高中生物人教版（2019）选修3 3.1重组DNA技术的基本工具章节综合练习题（含解析）
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| 名称 | 高中生物人教版（2019）选修3 3.1重组DNA技术的基本工具章节综合练习题（含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 1.1MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-11-13 00:22:20 | ||
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文档简介
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3.1重组DNA技术的基本工具
一、单选题
1．（2021高二下·湖北月考）在利用猕猴桃进行“DNA粗提取与鉴定”实验中，相关操作正确的是（ ）
A．直接向剪碎的猕猴祧果肉组织中加入蒸馏水并搅拌，以释放核DNA
B．向猕猴桃果肉研磨液中加入适量的蒸馏水，以降低DNA酶活性
C．向溶有粗提物的NaCI溶液中加入冷却的本积分数为95%的酒精，可以获得较纯净的DNA
D．将猕猴桃果肉研磨液迅速加热到100℃，再冷却后过滤，可以获得DNA粗提物
2．下表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断的以下说法中，正确的是( )
限制酶 名称 识别序列和 切割位点 限制酶 名称 识别序列和 切割位点
BamH Ⅰ 5'-G↓GATCC-3' KpnⅠ 5'-GGTAC↓C-3'
EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3' Sau3AⅠ 5' GATC-3'
HindⅡ 5'-GTY↓RAC-3' SmaⅠ 5'-CCC↓GGG-3'
(注 Y=C或T，R=A或G)
A．一种限制酶可能识别2种核苷酸序列
B．限制酶切割后一定形成黏性末端
C．不同的限制酶切割DNA分子形成的黏性末端一定不同
D．限制酶的切割位点在识别序列内部
3．（2021·北京）关于物质提取、分离或鉴定的高中生物学相关实验，叙述错误的是（ ）
A．研磨肝脏以破碎细胞用于获取含过氧化氢酶的粗提液
B．利用不同物质在酒精溶液中溶解性的差异粗提DNA
C．依据吸收光谱的差异对光合色素进行纸层析分离
D．利用与双缩脲试剂发生颜色变化的反应来鉴定蛋白质
4．如图表示构建基因表达载体所用的质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A．使用限制酶Ⅰ、Ⅱ切割可以防止目的基因自身环化
B．限制酶Ⅱ可以切割两种标记基因，所以没有特异性
C．可以用限制酶Ⅱ切割质粒、限制酶Ⅰ切割目的基因
D．将目的基因插入到四环素抗性基因内完成构建
5．（2020高三下·盐城月考）以紫色洋葱为材料进行相关实验，对实验结果的分析不合理的是（ ）
A．粗提DNA时观察到丝状物偏少，可能是向2mol·L-1NaCl溶液中加入蒸馏水过多
B．低倍镜下观察到鳞片叶外表皮部分细胞呈无色，可能是表皮细胞被撕破
C．观察根尖分生区细胞发现染色体着色深浅不一，可能是解离时间偏长
D．用根尖观察不到细胞质壁分离现象，可能是没有对根尖进行解离
6．（2020高二下·南京期中）如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
7．（2022高二下·南京期中）如下图所示为农作物新品种的育种方式，相关叙述错误的是（ ）
A．②③过程分别称为脱分化和再分化，开辟了植物繁殖的新途径
B．⑤过程中若连接的是黏性末端，则可使用E·coliDNA连接酶
C．①过程为植物体细胞杂交技术，可通过是否再生细胞壁鉴定杂种细胞
D．若要获得耐盐突变体，可对愈伤组织进行化学或物理的诱变处理
8．（2021高二下·咸阳月考）获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如下图。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是（ ）
①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点
②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
③酶切后，G基因形成的两个黏性末端序列不相同
④酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
A．①③ B．①④ C．②③ D．②④
9．（2020高二下·顺德期中）如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述正确的是（ ）
A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成由两个DNA片段之间连接形成的产物有两种
B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成重组质粒，该过程形成两个磷酸二酯键
C．为了防止目的基因反向粘连和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞
10．（2020·海南模拟）质粒是基因工程中最常用的载体，下列关于质粒的叙述，错误的是（ ）
A．质粒是具有自我复制能力的双链环状的DNA分子
B．质粒存在于细菌拟核之中，与拟核一起控制细菌的生命活动
C．作为载体的质粒上有限制酶的切割位点
D．作为载体的质粒存在特殊的标记基因
11．（2022高三下·大连开学考）下列关于生物学中常见的几种酶的叙述，正确的是（ ）
A．DNA连接酶将目的基因的黏性末端与载体的黏性末端之间的碱基黏合形成氢键
B．用限制酶从质粒上切下一个目的基因需消耗4个水分子
C．Taq酶是PCR扩增仪扩增DNA分子时常用的一种耐高温的DNA连接酶
D．在解离根尖分生区细胞时加入纤维素酶有利于提高解离的效果
12．（2021高二上·沈阳期中）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B．提取植物材料的DNA需先研磨破碎细胞
C．DNA只能溶于2 mol/L的NaCl溶液
D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺后颜色呈紫色
13．（2020高二下·北京期末）下列各种酶及其作用对应关系不正确的是（ ）
A．限制酶—识别并在特定位置切断 DNA 分子中的磷酸二酯键
B．RNA 聚合酶—与基因的特定位点结合，催化遗传信息的翻译
C．DNA 连接酶—将分开的 DNA 片段通过特定末端连接在一起
D．DNA 聚合酶—将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成 DNA 单链
14．如图所示的黏性末端是由几种限制酶作用产生的（ ）
A．1种 B．2种 C．3种 D．4种
15．（2021高二上·哈尔滨期末）图所示为某限制性核酸内切酶切割某DNA分子的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是（ ）
A．CTTAAG，切点在C和T之间 B．CTTAAG，切点在G和A之间
C．GAATTC，切点在G和A之间 D．GAATTC，切点在C和T之间
16．（2019高二下·梅县月考）下图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是( )
A．DNA连接酶、限制酶、解旋酶 B．限制酶、解旋酶、DNA连接酶
C．解旋酶、限制酶、DNA连接酶 D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶
17．（2021·苏州模拟）下列关于高中生物实验方法和选材的表述，正确的是（ ）
A．可用斐林试剂鉴定橙汁中还原糖的含量
B．稀释涂布平板法可用于测定土壤中细菌、霉菌的种类和数量
C．哺乳动物血液和植物菜花都不宜作为 DNA 粗提取的实验材料
D．洋葱鳞片叶内表皮没有颜色干扰，适宜用于观察染色体数目
18．（2022高三上·望奎月考）作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是（ ）。
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以便目的基因能够与其结合
D．它的参与能够使标记基因在宿主细胞中复制并稳定保存
19．（2021·辽宁）下列有关病毒在生物学和医学领域应用的叙述，错误的是（ ）
A．灭活的病毒可用于诱导动物细胞融合
B．用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体
C．基因工程中常用噬菌体转化植物细胞
D．经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防
20．（2023高二下·南宁期末）科学家卡彭蒂耶和杜德纳因利用CRISPR/Cas9系统编辑生物的基因组DNA而被授子诺贝尔化学奖。该技术需要向细胞中加入人工合成的引导RNA和一种来自细菌的Cas9蛋白，工作原理如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A．Cas9是一种能使磷酸二酯键发生断裂的蛋白质分子
B．细菌可凭借细胞中的CRISPR/Cas9抵抗噬菌体入侵
C．在引导RNA中存在着A-T、G-C碱基互补配对方式
D．人为改变引导RNA的序列可改变Cas9的切割部位
21．（2021高二下·山东期末）大肠杆菌经溶菌酶和阴离子去垢剂（SDS）处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中。利用上述原理可初步获得质粒DNA。下列关于质粒的粗提取和鉴定的分析错误的是（ ）
A．DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以用冷酒精析出上清液中的DNA
B．DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA
C．用限制酶I和Ⅱ处理提取的产物，电泳出现图结果，说明未提取到质粒
D．用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果
22．（2020·海南）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D．在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
23．（2020高一下·天津期末）某同学用鸡血进行DNA粗提取和鉴定实验。下列有关叙述正确的是（ ）
A．可用兔血代替鸡血进行实验
B．含有DNA的滤液中加入2mol/L的NaCl溶液，再过滤去除溶解的杂质
C．实验前需要预先配制好2mol/L和0.14mol/L两种NaCl溶液
D．鉴定时，两支试管中都应加入等量的NaCl溶液和二苯胺试剂
24．（2023·葫芦岛模拟）DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是（ ）
A．琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物
B．双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大
C．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测
D．凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来
25．（2023高二下·广西月考）CTAB可溶解细胞膜，易溶于乙醇，能与核酸形成复合物。采用CTAB法可获得高纯度的DNA，具体步骤：
①研磨植物叶片，加入提取液（含CTAB、2mol/LNaCl），离心后取上清液；
②加入氯仿、异戊醇，离心后取上清液；
③加入异丙醇，离心后取沉淀，再加入RNA酶、冷却的体积分数95%的乙醇；
④卷起丝状物备用。
下列相关叙述错误的是（ ）
A．向CTAB-核酸复合物依次加入2mol/LNaCl溶液、乙醇可使核酸和CTAB分离
B．氯仿、异戊醇、RNA酶的作用可能是除去蛋白质、多糖、RNA等杂质
C．异丙醇和乙醇的作用是将DNA沉淀并分离
D．提取的DNA可用斐林试剂在沸水浴中鉴定
二、实验探究题
26．（2023·成都模拟）研究人员利用基因敲除技术将猪的肌生成抑制蛋白基因敲除，从而得到了高骨骼肌含量的克隆猪。回答下列问题：
（1）常用基因敲除技术是通过同源重组将外源基因定点整合人靶细胞基因组上某一确定的位点，以定点修饰改造染色体上某一基因。相对传统的转基因技术，该基因敲除技术的最大优点是 。要实现敲除肌生成抑制蛋白基因的目的，首先要构建替换型打靶载体，该过程中需要的工具酶有 。
（2）将替换型打靶载体通过显微注射法导入猪胚胎干细胞，胚胎干细胞是从着床前胚胎分离出的 细胞。培养猪胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备一层细胞，这层细胞一般是 。
（3）筛选出靶细胞，导入猪的 中，再将其植入代孕猪体内，使其发育成嵌合体猪，再经过回交、筛选就可以得到肌生成抑制蛋白基因敲除纯合体。为了快速扩大基因敲除猪的种群，除进行有性生殖外，还可以采取 技术。为证明肌生成抑制蛋白基因敲除猪的表现型改变确实是由于敲除了该基因的缘故，可以采用的实验思路是 。
27．（2021高三上·江西月考）科学家研究发现，两种名为SOX2和OCT4的重要转录因子浓度的波动能决定胚胎干细胞转变的细胞类型。研究者在胚胎干细胞上敲入了几个“报告”基因，这些“报告”基因附在相关基因附近，当细胞中靶向基因表达时，其就会产生荧光信号。利用这种方法，研究人员就能在活体细胞中监测SOX2和OCT4的波动情况，同时还能阐明这些波动如何影响胚胎干细胞的命运。请回答下列问题。
（1）胚胎干细胞具有 性，所以可以发育成任何一种细胞。向胚胎干细胞培养液中加入一些转录因子，一段时间后镜检发现培养的细胞呈胰岛样细胞的变化，发生这一变化的根本原因是 。
（2）在体外培养胚胎干细胞时，需要在合成培养基的基础上添加 等天然成分。同时为了维持培养液的pH值，需要提供的气体环境是 。
（3）敲入基因就是将外源基因重组到另一种DNA分子上。在胚胎干细胞上敲入的“报告”基因其实是一种荧光蛋白基因，科学家用同一种限制酶切割荧光蛋白基因和胚胎干细胞的DNA是为了 在将“报告”基因“敲入”到胚胎干细胞的DNA上时，还需要用 酶连接荧光蛋白基因和胚胎干细胞的DNA之间的 键。
（4）请指出本研究在实践应用方面的一个意义 。
三、综合题
28．（2022高二上·成都期中）西北黄土高原是我国最大的苹果产区，干旱缺水是限制该地区苹果产业发展的主要环境因素之一，研究发现苹果细胞中存在一种对干旱具有一定抗性的基因——MdMYB48基因。现为了使拟南芥也获得抗旱性，研究者将MdMYB48基因导入了拟南芥细胞中，下图是获得抗干旱拟南芥的过程示意图。回答下列问题。
（1）MdMYB48基因与Ti质粒能重组在一起的前提是用相同的限制酶处理后获得相同的 。
（2）MdMYB48基因能转入到拟南芥细胞染色体DNA中的结构基础是 。
（3）当MdMYB48基因转入拟南芥细胞后，需要对其是否成功表达进行检测和鉴定，此时基因成功表达的直接证据是 。
（4）将导入外源基因的拟南芥细胞培育成拟南芥植株，利用的原理是 。
（5）利用基因工程育种的优点是 （答出1点即可）。
29．（2021·全国乙卷）[生物选修3:现代生物科技专题]
用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示，
回答下列问题
（1）常用的 DNA连接酶有E.coli DNA连接和T4 DNA连接酶，上图中 酶切割后的 DNA片段可以用E .coli DNA连接酶连接，上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
（2）DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
（3）DNA重组技术中所用的质粒体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中 ；质粒 DNA分子上有 ，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指 。
30．（2021·成都模拟） 2020年诺贝尔化学奖授予两位女科学家，以表彰她们对新一代基因编辑技术 CRISPR 的贡献. CRISPR/Cas9技术的实质是用特殊的引导序列(gRNA)将 Cas9酶“基因剪刀”精准定位到所需切割的基因上，然后进行编辑. 回答下列问题：
（1）Cas9酶的功能与 _酶的功能相似. 获得 Cas9酶，可通过基因工程构建基因表达载体，导入到动植物细胞中最终表达出 Cas9酶. 基因工程常用的运载体有 .
（2）引导序列gRNA 能够识别靶基因 DNA 的原因是 _. 研究发现，gRNA 的序列越短，造成编辑对象出错而“脱靶”的概率越大，最可能的原因是 _.
（3）与传统的限制酶切割基因技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术明显优点是 .
答案解析部分
1．【答案】C
【解析】【解答】A、猕猴桃组织细胞有细胞壁保护，因此加蒸馏水搅拌不会破坏细胞，不能将和DNA释放出来，A错误；
B、向猕猴桃果肉研磨液中加入适量的蒸馏水，以降低DNA的溶解度，不是降低DNA酶的活性，B错误；
C、DNA不溶于酒精，因此可用体积分数为95%冷酒精析出DNA，获得较纯净的DNA，C正确；
D、将猕猴桃果肉研磨液迅速加热到100℃会使DNA变性，D错误。
故答案为：C。
【分析】1、植物细胞壁具有维持细胞形态、保护细胞、支撑细胞等功能。
2、蒸馏水不会影响酶的活性，影响酶活性因素有温度、pH等。
3、可以用适宜浓度的盐溶液对DNA进行提取。
4、高温、强酸、强碱等因素可以使DNA变性。
2．【答案】A
【解析】【解答】Sau3AⅠ能识别5'-GATC-3'，也能识别5'-GGATCC-3'，A项正确。限制酶切割后可能形成黏性末端，如BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、Sau3AⅠ；限制酶切割后也可能形成平末端，如HindⅡ、SmaⅠ，B项错误。不同限制酶切割后可形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3AⅠ，C项错误。限制酶的切割位点可能在序列内部，如BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、HindⅡ、SmaⅠ；限制酶的切割位点也可能在序列外部，如Sau3AⅠ，D项错误。
【分析】关于“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）的简介：
1、来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2、限制酶功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
3、结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
3．【答案】C
【解析】【解答】A、探究酶的高效性，利用肝脏研磨液获得过氧化氢酶，A正确；
B、DNA粗提取的原理为不同物质在酒精溶液中溶解性不同，B正确；
C、色素分离原理色素在层析液中的溶解度不同，随着层析液扩散的速度不同，C错误；
D、蛋白质可与双缩脲试剂产生紫色反应，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、酶是活细胞产生的具有生物催化能力的有机物，大多数是蛋白质，少数是RNA；酶的催化具有高效性（酶的催化效率远远高于无机催化剂）、专一性（一种酶只能催化一种或一类化学反应的进行）、需要适宜的温度和pH值（在最适条件下，酶的催化活性是最高的，低温可以抑制酶的活性，随着温度升高，酶的活性可以逐渐恢复，高温、过酸、过碱可以使酶的空间结构发生改变，使酶永久性的失活）。
2、DNA粗提取：（1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大；破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可.如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜.例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液；（2）去除滤液中的杂质：方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同；方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
3、绿叶中色素的提取和分离实验，提取色素时需要加入无水乙醇（溶解色素)、石英砂（使研磨更充分）和碳酸钙（防止色素被破坏）﹔分离色素时采用纸层析法，原理是色素在层析液中的溶解度不同，随着层析液扩散的速度不同，最后的结果是观察到四条色素带，从上到下依次是胡萝卜素（橙黄色）、叶黄素(黄色）)、叶绿素a(蓝绿色)、叶绿素b（黄绿色)。
4、蛋白质可与双缩脲试剂产生紫色反应，实质是蛋白质中的肽键可以与双缩脲试剂发生反应产生紫色的络合物。只要存在肽键就可以与双缩脲试剂发生紫色反应。
4．【答案】D
【解析】【解答】限制酶Ⅰ的识别序列和切点是 ，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是 ，两者产生的黏性末端相同，不能防止目的基因自身环化，A错误；限制酶Ⅱ可以切割两种标记基因，是因为两种标记基因中都含有—GATC—核苷酸序列，限制酶识别切割位点具有特异性，B错误；目的基因只有一端具有GGATCC的片段，只能用限制酶Ⅱ切割。质粒上有两个GATC片段，若用限制酶Ⅱ切割，会将质粒切成两小段，只能用限制酶Ⅰ切割，C错误；用限制酶Ⅰ切割质粒的切割位点在四环素抗性基因内部，所以将目的基因插入到四环素抗性基因内完成构建，D正确。
【分析】限制酶的选择原则：根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因 。
5．【答案】D
【解析】【解答】解：DNA在浓度较高的NaCl溶液中的溶解度很高，但粗提DNA时观察到丝状物偏少，则有可能是使用的NaCl溶液浓度低，加入的蒸馏水过多导致，A选项正确；鳞片叶外表皮的颜色通过细胞中的有色体体现，若观察到的表皮细胞呈无色，则可能是表皮细胞被撕破，导致有色体被破坏观察不到颜色，B选项正确；观察根尖分生区细胞发现染色体着生深浅不一，可能是解离时间偏长，导致后续碱性染色剂染色时受到影响导致染色不均，C选项正确；根尖观察不到质壁分离现象是由于根尖细胞分裂旺盛，没有大液泡，因此观察不到质壁分离现象，D选项错误。故错误的选项选择D。
【分析】紫色洋葱为高等植物，其表皮可作观察叶绿体、质壁分离及其复原的实验材料，其根尖分生区可作为观察细胞有丝分裂的材料。
6．【答案】C
【解析】【解答】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。综上正确顺序是①④②③，C正确。
故答案为：C。
【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
7．【答案】C
【解析】【解答】A、②③过程分别称为脱分化（由杂交细胞脱分化得到愈伤组织）和再分化（由愈伤组织分化得到胚状体），开辟了植物繁殖的新途径，A正确；
B、E·coliDNA连接酶来自于大肠杆菌，可以连接黏性末端，B正确；
C、①过程为植物体细胞杂交技术中的一个环节，不是完整的植物体细胞杂交技术，且通过是否再生细胞壁也不能鉴定杂种细胞，因为两个相同的原生质体融合也可以再生出细胞壁，C错误；
D、对愈伤组织进行化学或物理的诱变处理，提高了突变的频率，可能可以获得耐盐突变体，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、植物体细胞杂交时先用酶解法去除植物细胞的细胞壁，进行植物原生质体的融合，形成杂种细胞，再通过植物的组织培养将杂种细胞培育成杂种植株。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成植株，用选择培养基选择目的植株。不同种的植物之间具有生殖隔离，该种方法打破了不同种植物间的生殖隔离，克服了远缘杂交不亲和的障碍。在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
2、DNA连接酶：①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
8．【答案】A
【解析】【解答】为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，则质粒内每种限制酶只有一个切割位点，①正确；含目的基因DNA内每种限制酶也只有一个切割位点，目的基因内不能有限制酶切割位点，②错误；为防止酶切产物自身环化，则酶切后的两个黏性末端序列不同，③正确、④错误。故答案为：A。
【分析】 1、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）限制酶功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2、“分子缝合针”——DNA连接酶：
(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源T4噬菌体，能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
9．【答案】C
【解析】【解答】根据题意，目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，将含有目的基因的DNA与用EcoRⅠ酶切，会得到含目的基因的DNA片段和不含目的基因的DNA片段；根据质粒的简图可知，将质粒用EcoRⅠ酶切，会得到与质粒周长等长的链状DNA；因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成含目的基因的原DNA片段两个之间进行连接、由含目的基因的DNA片段与质粒周长等长的链状DNA相互连接形成的链状DNA，二倍于原质粒周长的环状DNA三种类型，A错误；DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误；EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割开的质粒两端形成的末端不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向粘连和质粒自身环化，C正确；题图显示，在构建基因表达载体的过程中质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因都不会被破坏，因此能在含青霉素和四环素的培养基中生长的受体细胞不能表明目的基因已成功导入该细胞，D错误。
【分析】1.正确选择限制酶的要点：（1）载体和目的基因都有识别位点和形成相同黏性末端；（2）不能切坏标记基因与目的基因；（3）载体的识别位点应位于启动子和终止子之间。
2.只用一种限制酶切割质粒和目的基因会存在两个缺点：（1）目的基因自己环化；（2）目的基因与质粒反向连接，使基因不能正常表达。
10．【答案】B
【解析】【解答】解：A. 由分析可知，质粒是具有自我复制能力的双链环状的DNA分子，A正确；
B. 拟核DNA是细菌的主要遗传物质,包含控制细菌生命活动的遗传信息,没有了它细菌就无法存活、繁殖；质粒DNA是附加的遗传物质,使细菌表达一些特殊的形状,没有了它细菌依然可以正常生活、繁殖，B错误；
C. 作为载体的质粒上有限制酶的切割位点，这是质粒作为运载体的条件之一，C正确；
D. 作为载体的质粒存在特殊的标记基因，以便对于目的基因进行检测，D正确；
该题需选择错误选项，故答案为B。
【分析】质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物的细胞中，是拟核或细胞核以外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
11．【答案】B
【解析】【解答】A、DNA连接酶是将目的基因的黏性末端与载体的黏性末端之间黏合形成磷酸二酯键，碱基之间的氢键自动形成，A错误；
B、用限制酶从质粒上切下一个目的基因需打开2个切口，破坏四个磷酸二酯键，消耗4个水分子，B正确；
C、Taq酶是PCR仪扩增DNA分子时常用的一种耐高温DNA聚合酶，C错误；
D、在解离根尖分生区细胞时加入盐酸使植物细胞相互分散开，纤维素酶可用于除去细胞壁，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、DNA连接酶的作用：将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
2、限制性内切核酸酶：（1）作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（2）结果：在识别序列的中心轴线两侧切开产生黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开产生平末端。
3、PCR扩增过程：（1）变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。（2）复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。（3）延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
4、解离液为质量分数为15%的盐酸和体积分数为95%的酒精1：1体积比混合，能使组织中的细胞相互分离开。
12．【答案】B
【解析】【解答】A、猪是哺乳动物，其成熟红细胞内没有细胞核，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；
B、植物细胞含有细胞壁，因此选用植物细胞提取DNA时，需先研磨破碎细胞，B正确；
C、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2mol/L的NaCl溶液中溶解度高，C错误；
D、溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热后冷却，颜色应呈现蓝色，D错误。
故答案为：B。
【分析】DNA粗提取和鉴定过程：
1、实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大；
2、破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可.如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜.例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液；
3、去除滤液中的杂质：原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同； 4、DNA的析出与鉴定：（1）将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2~3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA.用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分；（2）取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解.然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂.混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
13．【答案】B
【解析】【解答】A、限制酶--识别并在特定位置切断DNA分子中的磷酸二酯键，A正确；
B、RNA聚合酶--与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录，B错误；
C、DNA连接酶--将分开的DNA片段通过特定末端连接在一起，形成磷酸二酯键，C正确；
D、DNA聚合酶--将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成DNA单链，D正确。
故答案为：B。
【分析】生物工程中酶的作用：1、DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。2、DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。3、限制性核酸内切酶：从DNA链的内部进行切割，分为限制性内切酶和非限制性内切酶。4、DNA修饰酶是指对DNA分子进行修饰的酶，目前基因工程中常用的酶有：碱性磷酸酶、末端转移酶、甲基化酶。5、反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，既可以用DNA为模板，也可以用RNA为模板进行互补链的合成。基因工程中主要功能是利用真核mRNA为模板反转录cDNA，用来建立cDNA文库，进而分离为特定蛋白质编码的基因。
14．【答案】C
【解析】【解答】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成两个相同的黏性末端。图中四个黏性末端中第一个和第二个相同，由同一种限制酶切割产生，所以图中共有3种不同的黏性末端，由3种限制酶切割形成。 故答案为：C。
【分析】限制性内切核酸酶：（1）作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（2）结果：在识别序列的中心轴线两侧切开产生黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开产生平末端。
15．【答案】C
【解析】【解答】由图可知，上端链从左向右读，下端链从右向左读可得，被切割DNA的碱基序列为GAATTC；对比切前与切后的DNA片段可知，DNA片段从G与A之间断开。由图可知，C项的碱基序列与切点均正确。
故答案为：C
【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。不同的限制酶识别不同的核苷酸序列并识别不同的切点，形成的黏性末端或平末端不同。
16．【答案】C
【解析】【解答】如图所示①表示氢键，②③表示磷酸二酯键。 可以打开氢键的酶为解旋酶、可以打开磷酸二酯键的酶为限制酶、可以连接两个DNA片段之间的磷酸二酯键的酶是DNA连接酶。
故答案为：C。
【分析】1.限制酶可以切割磷酸二酯键，使得DNA片段末端形成黏性末端和平末端；
2.DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
17．【答案】B
【解析】【解答】A、橙汁的颜色会干扰沉淀量的判断，A错误；
B、稀释涂布法通过菌落的数量来代表活菌数，通过菌落的形态特征来鉴别其种类，B正确；
C、哺乳动物血液中的成熟红细胞没有细胞核和线粒体，而白细胞数量少，均不适宜做提取DNA的材料；菜花是植物细胞含有大量的DNA，可以作提取DNA的植物材料，但在提取前需先去除细胞壁，C错误；
D、洋葱内表皮细胞不分裂，不会形成染色体，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、鉴定组织中的有机物时，选择实验材料不要对实验现象造成干扰。
2、稀释涂布平板法可以用于鉴定土壤中细菌的种类和数量。
3、哺乳动物成熟红细胞无细胞核，无核DNA。
4、选择观察染色体数目的材料，需要选择可以进行分裂的组织材料。
18．【答案】A
【解析】【解答】A、作为运载体必须具备的条件是之一是在宿主细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制，即能在宿主细胞中稳定保存并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；
B、具有一个至多个限制酶切点，是为了使外源DNA片段（目的基因）插入其中，B错误；
C、标记基因是为了便于重组DNA的鉴定和选择，C错误；
D、它的参与能够使目的基因在宿主细胞中复制并稳定保存，D错误。
故答案为：A。
【分析】“分子运输车”—载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
19．【答案】C
【解析】【解答】A、诱导动物细胞融合可以利用灭火的病毒，A正确；
B、制备单克隆抗体需先给小鼠注射特定抗原（特定病毒）使之发生免疫反应，B正确；
C、将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，C错误；
D、经灭活或者减毒的病毒可以作为疫苗用于免疫预防，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、诱导动物细胞融合的方法有物理法（电激等）、化学法（聚乙二醇PEG）、生物法（灭活的病毒）等。
2、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原（特定病毒）使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
3、将目的基因导入受体细胞∶（1）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；（3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
4、疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗有三种类型：（1）灭活的微生物；（2）分离的微生物成分或其他产物；（3）减毒微生物。使机体产生相应的抗体和记忆细胞（主要是得到记忆细胞），使人在不发病的情况下产生抗体，获得免疫力。
20．【答案】C
【解析】【解答】A、图示Cas9蛋白本质为蛋白质，用以切割DNA，是一种能使磷酸二酯键断裂的酶，A 正确；
B、Cas9蛋白是一种来自细菌的功能类似于限制酶的蛋白质分子，当细菌被噬菌体入侵时，注入细菌的遗传物质DNA会被Cas9蛋白切割，从而阻止噬菌体繁殖，B 正确；
C、图示引导RNA的结构有折叠成双链的片段，因此在引导RNA中存在着A-U、G-C碱基互补配对方式，C 错误；
D、引导RNA用以识别识别特定的 DNA 序列并与之结合，人为改变引导RNA的碱基序列改变Cas9的切割部位，D 正确。
故答案为：C。
【分析】1、切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
2、有些RNA分子的单链存在自身折叠的部分形成双链片段，比如tRNA，部分双链结构存在着A-U、G-C碱基互补配对方式。
21．【答案】C
【解析】【解答】A、通过分析可知，DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以用冷酒精析出上清液中的DNA，A正确；
B、DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，这样可以去除DNA中的某些杂质，提取的DNA可用二苯胺试剂在沸水加热条件下生成蓝色，B正确；
C、限制性酶Ⅰ和限制性酶Ⅱ处理提取的产物，只得到一条带，说明提取物是环状DNA，即提取物为质粒，C错误；
D、用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果，D正确。
故答案为：C。
【分析】DNA的粗提取和鉴定步骤：
1、选取DNA含量相对较高的生物组织
2、破碎细胞，获取含DNA的滤液，加入蒸馏水，利用吸水胀破法使细胞膜破裂，DNA等内容物流出；对于植物，可以用洗涤剂溶解细胞膜，加入一定比例的洗涤剂和食盐；
3、去除滤液的杂质，（1）方案一：利用DNA在不同浓度NaCl中的溶解度不同，而杂质沉淀，去除杂质，DNA充分溶解，得到较纯净的DNA；图2具体操作为：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液的物质的量浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl的物质的量浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去不溶的杂质，再用物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液溶解DNA；（2）方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10~15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶可以水解蛋白质；
4、DNA的析出和鉴定：将处理的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数95%），静置2~3分钟，溶液会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸水分。取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一个试管，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，试管置于沸水中5min，待试管冷却，比较试管溶液颜色变化，看看DNA溶液是否变蓝。
22．【答案】A
【解析】【解答】A、羊的成熟红细胞没有细胞核，因此不可作为提取DNA的材料，A错误；
B、提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，而食盐的作用是提高DNA的溶解度，B正确；
C、预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，同时根据DNA蛋白质溶于酒精，而DNA不溶于酒精的特性将其析出，C正确；
D、由分析可知，在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，据此鉴定DNA的存在，D正确。
故答案为：A。
【分析】1.DNA粗提取与鉴定的原理1.DNA的溶解性：（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的；（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离；2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响；3.DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
23．【答案】D
【解析】【解答】A、兔是哺乳动物，其成熟的红细胞中不含细胞核和细胞器，即不含DNA，因此不能用兔血代替鸡血进行实验，A错误；
B、DNA在2mol/L的NaCl溶液中的溶解度大，因此在含有DNA的滤液中加入2mol/L的NaCl溶液，再过滤去除不溶解的杂质，B错误；
C、实验前不需要预先配制好0.14mol/L浓度的NaCl溶液，实验过程中通过加入蒸馏水降低NaCl溶液的浓度，使其浓度达到0.14mol/L，C错误；
D、鉴定时，根据实验的对照原则和单一变量原则，两支试管中都应加入等量的NaCl溶液和二苯胺试剂，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。2、DNA粗提取和鉴定的过程：（1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：（3）去除滤液中的杂质：（4）DNA的析出与鉴定：
24．【答案】B
【解析】【解答】A、琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离，可用于分离、鉴定DNA分子的混合物，A正确；
B、凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小有关，双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B错误；
C、凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，用于分离后DNA的检测，C正确；
D、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D正确。
故答案为：B。
【分析】凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，通过的路程短，移动速度快；相对分子质量小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程长，移动速度慢。因此，样品中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量小的分子后流出。
25．【答案】D
【解析】【解答】A、由题意可知，CTAB-核酸复合物能够溶于氯化钠溶液中，后加入乙醇后，由于DNA不溶于乙醇，而CTAB易融于乙醇，因此可将DNA和CTAB分离，A不符合题意；
B、由题意可知，加入氯仿、异丙醇后离心沉淀取上清液，可推断二者可能是能够将蛋白质、多糖进行沉淀，而RNA酶能够水解RNA，最终得到较为纯净的DNA，B不符合题意；
C、由题意可知，加入异丙醇，离心后取沉淀，可推断DNA不溶于异丙醇，加入乙醇后，卷起丝状物，说明，DNA不溶于乙醇，综上，异丙醇和乙醇的作用是将DNA沉淀并分离，C不符合题意；
D、DNA能够和二苯胺在沸水浴中反应呈蓝色，D符合题意。
故答案为：D。
【分析】可利用DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色的原理，对DNA进行鉴定。
可利用还原糖与斐林试剂在50-60℃温水条件下反应出现砖红色沉淀的原理，将斐林试剂用于检测还原糖。
26．【答案】（1）克服了传统转基因技术中目的基因整合的盲目性和随机性（能够定点整合）；限制性核酸内切酶和DNA连接酶
（2）内细胞团；胚胎成纤维细胞
（3）囊胚；细胞核移植；给基因敲除猪导入肌生成抑制蛋白基因（或者直接注射肌生成抑制蛋白），养殖一段时间后观察猪骨骼肌的生长情况
【解析】【解答】（1）由题干可知：基因敲除技术是将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以定点修饰改造染色体上某一基因。 相对传统的转基因技术，后者的整合是随机的，故基因敲除技术的最大优点是克服了传统转基因技术的盲目性和随机性。构建基因表达载体时，需要的工具酶有限制性核酸内切酶（切割目的基因和载体）和DNA连接酶（连接目的基因和载体）。
（2）胚胎干细胞是从着床前胚胎分离出的内细胞团的细胞，具有向各种组织细胞分化的潜能，培养猪胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备一层胚胎成纤维细胞，该类细胞可以分泌一些能够抑制细胞分化的物质，可以促进干细胞的生长，同时抑制干细胞的分化。
（3）筛选出靶细胞，导入猪的囊胚中，再将其植入代孕猪体内，使其发育成嵌合体猪并生产。要快速扩大基因敲除猪的种群，可以采取有性生殖、胚胎分割和细胞核移植、克隆繁殖技术。为证明肌生成抑制蛋白基因敲除猪的表现型改变确实是由于敲除了该基因的缘故，可以通过导入肌生成抑制蛋白基因或者直接注射肌生成抑制蛋白，如果猪表现型转为正常，说明确实是山于敲除了肌生成抑制蛋白基因的缘故。
【分析】1、基因工程的基本工具： （1）限制性内切核酸酶：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 （2）DNA连接酶：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。 （3）载体：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因，能携带外源DNA片段进入受体细胞。
2、胚胎干细胞（ES或EK细胞）： （1）来源：早期胚胎或原始性腺。 （2）特点：形态上，体积小、核大、核仁明显；功能上，具有发育的全能性；体外培养条件下可以增殖而不分化。
27．【答案】（1）发育的全能；基因的选择性表达
（2）血清（或血浆）；95%空气和5%的二氧化碳
（3）获得相同的黏性末端，以使它们能进行碱基互补配对；DNA连接酶；磷酸二酯
（4）探究诱导胚胎干细胞分化的因素，以精确控制胚胎干细胞分化成所需要的细胞
【解析】【解答】（1）胚胎干细胞具有发育的全能性，可以发育成任何一种细胞；向胚胎干细胞培养液中加入一些转录因子，一段时间后镜检发现培养的细胞呈胰岛样细胞的变化属于细胞分化，发生细胞分化的根本原因是基因的选择性表达。
（2）在体外进行培养动物细胞时需要在合成培养基的基础上添加血清（或“血浆”）等天然成分；同时为了维持培养液的pH值，需要提供的气体环境是95%空气和5%的二氧化碳。
（3）科学家用同一种限制酶切割荧光蛋白基因和胚胎干细胞的DNA是为了获得相同的黏性末端，以使它们能进行碱基互补配对；在将“报告”基因“敲入”到胚胎干细胞的DNA上时，还需要用DNA连接酶连接荧光蛋白基因和胚胎干细胞的DNA之间的磷酸二酯键。
（4）本研究在实践应用方面的一个意义是探究诱导胚胎干细胞分化的因素，以精确控制胚胎干细胞分化成所需要的细胞。
【分析】1、动物细胞培养需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。
④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
2、基因工程的工具：①限制酶，能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；②DNA连接酶，通过催化磷酸二酯键形成使两个DNA的片段连接起来；③运载体，质粒是最常用的运载体，除此之外，还有噬菌体、动植物病毒。
28．【答案】（1）黏性末端
（2）两者都是DNA，都具有双螺旋结构
（3）拟南芥细胞中产生了MdMYB48基因控制合成的蛋白质（意思合理即可）
（4）植物细胞的全能性
（5）能按照人类意愿定向改变生物的性状、能打破不同物种间的生殖障碍
【解析】【解答】（1）需要用相同的限制酶处理目的基因与运载体，获得相同的黏性末端，这样目的基因与运载体才能通过碱基互补配对结合在一起。
（2）目的基因整合到受体细胞的染色体上，是将目的基因与受体细胞的DNA连接在一起，只有当两者都是DNA，都具有双螺旋结构才能实现。
（3）基因表达是指基因通过转录和翻译合成蛋白质的过程，因此目的基因成功表达的直接证据就是检测到目的基因控制合成的蛋白质。
（4）细胞发育成完整植株利用了（植物）细胞的全能性。
（5）基因工程的优点主要有两点：能按照人类意愿定向改变生物的性状、能打破不同物种间的生殖障碍。
【分析】基因工程的操作程序： （1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。 （3）将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 （4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
29．【答案】（1）EcoR I和Pst I；EcoR I、Pst I、Sma I、EcoR V
（2）磷酸二酯键
（3）自我复制（或自我复制并稳定存在）；一至多个限制酶切割位点；用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
（4）在目的基因的首端，能与RNA聚合酶识别并结合，驱动目的基因转录出mRNA的一段具有特殊序列的DNA片段
【解析】【解答】（1）限制酶EcoR I和Pst I切割形成的是黏性末端，限制酶Sma l和EcoR V切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoR I和Pst I切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E. coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶Sma l和EcoR V切割后的DNA片段(平末端）也可以用T4DNA连接酶连接。
（2）目的基因片段与质粒载体片段均为DNA片段，DNA连接酶将两个DNA片段连接形成的化学键是磷酸二酯键。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
【分析】1、黏性末端和平末端：
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
分析题图，可知限制酶EcoR I和Pst I切割形成的是黏性末端，限制酶Sma l和EcoR V切割形成的是平末端。
2、DNA分子的连接技术——DNA连接酶
作用：把两条DNA末端之间的缝隙“缝合”起来。
连接部位：磷酸二酯键
特点：只要在同一种限制性内切酶切割的两种DNA片段中加上这种DNA连接酶，它就会把片段缝合得天衣无缝。
3、作为运载体必须具备的条件：①具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。②能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。③具有某些标记基因，便于进行筛选。最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
4、运载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的运载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入运载体的受体细胞，原理如下图所示：
30．【答案】（1）限制性核酸内切；质粒、噬菌体和动植物病毒
（2）gRNA的碱基序列与靶DNA的碱基序列互补配对；碱基序列越短，与其他DNA序列配对的可能性就越大，造成gRNA与目的基因以外的序列结合
（3）可以人为的选择DNA上的目标位点进行切割，目的性更强
【解析】【解答】(1)Cas9酶可用作“基因剪刀”说明其功能与限制性核酸内切酶的功能相似。获得 Cas9酶，可通过基因工程构建基因表达载体，导入到动植物细胞中最终表达出 Cas9酶. 基因工程常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒。
（2）引导序列gRNA 能够识别靶基因 DNA 的原因是gRNA的碱基序列与靶DNA的碱基序列互补配对。gRNA 的序列越短，与其他DNA序列配对的可能性就越大，造成gRNA与目的基因以外的序列结合，从而造成编辑对象出错而“脱靶”的概率越大。
（3）与传统的限制酶切割基因技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术明显优点是可以人为的选择DNA上的目标位点进行切割，目的性更强。
故答案为：（1）限制性核酸内切质粒、噬菌体和动植物病毒 （2）gRNA的碱基序列与靶DNA的碱基序列互补配对 碱基序列越短，与其他DNA序列配对的可能性就越大，造成gRNA与目的基因以外的序列结合 （3）可以人为的选择DNA上的目标位点进行切割，目的性更强 。
【分析】基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有特异性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体
（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体： 噬菌体、动植物病毒
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3.1重组DNA技术的基本工具
一、单选题
1．（2021高二下·湖北月考）在利用猕猴桃进行“DNA粗提取与鉴定”实验中，相关操作正确的是（ ）
A．直接向剪碎的猕猴祧果肉组织中加入蒸馏水并搅拌，以释放核DNA
B．向猕猴桃果肉研磨液中加入适量的蒸馏水，以降低DNA酶活性
C．向溶有粗提物的NaCI溶液中加入冷却的本积分数为95%的酒精，可以获得较纯净的DNA
D．将猕猴桃果肉研磨液迅速加热到100℃，再冷却后过滤，可以获得DNA粗提物
2．下表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，由此推断的以下说法中，正确的是( )
限制酶 名称 识别序列和 切割位点 限制酶 名称 识别序列和 切割位点
BamH Ⅰ 5'-G↓GATCC-3' KpnⅠ 5'-GGTAC↓C-3'
EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3' Sau3AⅠ 5' GATC-3'
HindⅡ 5'-GTY↓RAC-3' SmaⅠ 5'-CCC↓GGG-3'
(注 Y=C或T，R=A或G)
A．一种限制酶可能识别2种核苷酸序列
B．限制酶切割后一定形成黏性末端
C．不同的限制酶切割DNA分子形成的黏性末端一定不同
D．限制酶的切割位点在识别序列内部
3．（2021·北京）关于物质提取、分离或鉴定的高中生物学相关实验，叙述错误的是（ ）
A．研磨肝脏以破碎细胞用于获取含过氧化氢酶的粗提液
B．利用不同物质在酒精溶液中溶解性的差异粗提DNA
C．依据吸收光谱的差异对光合色素进行纸层析分离
D．利用与双缩脲试剂发生颜色变化的反应来鉴定蛋白质
4．如图表示构建基因表达载体所用的质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A．使用限制酶Ⅰ、Ⅱ切割可以防止目的基因自身环化
B．限制酶Ⅱ可以切割两种标记基因，所以没有特异性
C．可以用限制酶Ⅱ切割质粒、限制酶Ⅰ切割目的基因
D．将目的基因插入到四环素抗性基因内完成构建
5．（2020高三下·盐城月考）以紫色洋葱为材料进行相关实验，对实验结果的分析不合理的是（ ）
A．粗提DNA时观察到丝状物偏少，可能是向2mol·L-1NaCl溶液中加入蒸馏水过多
B．低倍镜下观察到鳞片叶外表皮部分细胞呈无色，可能是表皮细胞被撕破
C．观察根尖分生区细胞发现染色体着色深浅不一，可能是解离时间偏长
D．用根尖观察不到细胞质壁分离现象，可能是没有对根尖进行解离
6．（2020高二下·南京期中）如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
7．（2022高二下·南京期中）如下图所示为农作物新品种的育种方式，相关叙述错误的是（ ）
A．②③过程分别称为脱分化和再分化，开辟了植物繁殖的新途径
B．⑤过程中若连接的是黏性末端，则可使用E·coliDNA连接酶
C．①过程为植物体细胞杂交技术，可通过是否再生细胞壁鉴定杂种细胞
D．若要获得耐盐突变体，可对愈伤组织进行化学或物理的诱变处理
8．（2021高二下·咸阳月考）获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如下图。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是（ ）
①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点
②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
③酶切后，G基因形成的两个黏性末端序列不相同
④酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
A．①③ B．①④ C．②③ D．②④
9．（2020高二下·顺德期中）如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述正确的是（ ）
A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成由两个DNA片段之间连接形成的产物有两种
B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成重组质粒，该过程形成两个磷酸二酯键
C．为了防止目的基因反向粘连和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞
10．（2020·海南模拟）质粒是基因工程中最常用的载体，下列关于质粒的叙述，错误的是（ ）
A．质粒是具有自我复制能力的双链环状的DNA分子
B．质粒存在于细菌拟核之中，与拟核一起控制细菌的生命活动
C．作为载体的质粒上有限制酶的切割位点
D．作为载体的质粒存在特殊的标记基因
11．（2022高三下·大连开学考）下列关于生物学中常见的几种酶的叙述，正确的是（ ）
A．DNA连接酶将目的基因的黏性末端与载体的黏性末端之间的碱基黏合形成氢键
B．用限制酶从质粒上切下一个目的基因需消耗4个水分子
C．Taq酶是PCR扩增仪扩增DNA分子时常用的一种耐高温的DNA连接酶
D．在解离根尖分生区细胞时加入纤维素酶有利于提高解离的效果
12．（2021高二上·沈阳期中）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B．提取植物材料的DNA需先研磨破碎细胞
C．DNA只能溶于2 mol/L的NaCl溶液
D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺后颜色呈紫色
13．（2020高二下·北京期末）下列各种酶及其作用对应关系不正确的是（ ）
A．限制酶—识别并在特定位置切断 DNA 分子中的磷酸二酯键
B．RNA 聚合酶—与基因的特定位点结合，催化遗传信息的翻译
C．DNA 连接酶—将分开的 DNA 片段通过特定末端连接在一起
D．DNA 聚合酶—将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成 DNA 单链
14．如图所示的黏性末端是由几种限制酶作用产生的（ ）
A．1种 B．2种 C．3种 D．4种
15．（2021高二上·哈尔滨期末）图所示为某限制性核酸内切酶切割某DNA分子的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是（ ）
A．CTTAAG，切点在C和T之间 B．CTTAAG，切点在G和A之间
C．GAATTC，切点在G和A之间 D．GAATTC，切点在C和T之间
16．（2019高二下·梅县月考）下图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是( )
A．DNA连接酶、限制酶、解旋酶 B．限制酶、解旋酶、DNA连接酶
C．解旋酶、限制酶、DNA连接酶 D．限制酶、DNA连接酶、解旋酶
17．（2021·苏州模拟）下列关于高中生物实验方法和选材的表述，正确的是（ ）
A．可用斐林试剂鉴定橙汁中还原糖的含量
B．稀释涂布平板法可用于测定土壤中细菌、霉菌的种类和数量
C．哺乳动物血液和植物菜花都不宜作为 DNA 粗提取的实验材料
D．洋葱鳞片叶内表皮没有颜色干扰，适宜用于观察染色体数目
18．（2022高三上·望奎月考）作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是（ ）。
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以便目的基因能够与其结合
D．它的参与能够使标记基因在宿主细胞中复制并稳定保存
19．（2021·辽宁）下列有关病毒在生物学和医学领域应用的叙述，错误的是（ ）
A．灭活的病毒可用于诱导动物细胞融合
B．用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体
C．基因工程中常用噬菌体转化植物细胞
D．经灭活或减毒处理的病毒可用于免疫预防
20．（2023高二下·南宁期末）科学家卡彭蒂耶和杜德纳因利用CRISPR/Cas9系统编辑生物的基因组DNA而被授子诺贝尔化学奖。该技术需要向细胞中加入人工合成的引导RNA和一种来自细菌的Cas9蛋白，工作原理如图所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A．Cas9是一种能使磷酸二酯键发生断裂的蛋白质分子
B．细菌可凭借细胞中的CRISPR/Cas9抵抗噬菌体入侵
C．在引导RNA中存在着A-T、G-C碱基互补配对方式
D．人为改变引导RNA的序列可改变Cas9的切割部位
21．（2021高二下·山东期末）大肠杆菌经溶菌酶和阴离子去垢剂（SDS）处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中。利用上述原理可初步获得质粒DNA。下列关于质粒的粗提取和鉴定的分析错误的是（ ）
A．DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以用冷酒精析出上清液中的DNA
B．DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA
C．用限制酶I和Ⅱ处理提取的产物，电泳出现图结果，说明未提取到质粒
D．用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果
22．（2020·海南）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B．提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C．预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解
D．在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
23．（2020高一下·天津期末）某同学用鸡血进行DNA粗提取和鉴定实验。下列有关叙述正确的是（ ）
A．可用兔血代替鸡血进行实验
B．含有DNA的滤液中加入2mol/L的NaCl溶液，再过滤去除溶解的杂质
C．实验前需要预先配制好2mol/L和0.14mol/L两种NaCl溶液
D．鉴定时，两支试管中都应加入等量的NaCl溶液和二苯胺试剂
24．（2023·葫芦岛模拟）DNA琼脂糖凝胶电泳的分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时受到较大阻力，借此分离不同大小的DNA片段。下列说法错误的是（ ）
A．琼脂糖凝胶电泳可用于分离、鉴定DNA分子的混合物
B．双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越大
C．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA的检测
D．凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来
25．（2023高二下·广西月考）CTAB可溶解细胞膜，易溶于乙醇，能与核酸形成复合物。采用CTAB法可获得高纯度的DNA，具体步骤：
①研磨植物叶片，加入提取液（含CTAB、2mol/LNaCl），离心后取上清液；
②加入氯仿、异戊醇，离心后取上清液；
③加入异丙醇，离心后取沉淀，再加入RNA酶、冷却的体积分数95%的乙醇；
④卷起丝状物备用。
下列相关叙述错误的是（ ）
A．向CTAB-核酸复合物依次加入2mol/LNaCl溶液、乙醇可使核酸和CTAB分离
B．氯仿、异戊醇、RNA酶的作用可能是除去蛋白质、多糖、RNA等杂质
C．异丙醇和乙醇的作用是将DNA沉淀并分离
D．提取的DNA可用斐林试剂在沸水浴中鉴定
二、实验探究题
26．（2023·成都模拟）研究人员利用基因敲除技术将猪的肌生成抑制蛋白基因敲除，从而得到了高骨骼肌含量的克隆猪。回答下列问题：
（1）常用基因敲除技术是通过同源重组将外源基因定点整合人靶细胞基因组上某一确定的位点，以定点修饰改造染色体上某一基因。相对传统的转基因技术，该基因敲除技术的最大优点是 。要实现敲除肌生成抑制蛋白基因的目的，首先要构建替换型打靶载体，该过程中需要的工具酶有 。
（2）将替换型打靶载体通过显微注射法导入猪胚胎干细胞，胚胎干细胞是从着床前胚胎分离出的 细胞。培养猪胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备一层细胞，这层细胞一般是 。
（3）筛选出靶细胞，导入猪的 中，再将其植入代孕猪体内，使其发育成嵌合体猪，再经过回交、筛选就可以得到肌生成抑制蛋白基因敲除纯合体。为了快速扩大基因敲除猪的种群，除进行有性生殖外，还可以采取 技术。为证明肌生成抑制蛋白基因敲除猪的表现型改变确实是由于敲除了该基因的缘故，可以采用的实验思路是 。
27．（2021高三上·江西月考）科学家研究发现，两种名为SOX2和OCT4的重要转录因子浓度的波动能决定胚胎干细胞转变的细胞类型。研究者在胚胎干细胞上敲入了几个“报告”基因，这些“报告”基因附在相关基因附近，当细胞中靶向基因表达时，其就会产生荧光信号。利用这种方法，研究人员就能在活体细胞中监测SOX2和OCT4的波动情况，同时还能阐明这些波动如何影响胚胎干细胞的命运。请回答下列问题。
（1）胚胎干细胞具有 性，所以可以发育成任何一种细胞。向胚胎干细胞培养液中加入一些转录因子，一段时间后镜检发现培养的细胞呈胰岛样细胞的变化，发生这一变化的根本原因是 。
（2）在体外培养胚胎干细胞时，需要在合成培养基的基础上添加 等天然成分。同时为了维持培养液的pH值，需要提供的气体环境是 。
（3）敲入基因就是将外源基因重组到另一种DNA分子上。在胚胎干细胞上敲入的“报告”基因其实是一种荧光蛋白基因，科学家用同一种限制酶切割荧光蛋白基因和胚胎干细胞的DNA是为了 在将“报告”基因“敲入”到胚胎干细胞的DNA上时，还需要用 酶连接荧光蛋白基因和胚胎干细胞的DNA之间的 键。
（4）请指出本研究在实践应用方面的一个意义 。
三、综合题
28．（2022高二上·成都期中）西北黄土高原是我国最大的苹果产区，干旱缺水是限制该地区苹果产业发展的主要环境因素之一，研究发现苹果细胞中存在一种对干旱具有一定抗性的基因——MdMYB48基因。现为了使拟南芥也获得抗旱性，研究者将MdMYB48基因导入了拟南芥细胞中，下图是获得抗干旱拟南芥的过程示意图。回答下列问题。
（1）MdMYB48基因与Ti质粒能重组在一起的前提是用相同的限制酶处理后获得相同的 。
（2）MdMYB48基因能转入到拟南芥细胞染色体DNA中的结构基础是 。
（3）当MdMYB48基因转入拟南芥细胞后，需要对其是否成功表达进行检测和鉴定，此时基因成功表达的直接证据是 。
（4）将导入外源基因的拟南芥细胞培育成拟南芥植株，利用的原理是 。
（5）利用基因工程育种的优点是 （答出1点即可）。
29．（2021·全国乙卷）[生物选修3:现代生物科技专题]
用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示，
回答下列问题
（1）常用的 DNA连接酶有E.coli DNA连接和T4 DNA连接酶，上图中 酶切割后的 DNA片段可以用E .coli DNA连接酶连接，上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
（2）DNA 连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
（3）DNA重组技术中所用的质粒体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中 ；质粒 DNA分子上有 ，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指 。
30．（2021·成都模拟） 2020年诺贝尔化学奖授予两位女科学家，以表彰她们对新一代基因编辑技术 CRISPR 的贡献. CRISPR/Cas9技术的实质是用特殊的引导序列(gRNA)将 Cas9酶“基因剪刀”精准定位到所需切割的基因上，然后进行编辑. 回答下列问题：
（1）Cas9酶的功能与 _酶的功能相似. 获得 Cas9酶，可通过基因工程构建基因表达载体，导入到动植物细胞中最终表达出 Cas9酶. 基因工程常用的运载体有 .
（2）引导序列gRNA 能够识别靶基因 DNA 的原因是 _. 研究发现，gRNA 的序列越短，造成编辑对象出错而“脱靶”的概率越大，最可能的原因是 _.
（3）与传统的限制酶切割基因技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术明显优点是 .
答案解析部分
1．【答案】C
【解析】【解答】A、猕猴桃组织细胞有细胞壁保护，因此加蒸馏水搅拌不会破坏细胞，不能将和DNA释放出来，A错误；
B、向猕猴桃果肉研磨液中加入适量的蒸馏水，以降低DNA的溶解度，不是降低DNA酶的活性，B错误；
C、DNA不溶于酒精，因此可用体积分数为95%冷酒精析出DNA，获得较纯净的DNA，C正确；
D、将猕猴桃果肉研磨液迅速加热到100℃会使DNA变性，D错误。
故答案为：C。
【分析】1、植物细胞壁具有维持细胞形态、保护细胞、支撑细胞等功能。
2、蒸馏水不会影响酶的活性，影响酶活性因素有温度、pH等。
3、可以用适宜浓度的盐溶液对DNA进行提取。
4、高温、强酸、强碱等因素可以使DNA变性。
2．【答案】A
【解析】【解答】Sau3AⅠ能识别5'-GATC-3'，也能识别5'-GGATCC-3'，A项正确。限制酶切割后可能形成黏性末端，如BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、Sau3AⅠ；限制酶切割后也可能形成平末端，如HindⅡ、SmaⅠ，B项错误。不同限制酶切割后可形成相同的黏性末端，如BamHⅠ和Sau3AⅠ，C项错误。限制酶的切割位点可能在序列内部，如BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、HindⅡ、SmaⅠ；限制酶的切割位点也可能在序列外部，如Sau3AⅠ，D项错误。
【分析】关于“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）的简介：
1、来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2、限制酶功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
3、结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
3．【答案】C
【解析】【解答】A、探究酶的高效性，利用肝脏研磨液获得过氧化氢酶，A正确；
B、DNA粗提取的原理为不同物质在酒精溶液中溶解性不同，B正确；
C、色素分离原理色素在层析液中的溶解度不同，随着层析液扩散的速度不同，C错误；
D、蛋白质可与双缩脲试剂产生紫色反应，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、酶是活细胞产生的具有生物催化能力的有机物，大多数是蛋白质，少数是RNA；酶的催化具有高效性（酶的催化效率远远高于无机催化剂）、专一性（一种酶只能催化一种或一类化学反应的进行）、需要适宜的温度和pH值（在最适条件下，酶的催化活性是最高的，低温可以抑制酶的活性，随着温度升高，酶的活性可以逐渐恢复，高温、过酸、过碱可以使酶的空间结构发生改变，使酶永久性的失活）。
2、DNA粗提取：（1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大；破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可.如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜.例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液；（2）去除滤液中的杂质：方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同；方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
3、绿叶中色素的提取和分离实验，提取色素时需要加入无水乙醇（溶解色素)、石英砂（使研磨更充分）和碳酸钙（防止色素被破坏）﹔分离色素时采用纸层析法，原理是色素在层析液中的溶解度不同，随着层析液扩散的速度不同，最后的结果是观察到四条色素带，从上到下依次是胡萝卜素（橙黄色）、叶黄素(黄色）)、叶绿素a(蓝绿色)、叶绿素b（黄绿色)。
4、蛋白质可与双缩脲试剂产生紫色反应，实质是蛋白质中的肽键可以与双缩脲试剂发生反应产生紫色的络合物。只要存在肽键就可以与双缩脲试剂发生紫色反应。
4．【答案】D
【解析】【解答】限制酶Ⅰ的识别序列和切点是 ，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是 ，两者产生的黏性末端相同，不能防止目的基因自身环化，A错误；限制酶Ⅱ可以切割两种标记基因，是因为两种标记基因中都含有—GATC—核苷酸序列，限制酶识别切割位点具有特异性，B错误；目的基因只有一端具有GGATCC的片段，只能用限制酶Ⅱ切割。质粒上有两个GATC片段，若用限制酶Ⅱ切割，会将质粒切成两小段，只能用限制酶Ⅰ切割，C错误；用限制酶Ⅰ切割质粒的切割位点在四环素抗性基因内部，所以将目的基因插入到四环素抗性基因内完成构建，D正确。
【分析】限制酶的选择原则：根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因 。
5．【答案】D
【解析】【解答】解：DNA在浓度较高的NaCl溶液中的溶解度很高，但粗提DNA时观察到丝状物偏少，则有可能是使用的NaCl溶液浓度低，加入的蒸馏水过多导致，A选项正确；鳞片叶外表皮的颜色通过细胞中的有色体体现，若观察到的表皮细胞呈无色，则可能是表皮细胞被撕破，导致有色体被破坏观察不到颜色，B选项正确；观察根尖分生区细胞发现染色体着生深浅不一，可能是解离时间偏长，导致后续碱性染色剂染色时受到影响导致染色不均，C选项正确；根尖观察不到质壁分离现象是由于根尖细胞分裂旺盛，没有大液泡，因此观察不到质壁分离现象，D选项错误。故错误的选项选择D。
【分析】紫色洋葱为高等植物，其表皮可作观察叶绿体、质壁分离及其复原的实验材料，其根尖分生区可作为观察细胞有丝分裂的材料。
6．【答案】C
【解析】【解答】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③。综上正确顺序是①④②③，C正确。
故答案为：C。
【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
7．【答案】C
【解析】【解答】A、②③过程分别称为脱分化（由杂交细胞脱分化得到愈伤组织）和再分化（由愈伤组织分化得到胚状体），开辟了植物繁殖的新途径，A正确；
B、E·coliDNA连接酶来自于大肠杆菌，可以连接黏性末端，B正确；
C、①过程为植物体细胞杂交技术中的一个环节，不是完整的植物体细胞杂交技术，且通过是否再生细胞壁也不能鉴定杂种细胞，因为两个相同的原生质体融合也可以再生出细胞壁，C错误；
D、对愈伤组织进行化学或物理的诱变处理，提高了突变的频率，可能可以获得耐盐突变体，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、植物体细胞杂交时先用酶解法去除植物细胞的细胞壁，进行植物原生质体的融合，形成杂种细胞，再通过植物的组织培养将杂种细胞培育成杂种植株。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法。物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成植株，用选择培养基选择目的植株。不同种的植物之间具有生殖隔离，该种方法打破了不同种植物间的生殖隔离，克服了远缘杂交不亲和的障碍。在离体的植物器言、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要的条件：①消毒灭菌；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度； ④充足的养料。
2、DNA连接酶：①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：a、相同点：都缝合磷酸二酯键。b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
8．【答案】A
【解析】【解答】为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，则质粒内每种限制酶只有一个切割位点，①正确；含目的基因DNA内每种限制酶也只有一个切割位点，目的基因内不能有限制酶切割位点，②错误；为防止酶切产物自身环化，则酶切后的两个黏性末端序列不同，③正确、④错误。故答案为：A。
【分析】 1、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）限制酶功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2、“分子缝合针”——DNA连接酶：
(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源T4噬菌体，能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
9．【答案】C
【解析】【解答】根据题意，目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，将含有目的基因的DNA与用EcoRⅠ酶切，会得到含目的基因的DNA片段和不含目的基因的DNA片段；根据质粒的简图可知，将质粒用EcoRⅠ酶切，会得到与质粒周长等长的链状DNA；因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成含目的基因的原DNA片段两个之间进行连接、由含目的基因的DNA片段与质粒周长等长的链状DNA相互连接形成的链状DNA，二倍于原质粒周长的环状DNA三种类型，A错误；DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误；EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割开的质粒两端形成的末端不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向粘连和质粒自身环化，C正确；题图显示，在构建基因表达载体的过程中质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因都不会被破坏，因此能在含青霉素和四环素的培养基中生长的受体细胞不能表明目的基因已成功导入该细胞，D错误。
【分析】1.正确选择限制酶的要点：（1）载体和目的基因都有识别位点和形成相同黏性末端；（2）不能切坏标记基因与目的基因；（3）载体的识别位点应位于启动子和终止子之间。
2.只用一种限制酶切割质粒和目的基因会存在两个缺点：（1）目的基因自己环化；（2）目的基因与质粒反向连接，使基因不能正常表达。
10．【答案】B
【解析】【解答】解：A. 由分析可知，质粒是具有自我复制能力的双链环状的DNA分子，A正确；
B. 拟核DNA是细菌的主要遗传物质,包含控制细菌生命活动的遗传信息,没有了它细菌就无法存活、繁殖；质粒DNA是附加的遗传物质,使细菌表达一些特殊的形状,没有了它细菌依然可以正常生活、繁殖，B错误；
C. 作为载体的质粒上有限制酶的切割位点，这是质粒作为运载体的条件之一，C正确；
D. 作为载体的质粒存在特殊的标记基因，以便对于目的基因进行检测，D正确；
该题需选择错误选项，故答案为B。
【分析】质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物的细胞中，是拟核或细胞核以外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
11．【答案】B
【解析】【解答】A、DNA连接酶是将目的基因的黏性末端与载体的黏性末端之间黏合形成磷酸二酯键，碱基之间的氢键自动形成，A错误；
B、用限制酶从质粒上切下一个目的基因需打开2个切口，破坏四个磷酸二酯键，消耗4个水分子，B正确；
C、Taq酶是PCR仪扩增DNA分子时常用的一种耐高温DNA聚合酶，C错误；
D、在解离根尖分生区细胞时加入盐酸使植物细胞相互分散开，纤维素酶可用于除去细胞壁，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、DNA连接酶的作用：将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
2、限制性内切核酸酶：（1）作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（2）结果：在识别序列的中心轴线两侧切开产生黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开产生平末端。
3、PCR扩增过程：（1）变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。（2）复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。（3）延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
4、解离液为质量分数为15%的盐酸和体积分数为95%的酒精1：1体积比混合，能使组织中的细胞相互分离开。
12．【答案】B
【解析】【解答】A、猪是哺乳动物，其成熟红细胞内没有细胞核，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；
B、植物细胞含有细胞壁，因此选用植物细胞提取DNA时，需先研磨破碎细胞，B正确；
C、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2mol/L的NaCl溶液中溶解度高，C错误；
D、溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热后冷却，颜色应呈现蓝色，D错误。
故答案为：B。
【分析】DNA粗提取和鉴定过程：
1、实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大；
2、破碎细胞，获取含DNA的滤液：动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可.如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜.例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液；
3、去除滤液中的杂质：原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同； 4、DNA的析出与鉴定：（1）将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2~3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA.用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分；（2）取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解.然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂.混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
13．【答案】B
【解析】【解答】A、限制酶--识别并在特定位置切断DNA分子中的磷酸二酯键，A正确；
B、RNA聚合酶--与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录，B错误；
C、DNA连接酶--将分开的DNA片段通过特定末端连接在一起，形成磷酸二酯键，C正确；
D、DNA聚合酶--将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成DNA单链，D正确。
故答案为：B。
【分析】生物工程中酶的作用：1、DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。2、DNA聚合酶：主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。3、限制性核酸内切酶：从DNA链的内部进行切割，分为限制性内切酶和非限制性内切酶。4、DNA修饰酶是指对DNA分子进行修饰的酶，目前基因工程中常用的酶有：碱性磷酸酶、末端转移酶、甲基化酶。5、反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，既可以用DNA为模板，也可以用RNA为模板进行互补链的合成。基因工程中主要功能是利用真核mRNA为模板反转录cDNA，用来建立cDNA文库，进而分离为特定蛋白质编码的基因。
14．【答案】C
【解析】【解答】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，从而形成两个相同的黏性末端。图中四个黏性末端中第一个和第二个相同，由同一种限制酶切割产生，所以图中共有3种不同的黏性末端，由3种限制酶切割形成。 故答案为：C。
【分析】限制性内切核酸酶：（1）作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（2）结果：在识别序列的中心轴线两侧切开产生黏性末端；在识别序列的中心轴线处切开产生平末端。
15．【答案】C
【解析】【解答】由图可知，上端链从左向右读，下端链从右向左读可得，被切割DNA的碱基序列为GAATTC；对比切前与切后的DNA片段可知，DNA片段从G与A之间断开。由图可知，C项的碱基序列与切点均正确。
故答案为：C
【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。不同的限制酶识别不同的核苷酸序列并识别不同的切点，形成的黏性末端或平末端不同。
16．【答案】C
【解析】【解答】如图所示①表示氢键，②③表示磷酸二酯键。 可以打开氢键的酶为解旋酶、可以打开磷酸二酯键的酶为限制酶、可以连接两个DNA片段之间的磷酸二酯键的酶是DNA连接酶。
故答案为：C。
【分析】1.限制酶可以切割磷酸二酯键，使得DNA片段末端形成黏性末端和平末端；
2.DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
17．【答案】B
【解析】【解答】A、橙汁的颜色会干扰沉淀量的判断，A错误；
B、稀释涂布法通过菌落的数量来代表活菌数，通过菌落的形态特征来鉴别其种类，B正确；
C、哺乳动物血液中的成熟红细胞没有细胞核和线粒体，而白细胞数量少，均不适宜做提取DNA的材料；菜花是植物细胞含有大量的DNA，可以作提取DNA的植物材料，但在提取前需先去除细胞壁，C错误；
D、洋葱内表皮细胞不分裂，不会形成染色体，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、鉴定组织中的有机物时，选择实验材料不要对实验现象造成干扰。
2、稀释涂布平板法可以用于鉴定土壤中细菌的种类和数量。
3、哺乳动物成熟红细胞无细胞核，无核DNA。
4、选择观察染色体数目的材料，需要选择可以进行分裂的组织材料。
18．【答案】A
【解析】【解答】A、作为运载体必须具备的条件是之一是在宿主细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制，即能在宿主细胞中稳定保存并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；
B、具有一个至多个限制酶切点，是为了使外源DNA片段（目的基因）插入其中，B错误；
C、标记基因是为了便于重组DNA的鉴定和选择，C错误；
D、它的参与能够使目的基因在宿主细胞中复制并稳定保存，D错误。
故答案为：A。
【分析】“分子运输车”—载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
19．【答案】C
【解析】【解答】A、诱导动物细胞融合可以利用灭火的病毒，A正确；
B、制备单克隆抗体需先给小鼠注射特定抗原（特定病毒）使之发生免疫反应，B正确；
C、将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，C错误；
D、经灭活或者减毒的病毒可以作为疫苗用于免疫预防，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、诱导动物细胞融合的方法有物理法（电激等）、化学法（聚乙二醇PEG）、生物法（灭活的病毒）等。
2、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原（特定病毒）使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。
3、将目的基因导入受体细胞∶（1）将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；（2）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；（3）将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
4、疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗有三种类型：（1）灭活的微生物；（2）分离的微生物成分或其他产物；（3）减毒微生物。使机体产生相应的抗体和记忆细胞（主要是得到记忆细胞），使人在不发病的情况下产生抗体，获得免疫力。
20．【答案】C
【解析】【解答】A、图示Cas9蛋白本质为蛋白质，用以切割DNA，是一种能使磷酸二酯键断裂的酶，A 正确；
B、Cas9蛋白是一种来自细菌的功能类似于限制酶的蛋白质分子，当细菌被噬菌体入侵时，注入细菌的遗传物质DNA会被Cas9蛋白切割，从而阻止噬菌体繁殖，B 正确；
C、图示引导RNA的结构有折叠成双链的片段，因此在引导RNA中存在着A-U、G-C碱基互补配对方式，C 错误；
D、引导RNA用以识别识别特定的 DNA 序列并与之结合，人为改变引导RNA的碱基序列改变Cas9的切割部位，D 正确。
故答案为：C。
【分析】1、切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
2、有些RNA分子的单链存在自身折叠的部分形成双链片段，比如tRNA，部分双链结构存在着A-U、G-C碱基互补配对方式。
21．【答案】C
【解析】【解答】A、通过分析可知，DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以用冷酒精析出上清液中的DNA，A正确；
B、DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，这样可以去除DNA中的某些杂质，提取的DNA可用二苯胺试剂在沸水加热条件下生成蓝色，B正确；
C、限制性酶Ⅰ和限制性酶Ⅱ处理提取的产物，只得到一条带，说明提取物是环状DNA，即提取物为质粒，C错误；
D、用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果，D正确。
故答案为：C。
【分析】DNA的粗提取和鉴定步骤：
1、选取DNA含量相对较高的生物组织
2、破碎细胞，获取含DNA的滤液，加入蒸馏水，利用吸水胀破法使细胞膜破裂，DNA等内容物流出；对于植物，可以用洗涤剂溶解细胞膜，加入一定比例的洗涤剂和食盐；
3、去除滤液的杂质，（1）方案一：利用DNA在不同浓度NaCl中的溶解度不同，而杂质沉淀，去除杂质，DNA充分溶解，得到较纯净的DNA；图2具体操作为：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液的物质的量浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl的物质的量浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去不溶的杂质，再用物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液溶解DNA；（2）方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10~15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶可以水解蛋白质；
4、DNA的析出和鉴定：将处理的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数95%），静置2~3分钟，溶液会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸水分。取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一个试管，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，试管置于沸水中5min，待试管冷却，比较试管溶液颜色变化，看看DNA溶液是否变蓝。
22．【答案】A
【解析】【解答】A、羊的成熟红细胞没有细胞核，因此不可作为提取DNA的材料，A错误；
B、提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，而食盐的作用是提高DNA的溶解度，B正确；
C、预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解，同时根据DNA蛋白质溶于酒精，而DNA不溶于酒精的特性将其析出，C正确；
D、由分析可知，在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色，据此鉴定DNA的存在，D正确。
故答案为：A。
【分析】1.DNA粗提取与鉴定的原理1.DNA的溶解性：（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的；（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离；2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响；3.DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
23．【答案】D
【解析】【解答】A、兔是哺乳动物，其成熟的红细胞中不含细胞核和细胞器，即不含DNA，因此不能用兔血代替鸡血进行实验，A错误；
B、DNA在2mol/L的NaCl溶液中的溶解度大，因此在含有DNA的滤液中加入2mol/L的NaCl溶液，再过滤去除不溶解的杂质，B错误；
C、实验前不需要预先配制好0.14mol/L浓度的NaCl溶液，实验过程中通过加入蒸馏水降低NaCl溶液的浓度，使其浓度达到0.14mol/L，C错误；
D、鉴定时，根据实验的对照原则和单一变量原则，两支试管中都应加入等量的NaCl溶液和二苯胺试剂，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。2、DNA粗提取和鉴定的过程：（1）实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液：（3）去除滤液中的杂质：（4）DNA的析出与鉴定：
24．【答案】B
【解析】【解答】A、琼脂糖凝胶电泳利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离，可用于分离、鉴定DNA分子的混合物，A正确；
B、凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子的大小有关，双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率越小，B错误；
C、凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，用于分离后DNA的检测，C正确；
D、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D正确。
故答案为：B。
【分析】凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，通过的路程短，移动速度快；相对分子质量小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程长，移动速度慢。因此，样品中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量小的分子后流出。
25．【答案】D
【解析】【解答】A、由题意可知，CTAB-核酸复合物能够溶于氯化钠溶液中，后加入乙醇后，由于DNA不溶于乙醇，而CTAB易融于乙醇，因此可将DNA和CTAB分离，A不符合题意；
B、由题意可知，加入氯仿、异丙醇后离心沉淀取上清液，可推断二者可能是能够将蛋白质、多糖进行沉淀，而RNA酶能够水解RNA，最终得到较为纯净的DNA，B不符合题意；
C、由题意可知，加入异丙醇，离心后取沉淀，可推断DNA不溶于异丙醇，加入乙醇后，卷起丝状物，说明，DNA不溶于乙醇，综上，异丙醇和乙醇的作用是将DNA沉淀并分离，C不符合题意；
D、DNA能够和二苯胺在沸水浴中反应呈蓝色，D符合题意。
故答案为：D。
【分析】可利用DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色的原理，对DNA进行鉴定。
可利用还原糖与斐林试剂在50-60℃温水条件下反应出现砖红色沉淀的原理，将斐林试剂用于检测还原糖。
26．【答案】（1）克服了传统转基因技术中目的基因整合的盲目性和随机性（能够定点整合）；限制性核酸内切酶和DNA连接酶
（2）内细胞团；胚胎成纤维细胞
（3）囊胚；细胞核移植；给基因敲除猪导入肌生成抑制蛋白基因（或者直接注射肌生成抑制蛋白），养殖一段时间后观察猪骨骼肌的生长情况
【解析】【解答】（1）由题干可知：基因敲除技术是将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以定点修饰改造染色体上某一基因。 相对传统的转基因技术，后者的整合是随机的，故基因敲除技术的最大优点是克服了传统转基因技术的盲目性和随机性。构建基因表达载体时，需要的工具酶有限制性核酸内切酶（切割目的基因和载体）和DNA连接酶（连接目的基因和载体）。
（2）胚胎干细胞是从着床前胚胎分离出的内细胞团的细胞，具有向各种组织细胞分化的潜能，培养猪胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备一层胚胎成纤维细胞，该类细胞可以分泌一些能够抑制细胞分化的物质，可以促进干细胞的生长，同时抑制干细胞的分化。
（3）筛选出靶细胞，导入猪的囊胚中，再将其植入代孕猪体内，使其发育成嵌合体猪并生产。要快速扩大基因敲除猪的种群，可以采取有性生殖、胚胎分割和细胞核移植、克隆繁殖技术。为证明肌生成抑制蛋白基因敲除猪的表现型改变确实是由于敲除了该基因的缘故，可以通过导入肌生成抑制蛋白基因或者直接注射肌生成抑制蛋白，如果猪表现型转为正常，说明确实是山于敲除了肌生成抑制蛋白基因的缘故。
【分析】1、基因工程的基本工具： （1）限制性内切核酸酶：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 （2）DNA连接酶：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。 （3）载体：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因，能携带外源DNA片段进入受体细胞。
2、胚胎干细胞（ES或EK细胞）： （1）来源：早期胚胎或原始性腺。 （2）特点：形态上，体积小、核大、核仁明显；功能上，具有发育的全能性；体外培养条件下可以增殖而不分化。
27．【答案】（1）发育的全能；基因的选择性表达
（2）血清（或血浆）；95%空气和5%的二氧化碳
（3）获得相同的黏性末端，以使它们能进行碱基互补配对；DNA连接酶；磷酸二酯
（4）探究诱导胚胎干细胞分化的因素，以精确控制胚胎干细胞分化成所需要的细胞
【解析】【解答】（1）胚胎干细胞具有发育的全能性，可以发育成任何一种细胞；向胚胎干细胞培养液中加入一些转录因子，一段时间后镜检发现培养的细胞呈胰岛样细胞的变化属于细胞分化，发生细胞分化的根本原因是基因的选择性表达。
（2）在体外进行培养动物细胞时需要在合成培养基的基础上添加血清（或“血浆”）等天然成分；同时为了维持培养液的pH值，需要提供的气体环境是95%空气和5%的二氧化碳。
（3）科学家用同一种限制酶切割荧光蛋白基因和胚胎干细胞的DNA是为了获得相同的黏性末端，以使它们能进行碱基互补配对；在将“报告”基因“敲入”到胚胎干细胞的DNA上时，还需要用DNA连接酶连接荧光蛋白基因和胚胎干细胞的DNA之间的磷酸二酯键。
（4）本研究在实践应用方面的一个意义是探究诱导胚胎干细胞分化的因素，以精确控制胚胎干细胞分化成所需要的细胞。
【分析】1、动物细胞培养需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。
④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。
2、基因工程的工具：①限制酶，能识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；②DNA连接酶，通过催化磷酸二酯键形成使两个DNA的片段连接起来；③运载体，质粒是最常用的运载体，除此之外，还有噬菌体、动植物病毒。
28．【答案】（1）黏性末端
（2）两者都是DNA，都具有双螺旋结构
（3）拟南芥细胞中产生了MdMYB48基因控制合成的蛋白质（意思合理即可）
（4）植物细胞的全能性
（5）能按照人类意愿定向改变生物的性状、能打破不同物种间的生殖障碍
【解析】【解答】（1）需要用相同的限制酶处理目的基因与运载体，获得相同的黏性末端，这样目的基因与运载体才能通过碱基互补配对结合在一起。
（2）目的基因整合到受体细胞的染色体上，是将目的基因与受体细胞的DNA连接在一起，只有当两者都是DNA，都具有双螺旋结构才能实现。
（3）基因表达是指基因通过转录和翻译合成蛋白质的过程，因此目的基因成功表达的直接证据就是检测到目的基因控制合成的蛋白质。
（4）细胞发育成完整植株利用了（植物）细胞的全能性。
（5）基因工程的优点主要有两点：能按照人类意愿定向改变生物的性状、能打破不同物种间的生殖障碍。
【分析】基因工程的操作程序： （1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。 （3）将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 （4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
29．【答案】（1）EcoR I和Pst I；EcoR I、Pst I、Sma I、EcoR V
（2）磷酸二酯键
（3）自我复制（或自我复制并稳定存在）；一至多个限制酶切割位点；用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
（4）在目的基因的首端，能与RNA聚合酶识别并结合，驱动目的基因转录出mRNA的一段具有特殊序列的DNA片段
【解析】【解答】（1）限制酶EcoR I和Pst I切割形成的是黏性末端，限制酶Sma l和EcoR V切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoR I和Pst I切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E. coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶Sma l和EcoR V切割后的DNA片段(平末端）也可以用T4DNA连接酶连接。
（2）目的基因片段与质粒载体片段均为DNA片段，DNA连接酶将两个DNA片段连接形成的化学键是磷酸二酯键。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
【分析】1、黏性末端和平末端：
被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
分析题图，可知限制酶EcoR I和Pst I切割形成的是黏性末端，限制酶Sma l和EcoR V切割形成的是平末端。
2、DNA分子的连接技术——DNA连接酶
作用：把两条DNA末端之间的缝隙“缝合”起来。
连接部位：磷酸二酯键
特点：只要在同一种限制性内切酶切割的两种DNA片段中加上这种DNA连接酶，它就会把片段缝合得天衣无缝。
3、作为运载体必须具备的条件：①具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。②能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。③具有某些标记基因，便于进行筛选。最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
4、运载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的运载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入运载体的受体细胞，原理如下图所示：
30．【答案】（1）限制性核酸内切；质粒、噬菌体和动植物病毒
（2）gRNA的碱基序列与靶DNA的碱基序列互补配对；碱基序列越短，与其他DNA序列配对的可能性就越大，造成gRNA与目的基因以外的序列结合
（3）可以人为的选择DNA上的目标位点进行切割，目的性更强
【解析】【解答】(1)Cas9酶可用作“基因剪刀”说明其功能与限制性核酸内切酶的功能相似。获得 Cas9酶，可通过基因工程构建基因表达载体，导入到动植物细胞中最终表达出 Cas9酶. 基因工程常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒。
（2）引导序列gRNA 能够识别靶基因 DNA 的原因是gRNA的碱基序列与靶DNA的碱基序列互补配对。gRNA 的序列越短，与其他DNA序列配对的可能性就越大，造成gRNA与目的基因以外的序列结合，从而造成编辑对象出错而“脱靶”的概率越大。
（3）与传统的限制酶切割基因技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术明显优点是可以人为的选择DNA上的目标位点进行切割，目的性更强。
故答案为：（1）限制性核酸内切质粒、噬菌体和动植物病毒 （2）gRNA的碱基序列与靶DNA的碱基序列互补配对 碱基序列越短，与其他DNA序列配对的可能性就越大，造成gRNA与目的基因以外的序列结合 （3）可以人为的选择DNA上的目标位点进行切割，目的性更强 。
【分析】基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有特异性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：
①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体
（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
（3）其它载体： 噬菌体、动植物病毒
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