次数 受生物体自身控制 30多次
产物 完整DNA DNA片段
相 同 点 原料 4种脱氧核苷酸(A、G、C、T) 复制原理 严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制 模板 以DNA母链为模板 引物 都需要分别与两条模板链相结合的两种引物 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( )
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④ B．①②
C．①③ D．②④
典例6
C
解析：PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：一是PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸；二是PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
学 | 霸 | 记 | 忆
1.基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的筛选与获取；(2)基因表达载体的构建；(3)将目的基因导入受体细胞；(4)目的基因的检测与鉴定。
2．PCR反应液中需要提供DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
3．PCR反应中每次循环一般可分为变性、复性、延伸三步。
4．基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子以及标记基因等。
5．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法。
6．将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。
7．分子水平的检测：检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中；检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
8．目的基因的检测与鉴定还需要在个体生物学水平进行鉴定。
课堂达标 巩固训练
1．下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是( )
A．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
A
解析： ⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A项正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA整合到棉花细胞的染色体上，B项错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C项错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D项错误。
2．如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因重组进该质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列( )
A．NdeⅠ和BamHⅠ
B．NdeⅠ和XbaⅠ
C．XbaⅠ和BamHⅠ
D．EcoRⅠ和KpnⅠ
A
解析：构建基因表达载体时应将目的基因插入启动子和终止子之间。由题图可知，启动子与终止子之间存在三种限制酶切点，但XbaⅠ在质粒上有两个切割位点，因此为使PCR扩增的该基因能准确插入启动子与终止子之间，扩增时该基因两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种限制酶的识别序列。
3．图1为胰岛素基因结构与引物位置示意图，图2为pBR322质粒结构示意图，图中EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ和HindⅢ为限制酶，箭头或线段所指位点为对应酶切位点。研究人员欲用此质粒构建胰岛素基因的表达载体，培养能产生人胰岛素的大肠杆菌。请回答下列相关问题：
(1)若要进行胰岛素基因的扩增常采用_________技术。已知DNA新链的合成方向是5′→3′，若利用图2中质粒构建基因表达载体，应该选择的引物为_________________。
(2)在构建基因表达载体时，选择_________________________作为分别切割质粒和目的基因的限制酶，可提高目的基因和载体的正确连接效率，其原因是________________________________________________ _______________________________________。
PCR
引物4、引物5
BamHⅠ和HindⅢ
这两种酶能切割质粒和目的基因，且能得到不同的黏
性末端，避免质粒和目的基因自连及反接
(3)成功构建的基因表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是________________________________________________ _________，若利用酵母菌作受体细胞生产胰岛素，与大肠杆菌相比，利用酵母菌生产胰岛素的优势有__________________________________ _______________________________________。若要检测导入酵母菌的胰岛素基因是否成功转录，常用_________技术。
提供RNA聚合酶特异性识别和结合的位点，驱动基因
的转录
酵母菌为真核细胞，含有内质网和高尔
基体，可对核糖体合成的蛋白质进行加工
PCR
解析：(1)PCR(聚合酶链式反应)技术可以利用少量的DNA在短时间内获得大量的相同DNA。引物1～4的模板方向是5′→3′(从左到右)，由于DNA新链的合成方向是5′→3′，所以合成胰岛素基因只能选择引物3和引物4。同样，对于引物5～8，只能选择引物5和引物6才能合成胰岛素基因。只有引物4和引物5扩增出来的胰岛素基因含有和题图2相同的两种限制酶的识别位点，而引物3和引物6扩增出来的基因片段不含有，因此应选择的引物为4和5。(2)结合题图1和题图2，要提高目的基因和载体的正确连接效率，在构建基因表达载体时，应选择BamHⅠ和HindⅢ，因为这两种酶能同时切割质粒和目的基因，且能得到不同的黏
性末端，这样就避免了质粒和目的基因自连及反接。(3)启动子的作用是提供RNA聚合酶特异性识别和结合的位点，驱动基因转录出mRNA。大肠杆菌属于原核生物，酵母菌属于真核生物，因此与大肠杆菌相比，酵母细胞含有内质网和高尔基体。利用酵母菌生产胰岛素，可对核糖体合成的蛋白质进行加工。为了检测目的基因是否成功转录，即检测是否存在胰岛素基因对应的mRNA，需用PCR技术。
