高中生物人教版（2019）选修3 3.2基因工程的基本操作程序章节综合练习题（（含解析）
文档属性
| 名称 | 高中生物人教版（2019）选修3 3.2基因工程的基本操作程序章节综合练习题（（含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 1.7MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2023-11-13 00:23:00 | ||
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文档简介
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3.2基因工程的基本操作程序
一、单选题
1．（2022高二下·云浮期末）从供体囊胚中分离获得胚胎干细胞，然后利用基因工程技术将某种特定基因导入胚胎干细胞中，经分裂分化得到新的胚胎，植入到一只母鼠体内，最终生出转基因小鼠。下图为基本流程示意图。下列叙述错误的是（ ）
A．过程①选择的囊胚中的细胞只能进行有丝分裂
B．可用Ca2+处理胚胎干细胞，使其处于感受态
C．代孕母鼠需要与供体进行同期发情处理
D．子代小鼠不会表现出代孕母鼠的性状
2．（2020高二下·西安期末）在基因工程中，不能体现生物统一性的是（ ）
A．用不同种类的限制酶切割DNA可获得相同黏性末端
B．构建基因表达载体的结构基础是运载体和目的基因都是双链DNA
C．基因能在异体细胞中表达的基础是各种生物共用一套遗传密码
D．人的胰岛素能在细菌内合成的结构基础是细菌也有核糖体
3．（2023·沈阳模拟）PCR又称聚合酶链式反应，在基因工程中常用它特异性地快速扩增目的基因。下列有关PCR的叙述错误的是（ ）
A．以DNA半保留复制为原理，反应需要在缓冲液中进行
B．耐高温的DNA聚合酶只能从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸
C．反应过程中的每一轮循环依次包括变性、复性、延伸三步
D．常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
4．（2021高二下·咸阳月考）科研人员通过PCR获得肝细胞特异性启动子﹣﹣白蛋白启动子，将该启动子与Cre重组酶基因结合构建表达载体，培育出在肝细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。下列叙述正确的是（ ）
A．将该表达载体导入肝细胞以获得转基因小鼠
B．PCR获得白蛋白启动子需设计特异性的引物
C．构建该表达载体需要内切酶和DNA连接酶
D．通过核酸分子杂交技术检测目的基因是否完成表达
5．（2021高一下·长征期末）检测物种内遗传多样性最简便的方法是（ ）
A．PCR技术 B．测定基因组全序列
C．检测染色体数目 D．检测DNA含量
6．（2021高二上·抚松竞赛）下列有关基因工程的叙述正确的是（ ）
A．大肠杆菌质粒上具有控制质粒DNA转移的基因
B．基因工程基本原理是让目的基因在宿主细胞中稳定存在和高效复制
C．用氯化钙处理植物细胞，可增加细胞壁的通透性
D．将乙肝抗原导入酵母菌可以获得能生产乙肝疫苗的工程菌
7．（2021高二下·金台期中）利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列有关叙述正确的是（ ）
A．过程②需使用逆转录酶
B．过程②利用PCR扩增CarE基因需使用解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．过程③可用NaCl溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
D．过程④可利用DNA分子杂交法鉴定目的基因是否已导入受体细胞
8．某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是（ ）
A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长，而不能在含氯霉素的培养基上生长
9．（2020·和平模拟）Bcl-2基因是细胞凋亡抑制基因，可以利用PCR技术检测其转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。如图为克隆猪的培育及Bcl-2基因转录水平检测流程，下列说法错误的是（ ）
A．图中A细胞表示去核的卵母细胞，B细胞表示体细胞
B．在早期胚胎发育的不同时期提取的总mRNA是不同的
C．图中过程X表示反转录，获得的cDNA可用于克隆猪基因组的测序
D．在PCR过程中，（Bcl-2 cDNA）/cDNA的值反映Bcl-2基因的转录水平
10．转基因抗虫棉在我国的种植面积已占全国棉花种植面积的90%。研究者利用PCR技术检测杂草中有无转基因成分，得到如下图所示结果。相关分析错误的是（ ）
A．空白实验是未加入DNA模板得到的电泳结果
B．推测棉田杂草6、7与抗虫棉的亲缘关系较近
C．结果说明校园杂草与棉花间一定存在生殖隔离
D．转基因成分进入杂草体内可能会引发生态问题
11．（2023·唐山模拟）某一质粒载体如图甲所示，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tett表示四环素抗性基因。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化后得到多种大肠杆菌，并利用培养基乙和丙筛选出导入重组质粒的大肠杆菌。下列叙述错误的是（ ）
A．图甲所示的质粒中还应含有复制原点和终止子等结构
B．将经转化处理后的大肠杆菌菌液接种至培养基乙使用的是稀释涂布平板法
C．配制培养基乙时应加入青霉素
D．培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌
12．（2022高二下·十堰期末）自古以来，新疆就是棉花种植之乡，为获得抗蚜虫棉花新品种，科研人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体（pBⅠ121）结合，然后导入棉花细胞。下列叙述错误的是（ ）
A．限制酶BsaB Ⅰ处理GNA和ACA时，作用于磷酸二酯键
B．pBI121上的启动子是具有特殊核苷酸序列的RNA片段
C．可通过花粉管通道法将构建好的重组载体导入受体细胞
D．可通过采摘抗虫棉的叶片饲喂蚜虫进行个体生物学水平的鉴定
13．（2020·北碚模拟）在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是（ ）
A．引物1与引物2 B．引物3与引物4
C．引物2与引物3 D．引物1与引物4
14．（2022高二下·镇江期末）下列有关基因工程的叙述正确的是（ ）
A．限制酶、DNA连接酶和解旋酶作用的化学键都是两个核苷酸之间的磷酸二酯键
B．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列
C．用氯化钙处理植物细胞，可增加细胞壁的通透性
D．基因工程所需载体有质粒、细菌拟核等，至少要有一个限制酶识别位点
15．（2021高二下·金台期中）拟利用番茄表达人类凝血因子Ⅸ，操作步骤排序正确的是（ ）
①制备工程农杆菌 ②构建基因表达载体
③获取人类凝血因子Ⅸ基因 ④番茄植株中凝血因子Ⅸ基因的检测
⑤用农杆菌转化番茄植株并筛选 ⑥提取凝血因子Ⅸ并检测活性
A．③①②⑤⑥④ B．⑥③①②⑤④
C．④③②①⑤⑥ D．③②①⑤④⑥
16．（2020高二下·南昌期末）下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（ ）
A．不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同
B．PCR反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关
C．在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体
D．质粒上的目的基因都必须整合到受体细胞的DNA上并表达
17．（2023高三下·海淀模拟）科研人员从四川卧龙自然保护区采集到的大熊猫粪便中提取DNA，通过PCR技术扩增DNA来区分不同大熊猫个体，进而统计大熊猫种群密度。下列叙述不正确的是（ ）
A．野生大熊猫种群密度调查不适合用标记重捕法
B．PCR扩增的序列应在大熊猫的不同个体间存在差异
C．大熊猫粪便中的脱落细胞可为PCR提供模板DNA
D．不同粪便样本的PCR扩增结果一定存在明显差异
18．（2021高三上·金华月考）DNA分子杂交技术可以用来比较不同种生物DNA分子的差异。当两种生物的DNA分子有互补的碱基序列时，碱基的互补的区段会形成杂合双链区（如图所示）。下列叙述错误的是（ ）
A．可利用该技术从基因文库中筛选目的基因
B．杂合双链区不一定含有完整的遗传信息单位
C．杂交游离区的形成是因为该区域碱基的序列不同
D．杂合双链区的形成过程中有氢键及磷酸二酯键的生成
19．（2023·广东模拟）T-2毒素是一种常见的霉菌毒素，可通过污染饲料引起畜禽中毒。CYP3A是猪体内降解T-2毒素的关键酶，T-2毒素可诱导其表达水平升高。CCAATbox和GCbox是CYP3A基因启动子的两个调控序列。研究者将不同调控序列分别和CYP3A基因启动子及LUC基因（荧光素酶基因）连接构建表达载体，导入猪肝细胞，在培养基中加入T-2毒素，24h后计算启动子活性相对值，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．④为对照组，把仅含LUC基因的表达载体导入细胞
B．与④组相比，①组中加入T-2毒素的含量大大增加
C．可通过检测荧光素酶的活性来计算启动子活性相对值
D．调控序列的缺失使T-2毒素不能诱导CYP3A基因表达
20．（2020高二下·南京期中）下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（ ）
A．表达载体应含有目的基因、启动子、终止子和标记基因等结构
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点
C．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
D．表达载体中的胰岛素基因可以通过人肝细胞mRNA反转录获得
21．（2023高二下·湖南期中）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善番茄品质。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。下列叙述正确的是（ ）
A．可使用XbaⅠ和HindⅢ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒
B．可使用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒
C．启动子能被DNA聚合酶识别，启动转录
D．重组质粒成功导入受体细胞后，受体细胞能合成卡那霉素
22．（2020高二下·西安期末）科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，Ti质粒如图所示。下列叙述，正确的是（ ）
A．农杆菌的拟核DNA与番木瓜基因发生重组
B．构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶
C．含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性
D．转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性
23．（2023高二下·肇庆期末）八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crlI表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，其编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crlI基因转人水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为"黄金大米"。下列叙述错误的是（ ）
A．构建基因表达载体时使用的工具酶有限制酶、DNA连接酶
B．科研人员可用两种不同引物进行PCR以扩增psy基因
C．黄金大米培育过程中构建基因表达载体时可用pmi基因作为标记基因
D．用Ca2+处理水稻细胞使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，再将重组基因导入
24．（2023·重庆模拟）图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图，其中引物1～4在含有目的基因的DNA上的结合位置如图甲所示，限制酶BamHI、EcoRI、HindⅢ在质粒上的识别位点如图乙所示。下列说法正确的是（ ）
A．过程①中应使用限制酶HimdⅢ切割质粒
B．应选择引物2和3扩增目的基因
C．过程②可用Ca2+处理来促进大肠杆菌的转化
D．若将该基因片段扩增6次，则消耗128个引物分子
25．（2023高三下·石家庄开学考）新冠病毒包膜表面的S蛋白能识别人体细胞膜表面的ACE2受体并导致病毒入侵人体细胞。制备重组亚单位新冠疫苗的线路是：提取新冠病毒RNA→通过RT-PCR（反转录酶聚合酶链式反应）技术扩增筛选RBD蛋白（S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分）基因（图1）→构建基因表达载体（图2）→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。图3为利用电泳技术对PCR的产物进行纯度鉴定，1号泳道为标准（Marker），2号泳道为阳性对照组，3号泳道为实验组。下列相关叙述错误的是（ ）
A．利用RT-PCR技术获取RBD蛋白基因时，需加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶
B．利用PCR扩增含有限制酶切点的RBD蛋白基因时，应选择的引物为引物4、引物5
C．2号泳道是以（提纯的）RBD蛋白基因片段为材料所做的阳性对照组
D．为提高目的基因和运载体的正确连接效率，应选择限制酶EcoRI切割
二、实验探究题
26．科学家通过基因工程技术，成功利用Bt毒蛋白基因和非转基因棉A植株培育出抗虫转基因棉B植株，回答下列问题：
（1）利用基因工程获得抗虫转基因棉B植株的操作程序主要包括 个步骤，其中核心步骤是 ：
（2）一个完整的基因表达载体应该包括复制原点、启动子、终止子、 (答出2点即可)等，其中启动子是指 。
（3）研究人员发明了一种新的基因转化法——农杆菌介导喷花转基因法，即将农杆菌悬浮液用微型喷壶均匀喷洒于棉花柱头和花药等器官上，该方法集合了 两种转化法的优点，可用 技术确认Bt毒蛋白基因是否插入到了转基因植物的染色体DNA上。
（4）通过对Bt毒蛋白三维结构图及氨基酸序列进行分析，发现若将该蛋白质结构中一段由14个氨基酸组成的螺旋结构缺失，结构变化后的Bt蛋白质能使棉铃虫具有更高的致死率。若要根据蛋白质工程的原理设计实验对Bt蛋白进行改造，以提高其致死率，实验设计思路是 。
27．（2023高二下·兖州期中）玉米是重要的粮食作物，其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白，由P基因编码，在植物生长发育过程中对水分的吸收具有重要的调节功能。科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米，回答下列问题。
（1）利用PCR技术以图1中的DNA片段为模板扩增P基因，需要的引物有____________（从A、B、C、D四种单链DNA片段中选择）。
A．A B．B C．C D．D
（2）科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米，在P基因表达过程中转录所需的原料是 。
（3）研究人员利用PCR技术获得了P基因，有关该过程的叙述正确的是______
A．需要了解P基因的全部碱基序列
B．新链的合成只能从3'→5'
C．反应体系加入的酶需要具有热稳定性
D．G/C含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高
（4）培育超量表达P蛋白的转基因玉米过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图2所示（Ti质粒上的T-DNA可转移到被侵染的细胞，并整合到该细胞的染色体DNA上）。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用 酶组合，理由是 ；不选用图中其它限制酶的原因是 。
（5）图2中强启动子是 的结合位点，可驱动基因的表达。将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入 （填“潮霉素”“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”）进行筛选。
（6）P蛋白在玉米株系的表达量如图3所示，可作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究实验材料的有 。
三、综合题
28．（2021高三下·吉林月考）甜味蛋白 Brazzein 是从一种西非热带植物的果实中分离得到的一种相对分子质量较小的蛋白质，它含有54
个氨基酸，是目前最好的糖类替代品。迄今为止，已发现 Brazzein基因在数种细菌、真菌和高等植物、动物细胞中都能表达。回答下列问题:
（1）从基因文库中提取Brazzein
基因时，根据 Brazzein 基因的核苷酸序列 、 、 ，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取 。
（2）基因工程的核心步骤是 。将Brazzein
基因导入细菌、真菌和高等植物细胞时都可使用的常用载体是 。
（3）若受体细胞是大肠杆菌，首先用 处理细胞，使其成为感受态细胞。Brazzein基因在大肠杆菌细胞内表达时， 表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用 的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加 的抑制剂。
29．（2020·临汾模拟）科学家采用转基因体细胞克隆技术获得转基因绵羊，以通过乳腺生物反应器生产人 —抗胰蛋白酶，其技术路线如图：
回答下列问题：
（1）基因表达载体应当包括 ，构建基因表达载体常用的酶是 ，常用载体有 。
（2）核移植的受体应选用 期卵母细胞，之后通过 （写出一种具体方法）激活受体细胞使其完成细胞分裂和发育进程。
（3）进行胚胎移植时，胚胎应发育到 阶段，移植的方法有 。为一次性获得多个体，可使用胚胎分割技术，在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要注意 。
30．（2022·天津）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
（1）如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
（2）PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含 （EcoRⅠ∕HindⅢ∕XhoⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
（3）将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
（4）用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感 D．卡那霉素和链霉素都不敏感
（5）可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
答案解析部分
1．【答案】B
【解析】【解答】A、囊胚包括滋养层细胞和内细胞团细胞，其中内细胞团细胞属于胚胎干细胞，过程①选择的囊胚中的细胞只进行有丝分裂，A不符合题意；
B、对于目的基因的导入，动物细胞一般采用显微注射法，用Ca2+处理是针对细菌的处理方法，B符合题意；
C、过程④表示胚胎移植，进行胚胎移植时，要求受体和供体处于相同的生理状态，所以要对代孕母鼠进行同期发情处理，以免发生排斥反应，C不符合题意；
D、子代小鼠的遗传物质不是来自代孕母鼠，所以不会表现出代孕母鼠的性状，D不符合题意。
故答案为：B
【分析】1、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
2、胚胎移植的主要过程：
（1）对供、受体的选择和处理：①选择：遗传性能和生产性能优秀的供体、有健康的体质和正常繁殖能力的受体；②处理：同期发情处理和对供体母畜进行超数排卵处理。
（2）配种或进行人工授精。
（3）对胚胎的收集、检查、处理：①收集：冲卵；②检查：对胚胎进行质量检查，这时胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段；③处理：直接向受体移植或放人-196℃的液氮中保存。
（4）胚胎移植——方法：手术法和非手术法。
（5）胚胎移植后的检查——检查受体是否妊娠。
2．【答案】A
【解析】【解答】A、获得相同黏性末端用不同种类的限制酶切割DNA，不能体现统一性，A错误；
B、构建基因表达载体的结构基础是运载体和目的基因都是双链DNA，体现了统一性，B正确；
C、基因能在异体细胞中表达的基础是各种生物共用一套遗传密码，体现了生物的统一性，C正确；
D、人的胰岛素能在细菌内合成的结构基础是细菌也有核糖体，体现了细胞结构的统一性，D正确。
故答案为：A。
【分析】1、DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
DNA连接酶：两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，形成重组DNA。
常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。2、基因工程的原理为基因重组。
3．【答案】B
【解析】【解答】A、PCR是体外进行DNA复制，以半保留复制为原理，为了维持反应的稳定，反应需要在缓冲液中进行，A正确；
B、耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，B错误；
C、反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三步，C正确；
D、常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，D正确。
故答案为：B。
【分析】PCR技术的过程：
①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；
②低温复性：引物结合到互补链DNA上；
③中温延伸：合成子链。
4．【答案】B
【解析】【解答】A、动物细胞的受体通常是受精卵，故需要将该表达载体导入受精卵以获得转基因小鼠，A错误；
B、PCR技术的条件之一是需设计特异性的一对引物，B正确；
C、构建该表达载体需要限制酶（切割目的基因和运载体）和DNA连接酶，C错误；
D、基因的表达通常包括转录和翻译，表达的产物通常是蛋白质，故检测目的基因是否完成表达常用抗原抗体杂交技术，D错误。
故答案为：B。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法（主要用于双子叶植物和裸子植物）、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
5．【答案】A
【解析】【解答】A、PCR技术就是体外大量扩增DNA的技术，即以少量DNA制备大量DNA的技术，其原理是DNA复制；通过运用PCR技术可以针对性地检测遗传多样性，A正确；
B、对于每个个体而言其DNA中都有各自特定的碱基序列，要进行遗传多样性检测只需要对一些特定基因或序列进行比对即可，而不需要对基因组全序列测定，B错误；
C、同一物种的不同个体细胞内的染色体数一般相同，C错误；
D、遗传多样性也称基因多样性，主要是指基因的种类不同，所以检测DNA的含量不能反应遗传多样性，D错误。
故答案为：A。
【分析】1、生物多样性包括3个层次：遗传多样性（所有生物拥有的全部基因）、物种多样性（指生物圈内所有的动物、植物、微生物）、生态系统多样性。
2、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
6．【答案】A
【解析】【解答】A、质粒通常具有控制质粒DNA转移的基因，即T_DNA（可转移DNA），A正确；
B、基因工程的基本原理是基因重组，B错误；
C、用氯化钙处理微生物细胞，可增加细胞壁的通透性，C错误；
D、将控制乙肝抗原表达的基因导入酵母菌可以获得能生产乙肝疫苗的工程菌，D错误。
故答案为：A。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
7．【答案】D
【解析】【解答】A、过程①表示反转录，需要反转录酶的催化，A错误；
B、过程②表示目的基因的获取，在利用PCR技术对获取的目的基因进行扩增的过程中，不需要使用解旋酶，解旋是通过高温解链实现的，B错误；
C、过程③表示将目的基因导入受体细胞，若受体细胞为大肠杆菌细胞，则需要用CaCl2溶液处理，使之成为感受态细胞，C错误；
D、过程④可利用DNA分子杂交技术，鉴定目的基因是否已导入受体细胞，D正确。
故答案为：D。
【分析】图中过程①表示利用mRNA通过反转录法合成相应的DNA；过程②表示目的基因的获取；过程③表示将目的基因导入受体细胞；过程④表示通过筛选获得工程菌。
8．【答案】C
【解析】【解答】质粒中含有限制酶HindⅢ和PstⅠ的切割位点，且各含一个，因此用这两种限制酶切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；由图乙可知，限制酶AluⅠ的切割位点位于目的基因上，因此不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA，否则会破坏目的基因，B正确；用SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒会导致两个抗性基因均被破坏，无法筛选导入重组DNA的细菌，因此构建重组DNA时，不能选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，C错误；构建基因表达载体时，应该选择HindⅢ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，这样会破坏氯霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长，而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。 故答案为：C。
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
9．【答案】C
【解析】【解答】据图分析，图中A细胞表示去核的卵母细胞，B细胞表示良种猪的体细胞，为重组细胞提供细胞核，A正确；
基因是选择性表达的，所以在早期胚胎发育的不同时期提取的总mRNA是不同的，B正确；
图中过程X表示逆转录，获得的cDNA不含非编码序列，所以不可用于克隆猪基因组的测序，C错误；
在PCR过程中可检测出cDNA中Bcl-2 cDNA的分子数，进而计算总mRNA中Bcl-2 mRNA的分子数，从而反映出Bcl-2基因的转录水平，D正确。
【分析】图示表示克隆猪的培育及该基因转录水平检测流程，图中涉及动物体细胞核移植技术、动物细胞培养技术、胚胎移植及PCR技术，其中A细胞表示去核的卵母细胞，B细胞表示良种猪的体细胞，为重组细胞提供细胞核；mRNA→cDNA的X过程为逆转录过程。据此答题。
10．【答案】C
【解析】【解答】A、空白试验应该是DNA标准样液（Marker），未加入DNA模板得到的电泳结果，作为空白对照，A正确；
B、根据杂草6和7含有转基因成分可以推测，杂草6和7可能与抗虫棉的亲缘关系较近，获得了转基因特性，B正确；
C、根据6和7含有转基因成分可知，杂草可能与棉花的亲缘关系较近，不能说明两者是否存在生殖隔离，C错误；
D、转基因成分进入杂草内，可能导致杂草获得转基因特性，可能会引发生态问题，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、DNA分子杂交技术可以用来比较不同种生物DNA分子的差异。当两种生物的DNA分子的单链具有互补的碱基序列时，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补的碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链，形成泡状结构。形成杂合双链区的部位越多，说明这两种生物的亲缘关系越近。
11．【答案】D
【解析】【解答】A、质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有具有标记基因、具有一个或多个限制酶切点、能在受体细胞中复制（复制原点），若是同时作为表达载体，还需要具有启动子和终止子等结构，A正确；
B、稀释涂布平板法可以用于微生物的分离计数，题中培养基乙后需要影印接种，可以使用稀释涂布平板法接种转化处理后的大肠杆菌的菌液，B正确；
C、配制培养基乙时应加入青霉素，使转化环状目的基因的大肠杆菌筛选掉，C正确；
D、培养基乙中生长的菌落为转化质粒载体或者含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌；培养基丙中生长的菌落为导入质粒载体的大肠杆菌，故不能在培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌，D错误。
故答案为：D。
【分析】1、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
2、 微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
12．【答案】B
【解析】【解答】A、限制酶BsaB Ⅰ处理GNA和ACA时，能够识别GNA和ACA的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，A正确；
B、启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列，它含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，即pBI121上的启动子是具有特殊核苷酸序列的DNA片段，B错误；
C、将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，因此可通过花粉管通道法将构建好的重组载体导入受体细胞，C正确；
D、个体水平上的鉴定有抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等，因此可通过采摘抗虫棉的叶片饲喂蚜虫进行个体生物学水平的鉴定，D正确。
故答案为：B。
【分析】基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
13．【答案】C
【解析】【解答】要获得B链，则要获得引物之间的DNA片段，根据PCR中子链延伸方向为5，到3，，故需选择引物2与引物3进行扩增，选C。
【分析】本题考查PCR的相关知识。PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。PCR的原理是DNA复制，需要的条件包括：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。PCR扩增DNA的过程包括：高温变性、低温复性、中温延伸过程。
14．【答案】B
【解析】【解答】A、限制酶、DNA连接酶作用的化学键都相同，都是DNA一条链中相邻两个核苷酸之间的磷酸二酯键，而解旋酶的作用部位是氢键，A错误；
B、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割，B正确；
C、植物的细胞壁主要成分是纤维素和果胶，氯化钙对其无效，用氯化钙处理的细胞，应该是类似于大肠杆菌一类的细胞，其细胞壁主要是肽聚糖，氯化钙可以增加它的通透性，C错误；
D、基因工程所需载体有质粒、动植物病毒和噬菌体等，细菌拟核不能作为载体，载体需有一个或多个限制酶识别位点，以便连接不同的目的基因，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、基因工程的基本工具：
（1）限制性内切核酸酶：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
（2）DNA连接酶：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。
（3）载体：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因，能携带外源DNA片段进入受体细胞。
2、基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
15．【答案】D
【解析】【解答】利用番茄表达人凝血因子属于基因工程的技术范畴。基因工程的基本步骤：获取目的基因，构架表达载体，受体细胞的转化，目的基因的表达及检测。对植物细胞进行转化通常用农杆菌转化法。综合可知正确的排序应为：③②①⑤④⑥，D正确。
故答案为：D。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
16．【答案】C
【解析】【解答】A、限制酶具有专一性，不同的限制酶切割形成的黏性末端也可能相同，也可能不同，A错误；
B、PCR反应中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的，与扩增的目的基因和引物有关，B错误；
C、在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体，这样获得基因表达载体的概率更高，C正确；
D、质粒本身也是DNA，也能自我复制，所以进入受体细胞以后，既可以自己进行表达，也可以整合到体细胞的DNA 并表达，D错误。
故答案为：C。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
17．【答案】D
【解析】【解答】A、题意显示，野生大熊猫数量较少，且其体型较大，调查分布范围小、数量少、个体较大的种群的密度时，可采用逐个计数法，不适合用标记重捕法，A正确；
B、由于DNA分子具有特异性，因而可推测，PCR扩增的序列应在大熊猫的不同个体间存在差异，B正确；
C、大熊猫粪便中的脱落细胞可为PCR提供模板DNA，进而可通过PCR技术扩增DNA来区分不同大熊猫个体，据此统计大熊猫种群密度，C正确；
D、由于大熊猫个体数量过少，即遗传多样性较低，因此，不同粪便样本的PCR扩增结果未必一定存在明显差异，D错误。
故答案为：D。
【分析】1、种群密度的调查方法： （1）逐个计数法：分布范围小，个体较大的生物。 （2）黑灯诱捕法：趋光性昆虫。 （3）样方法：多数植物和活动范围小活动能力弱的动物。 （4）标志重捕法：活动范围大活动能力强的动物。
2、PCR扩增过程： （1）变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。 （2）复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
18．【答案】D
【解析】【解答】A、基因文库包括基因组文库和部分基因文库。其中基因组文库包含某种生物所有的基因，而部分基因文库只包含某种生物的部分基因，可利用DNA分子杂交技术从基因文库中筛选目的基因，A正确；
B、DNA分子杂交技术是当两种生物的DNA分子的单链具有互补的碱基序列时，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补的碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链，所以杂合双链区不一定含有完整的遗传信息单位，B正确；
C、DNA分子杂交技术是当两种生物的DNA分子的单链具有互补的碱基序列时，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补的碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链，C正确；
D、双链区是通过碱基对中的氢键形成的，D错误。
故答案为：D。
【分析】DNA分子杂交技术可以用来比较不同种生物DNA分子的差异。当两种生物的DNA分子的单链具有互补的碱基序列时，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补的碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链，形成泡状结构。形成杂合双链区的部位越多，说明这两种生物的亲缘关系越近。
19．【答案】C
【解析】【解答】A、④为对照组，把含CYP3A基因启动子及LUC基因的表达载体导入细胞，A错误；
B、T-2毒素是无关变量，每组加入含量要相同，因此与④组相比，①组中加入T-2毒素的含量相同，B错误；
C、实验的因变量是荧光素酶的活性，可通过检测荧光素酶的活性来计算启动子活性相对值，荧光素酶的活性越大，启动子活性相对值就越大，C正确；
D、由图可知，②③④这三组的启动子活性相对值都大于0，说明调控序列的缺失使T-2毒素可以诱导CYP3A基因表达，D错误。
故答案为：C。
【分析】1、生物实验应遵循的原则：（1）单一变量原则，（2）对照原则，（3）可重复原则，（4）科学性原则。
2、自变量与因变量：自变量是实验中由实验者操纵的因素或条件，而因变量是指由实验变量而引起的变化结果，二者之间是前因后果的关系。
3、分析题图可知，实验的自变量为是否含有CCAAT box和GC box，因变量是荧光素酶的活性。
20．【答案】A
【解析】【解答】A、表达载体应含有目的基因、启动子、终止子和标记基因等结构，A正确；
B、基因的表达均启动于启动子，复制启动于复制原点，B错误；
C、终止密码子位于mRNA上，终止翻译过程，C错误；
D、由于基因的选择性表达，在人的肝细胞中，没有胰岛素基因转录的mRNA，D错误。
故答案为：A。
【分析】基因表达载体的构建：1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2、组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质；（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端；（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，常用的标记基因是抗生素抗性基因。
21．【答案】A
【解析】【解答】A、目的基因内有BamHⅠ识别序列，因此不能选择BamHⅠ切割目的基因，因此目的基因左侧应选择限制酶XbaⅠ切割，由目的基因的转录方向可以推测，目的基因右侧应选择靠近终止子的限制酶HindⅢ，而不能选择靠近启动子的EcoRⅠ，因此需要用XbaⅠ和HindⅢ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒，A正确；
B、若用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因，则目的基因与质粒会发生反向连接，不能正常按转录方向转录，B错误；
C、启动子能被RNA聚合酶识别，启动转录，C错误；
D、重组质粒中含有的是卡那霉素抗性基因，不是卡那霉素合成基因，不能合成卡那霉素，D错误。
故答案为：A。
【分析】1、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。其中目的基因的获取需要限制酶，基因表达载体的构建需要限制酶和DNA连接酶。
22．【答案】D
【解析】【解答】A、农杆菌的拟核DNA不会与番木瓜基因发生重组，和番木瓜基因发生重组的是其质粒上的基因，A错误；
B、构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；
C、含重组Ti质粒的农杆菌具有卡那霉素抗性，而不具有四环素抗性，C错误；
D、因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T-DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病番木瓜不含有卡那霉素抗性基因，故不具有卡那霉素抗性，D正确。
故答案为：D。
【分析】农杆菌转化法：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的 Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进人植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
23．【答案】D
【解析】【解答】A、构建基因表达载体常用的工具酶有限制酶（基因“剪刀”）与DNA连接酶（缝合的“针线”），A正确；
B、PCR扩增目的基因psy时，需要2种引物分别与两条模板链结合，B正确；
C、pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，其编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长，故黄金大米培育过程中构建基因表达载体时可用pmi基因作为标记基因，C正确；
D、Ca2+处理可改变细菌细胞膜的通透性，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，但Ca2+只能处理原核细胞，不能处理真核细胞，D错误。
故答案为：D。
【分析】常用的转化方法：
①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法（是双子叶植物中常用方法，因为它易感染双子叶植物，其Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞上。），其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。方法的受体细胞多是受精卵。
③将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
24．【答案】C
【解析】【解答】A、①是基因表达载体的构建过程；若使用EcoRⅠ切割质粒会将目的基因掐入启动子上游，目的基因不能正确表达；使用HamdⅢ切割质粒将破坏标记基因，不利于目的基因的鉴定和筛选，因此该过程中应使用限制酶 BamHⅠ切割质粒，A错误；
B、由于DNA聚合酶只能从5′→3′延伸子链，因此扩增目的基因时应选择引物1和4，B错误；
C、将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法，所以过程②可用Ca2+处理来促进大肠杆菌的转化，C正确；
D、PCR 技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n+1-2，因此PCR过程完成6轮循环，理论上至少需加入引物26+1-2=126个，D错误。
故答案为：C。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、分析题图：图中甲为目的基因，乙为载体，①表示构建基因表达载体，②是将目的基因导入受体细胞。
25．【答案】D
【解析】【解答】A、RT-PCR技术是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入逆转录酶、Taq酶，A正确；
B、引物与模板链的3'端碱基互补配对，故引物1、引物2、引物7和引物8不合适，扩增得到的RBD蛋白基因也应该含有限制酶的酶切位点，故引物3和引物6不合适，故答案为：引物4和引物5，B正确；
C、PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准（Marker），2号泳道是以RBD蛋白基因片段为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组，C正确；
D、质粒上没有SmaⅠ酶切位点，且若使用EcoRⅠ酶切，易造成目的基因和质粒自身环化，故应该选择BamHⅠ和HindⅢ，D错误。
故答案为：D。
【分析】PCR扩增过程： （1）变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。 （2）复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
26．【答案】（1）四；构建基因表达载体
（2）目的基因（Bt毒蛋白基因）和标记基因；位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
（3）农杆菌转化法和花粉管通道法；DNA分子杂交
（4）参照密码子表，找到控制该14个氨基酸的碱基对序列所在的基因位置，将这些碱基对序列进行缺失处理
【解析】【解答】(1)获取抗虫转基因棉B植株需要采用基因工程技术，该技术主要包括四个步骤，核心步骤是基因表达载体的构建。
(2)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；启动子是位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程。
(3)农杆菌介导喷花转基因法是指将农杆菌悬浮液用微型喷壶均匀喷洒于棉花柱头和花药等器官上，该方法集合了农杆菌转化法和花粉管通道法两种转化法的优点。检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因常用的方法为DNA分子杂交技术。
(4)蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。再根据题干信息“将该蛋白质结构中一段由14个氨基酸组成的螺旋结构缺失，结构变化后的Bt蛋白质能使棉铃虫具有更高的致死率”可知，要根据蛋白质工程的原理对Bt蛋白进行改造，以提高其致死率，可参照密码子表，找到控制该14个氨基酸的碱基对序列所在的基因位置，将这些碱基对序列进行缺失处理。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
27．【答案】（1）B；C
（2）4种核糖核苷酸
（3）C；D
（4）BamHI和Sacl；能将P基因和强启动子完整切割，且在与Ti质粒连接的过程中可避免自身环化等问题；EcoRI和NotI会破坏P基因，HindIII会将强启动子和P基因分离
（5）RNA聚合酶；潮霉素
（6）a1、a2、a3
【解析】【解答】（1）因为DNA子链是从引物的3'端开始延伸，由图可知，需要用B、C两个引物。
故填：B C。
（2）P基因转录形成RNA，而RNA的基本组成单位是核糖核苷酸，因此所需原料是4种核糖核苷酸。
故填：4种核糖核苷酸。
（3）PCR技术扩增目的基因，只需要知道目的基因两侧部分的碱基序列用来设计引物，A不符合题意；DNA新链的合成只能从5'→3'，B不符合题意；在PCR过程中，是在较高温度的条件下进行，因此反应体系中加入的DNA聚合酶需要具有热稳定性，C符合题意；引物有可能会与模板链非特异性结合，因此若使用G/C含量高的引物，需要提高复性温度，降低非特异性扩增的概率，D符合题意。
故填：C D。
（4）若要使P基因在玉米植株中超量表达，则要保证重组质粒上P基因左侧含有启动子，右侧含有终止子，在选择限制酶时，要保证该限制酶酶切位点在T-DNA上，并且不会破坏启动子和P基因、终止子、潮霉素抗性基因等，此外，最好选择两种限制酶，能够防止目的基因或质粒自身环化，由此可推知，应选择BamHI和Sacl。
故填：BamHI和Sacl；能将P基因和强启动子完整切割，且在与Ti质粒连接的过程中可避免自身环化等问题；EcoRI和NotI会破坏P基因，HindIII会将强启动子和P基因分离。
（5）图中强启动子是转录的起始位点，即RNA聚合酶的结合位点，可驱动基因的表达，由图可知，T-DNA上含有潮霉素抗性基因，若愈伤组织转化成功，则应当表现为抗潮霉素性状，因此培养基中需加入潮霉素进行筛选。
故填：RNA聚合酶；潮霉素。
（6）由图可知，a1、a2、a3的P蛋白相对表达量显著高于其他两组，因此应选择a1、a2、a3来作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究实验材料。
故填：a1、a2、a3。
【分析】1、PCR的每一次循环都包括变性、复性和延伸三个步骤，其中变性就是指在高温条件下是DNA双螺旋结构打开，有利于DNA的复制，复性的目的是使引物能够结合在模板DNA上，而延伸是利用耐高温的DNA聚合酶从引物的3'末端开始对子链进行延伸。
2、基因工程的基本工具及作用
①限制酶：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，使一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有一定的专一性；在选择限制酶时，要保证该限制酶不会切割目的基因和载体上的标记基因、启动子、终止子和复制原点等，并且限制酶酶切位点应介于载体的启动子与终止子之间，最好选用两种能够产生不同黏性末端的限制酶分别对目的基因和载体的两侧进行切割，避免目的基因或载体自身环化；
②DNA连接酶：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键；
③载体：能运载目的基因进入受体细胞，并使目的基因能在受体细胞中稳定存在并表达。
作为载体应具备的条件：能稳定存在并自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因以及对受体细胞无害。
28．【答案】（1）基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA
（2）基因表达载体的构建；质粒
（3）Ca2+；蛋白酶缺陷型；蛋白酶
【解析】【解答】（1）要从基因文库中得到我们需要的目的基因，需根据目的基因的有关信息。例如，从基因文库中提取Brazzein
基因时，根据 Brazzein 基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因翻译产物蛋白质等特性来获取。
（2）基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心步骤。将目的基因导入受体细胞时常用的载体是质粒，在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等，其中，将Brazzein
基因导入细菌、真菌和高等植物细胞时都可使用的载体是质粒。
（3）若受体细胞是大肠杆菌，首先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞。Brazzein基因在大肠杆菌细胞内 表达出的蛋白质可能会（在蛋白酶催化下）被降解。因此在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，以避免Brazzein基因在大肠杆菌细胞内表达出的蛋白质被降解，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂以提高蛋白质的含量。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
29．【答案】（1）启动子、终止子、目的基因；限制性核酸内切酶、DNA连接酶；质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒
（2）MⅡ；电脉冲、钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂
（3）桑椹胚或囊胚；手术法和非手术法；将内细胞团均等分割
【解析】【解答】（1）基因表达载体的组成包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因等；构建基因表达载体常用的工具酶是限制酶和DNA连接酶；常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。（2）动物细胞的核移植到一个去核的MII卵母细胞中；核移植的过程中，用物理或化学方法（如电脉冲、钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等）激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程。（3）进行胚胎移植时，胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段，移植的方法有手术法和非手术法。为一次性获得多个体，可使用胚胎分割技术，在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
【分析】（1）基因表达载体的构建（基因工程的核心）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点；启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质；标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来；（2）动物核移植是将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。原理：动物细胞核具有全能性；（3）胚胎移植是指将雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。（4）分析题图可知：转基因绵羊涉及的技术手段有转基因技术、核移植、胚胎移植，据此答题。
30．【答案】（1）1；4；5'
（2）XhoⅠ
（3）卡那霉素
（4）B
（5）PCR
【解析】【解答】（1）根据引物箭头方向可知，去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1和4。在进行PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物 3＇端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5＇端到 3＇端延伸的，所以在引物的5＇端引入XhoI酶识别序列。
故填：1；4；5＇。
（2）由图可知，载体4中RpSL（链霉素敏感基因）的两侧具有XhoI酶识别序列，载体3中不含XhoI酶识别序列，所以引物应包含XhoⅠ酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
故填：XhoⅠ。
（3）将改进的P1基因整合到载体4构建载体5，载体5中含有RpSL（链霉素敏感基因）和KanR（卡那霉素抗性基因），将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。
故填：卡那霉素。
（4）P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失，该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B正确，ACD错误。
故填：B。
（5）通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中，所以可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
故填：PCR。
【分析】1、目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
3、将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
4、目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
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3.2基因工程的基本操作程序
一、单选题
1．（2022高二下·云浮期末）从供体囊胚中分离获得胚胎干细胞，然后利用基因工程技术将某种特定基因导入胚胎干细胞中，经分裂分化得到新的胚胎，植入到一只母鼠体内，最终生出转基因小鼠。下图为基本流程示意图。下列叙述错误的是（ ）
A．过程①选择的囊胚中的细胞只能进行有丝分裂
B．可用Ca2+处理胚胎干细胞，使其处于感受态
C．代孕母鼠需要与供体进行同期发情处理
D．子代小鼠不会表现出代孕母鼠的性状
2．（2020高二下·西安期末）在基因工程中，不能体现生物统一性的是（ ）
A．用不同种类的限制酶切割DNA可获得相同黏性末端
B．构建基因表达载体的结构基础是运载体和目的基因都是双链DNA
C．基因能在异体细胞中表达的基础是各种生物共用一套遗传密码
D．人的胰岛素能在细菌内合成的结构基础是细菌也有核糖体
3．（2023·沈阳模拟）PCR又称聚合酶链式反应，在基因工程中常用它特异性地快速扩增目的基因。下列有关PCR的叙述错误的是（ ）
A．以DNA半保留复制为原理，反应需要在缓冲液中进行
B．耐高温的DNA聚合酶只能从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸
C．反应过程中的每一轮循环依次包括变性、复性、延伸三步
D．常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
4．（2021高二下·咸阳月考）科研人员通过PCR获得肝细胞特异性启动子﹣﹣白蛋白启动子，将该启动子与Cre重组酶基因结合构建表达载体，培育出在肝细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。下列叙述正确的是（ ）
A．将该表达载体导入肝细胞以获得转基因小鼠
B．PCR获得白蛋白启动子需设计特异性的引物
C．构建该表达载体需要内切酶和DNA连接酶
D．通过核酸分子杂交技术检测目的基因是否完成表达
5．（2021高一下·长征期末）检测物种内遗传多样性最简便的方法是（ ）
A．PCR技术 B．测定基因组全序列
C．检测染色体数目 D．检测DNA含量
6．（2021高二上·抚松竞赛）下列有关基因工程的叙述正确的是（ ）
A．大肠杆菌质粒上具有控制质粒DNA转移的基因
B．基因工程基本原理是让目的基因在宿主细胞中稳定存在和高效复制
C．用氯化钙处理植物细胞，可增加细胞壁的通透性
D．将乙肝抗原导入酵母菌可以获得能生产乙肝疫苗的工程菌
7．（2021高二下·金台期中）利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列有关叙述正确的是（ ）
A．过程②需使用逆转录酶
B．过程②利用PCR扩增CarE基因需使用解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．过程③可用NaCl溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞
D．过程④可利用DNA分子杂交法鉴定目的基因是否已导入受体细胞
8．某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是（ ）
A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长，而不能在含氯霉素的培养基上生长
9．（2020·和平模拟）Bcl-2基因是细胞凋亡抑制基因，可以利用PCR技术检测其转录水平，进而了解该基因与不同胚胎时期细胞凋亡的关系。如图为克隆猪的培育及Bcl-2基因转录水平检测流程，下列说法错误的是（ ）
A．图中A细胞表示去核的卵母细胞，B细胞表示体细胞
B．在早期胚胎发育的不同时期提取的总mRNA是不同的
C．图中过程X表示反转录，获得的cDNA可用于克隆猪基因组的测序
D．在PCR过程中，（Bcl-2 cDNA）/cDNA的值反映Bcl-2基因的转录水平
10．转基因抗虫棉在我国的种植面积已占全国棉花种植面积的90%。研究者利用PCR技术检测杂草中有无转基因成分，得到如下图所示结果。相关分析错误的是（ ）
A．空白实验是未加入DNA模板得到的电泳结果
B．推测棉田杂草6、7与抗虫棉的亲缘关系较近
C．结果说明校园杂草与棉花间一定存在生殖隔离
D．转基因成分进入杂草体内可能会引发生态问题
11．（2023·唐山模拟）某一质粒载体如图甲所示，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tett表示四环素抗性基因。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化后得到多种大肠杆菌，并利用培养基乙和丙筛选出导入重组质粒的大肠杆菌。下列叙述错误的是（ ）
A．图甲所示的质粒中还应含有复制原点和终止子等结构
B．将经转化处理后的大肠杆菌菌液接种至培养基乙使用的是稀释涂布平板法
C．配制培养基乙时应加入青霉素
D．培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌
12．（2022高二下·十堰期末）自古以来，新疆就是棉花种植之乡，为获得抗蚜虫棉花新品种，科研人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体（pBⅠ121）结合，然后导入棉花细胞。下列叙述错误的是（ ）
A．限制酶BsaB Ⅰ处理GNA和ACA时，作用于磷酸二酯键
B．pBI121上的启动子是具有特殊核苷酸序列的RNA片段
C．可通过花粉管通道法将构建好的重组载体导入受体细胞
D．可通过采摘抗虫棉的叶片饲喂蚜虫进行个体生物学水平的鉴定
13．（2020·北碚模拟）在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是（ ）
A．引物1与引物2 B．引物3与引物4
C．引物2与引物3 D．引物1与引物4
14．（2022高二下·镇江期末）下列有关基因工程的叙述正确的是（ ）
A．限制酶、DNA连接酶和解旋酶作用的化学键都是两个核苷酸之间的磷酸二酯键
B．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列
C．用氯化钙处理植物细胞，可增加细胞壁的通透性
D．基因工程所需载体有质粒、细菌拟核等，至少要有一个限制酶识别位点
15．（2021高二下·金台期中）拟利用番茄表达人类凝血因子Ⅸ，操作步骤排序正确的是（ ）
①制备工程农杆菌 ②构建基因表达载体
③获取人类凝血因子Ⅸ基因 ④番茄植株中凝血因子Ⅸ基因的检测
⑤用农杆菌转化番茄植株并筛选 ⑥提取凝血因子Ⅸ并检测活性
A．③①②⑤⑥④ B．⑥③①②⑤④
C．④③②①⑤⑥ D．③②①⑤④⑥
16．（2020高二下·南昌期末）下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（ ）
A．不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同
B．PCR反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关
C．在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体
D．质粒上的目的基因都必须整合到受体细胞的DNA上并表达
17．（2023高三下·海淀模拟）科研人员从四川卧龙自然保护区采集到的大熊猫粪便中提取DNA，通过PCR技术扩增DNA来区分不同大熊猫个体，进而统计大熊猫种群密度。下列叙述不正确的是（ ）
A．野生大熊猫种群密度调查不适合用标记重捕法
B．PCR扩增的序列应在大熊猫的不同个体间存在差异
C．大熊猫粪便中的脱落细胞可为PCR提供模板DNA
D．不同粪便样本的PCR扩增结果一定存在明显差异
18．（2021高三上·金华月考）DNA分子杂交技术可以用来比较不同种生物DNA分子的差异。当两种生物的DNA分子有互补的碱基序列时，碱基的互补的区段会形成杂合双链区（如图所示）。下列叙述错误的是（ ）
A．可利用该技术从基因文库中筛选目的基因
B．杂合双链区不一定含有完整的遗传信息单位
C．杂交游离区的形成是因为该区域碱基的序列不同
D．杂合双链区的形成过程中有氢键及磷酸二酯键的生成
19．（2023·广东模拟）T-2毒素是一种常见的霉菌毒素，可通过污染饲料引起畜禽中毒。CYP3A是猪体内降解T-2毒素的关键酶，T-2毒素可诱导其表达水平升高。CCAATbox和GCbox是CYP3A基因启动子的两个调控序列。研究者将不同调控序列分别和CYP3A基因启动子及LUC基因（荧光素酶基因）连接构建表达载体，导入猪肝细胞，在培养基中加入T-2毒素，24h后计算启动子活性相对值，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．④为对照组，把仅含LUC基因的表达载体导入细胞
B．与④组相比，①组中加入T-2毒素的含量大大增加
C．可通过检测荧光素酶的活性来计算启动子活性相对值
D．调控序列的缺失使T-2毒素不能诱导CYP3A基因表达
20．（2020高二下·南京期中）下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（ ）
A．表达载体应含有目的基因、启动子、终止子和标记基因等结构
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原点
C．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
D．表达载体中的胰岛素基因可以通过人肝细胞mRNA反转录获得
21．（2023高二下·湖南期中）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善番茄品质。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。下列叙述正确的是（ ）
A．可使用XbaⅠ和HindⅢ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒
B．可使用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒
C．启动子能被DNA聚合酶识别，启动转录
D．重组质粒成功导入受体细胞后，受体细胞能合成卡那霉素
22．（2020高二下·西安期末）科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，Ti质粒如图所示。下列叙述，正确的是（ ）
A．农杆菌的拟核DNA与番木瓜基因发生重组
B．构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶
C．含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性
D．转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性
23．（2023高二下·肇庆期末）八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crlI表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，其编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crlI基因转人水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为"黄金大米"。下列叙述错误的是（ ）
A．构建基因表达载体时使用的工具酶有限制酶、DNA连接酶
B．科研人员可用两种不同引物进行PCR以扩增psy基因
C．黄金大米培育过程中构建基因表达载体时可用pmi基因作为标记基因
D．用Ca2+处理水稻细胞使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，再将重组基因导入
24．（2023·重庆模拟）图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图，其中引物1～4在含有目的基因的DNA上的结合位置如图甲所示，限制酶BamHI、EcoRI、HindⅢ在质粒上的识别位点如图乙所示。下列说法正确的是（ ）
A．过程①中应使用限制酶HimdⅢ切割质粒
B．应选择引物2和3扩增目的基因
C．过程②可用Ca2+处理来促进大肠杆菌的转化
D．若将该基因片段扩增6次，则消耗128个引物分子
25．（2023高三下·石家庄开学考）新冠病毒包膜表面的S蛋白能识别人体细胞膜表面的ACE2受体并导致病毒入侵人体细胞。制备重组亚单位新冠疫苗的线路是：提取新冠病毒RNA→通过RT-PCR（反转录酶聚合酶链式反应）技术扩增筛选RBD蛋白（S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分）基因（图1）→构建基因表达载体（图2）→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。图3为利用电泳技术对PCR的产物进行纯度鉴定，1号泳道为标准（Marker），2号泳道为阳性对照组，3号泳道为实验组。下列相关叙述错误的是（ ）
A．利用RT-PCR技术获取RBD蛋白基因时，需加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶
B．利用PCR扩增含有限制酶切点的RBD蛋白基因时，应选择的引物为引物4、引物5
C．2号泳道是以（提纯的）RBD蛋白基因片段为材料所做的阳性对照组
D．为提高目的基因和运载体的正确连接效率，应选择限制酶EcoRI切割
二、实验探究题
26．科学家通过基因工程技术，成功利用Bt毒蛋白基因和非转基因棉A植株培育出抗虫转基因棉B植株，回答下列问题：
（1）利用基因工程获得抗虫转基因棉B植株的操作程序主要包括 个步骤，其中核心步骤是 ：
（2）一个完整的基因表达载体应该包括复制原点、启动子、终止子、 (答出2点即可)等，其中启动子是指 。
（3）研究人员发明了一种新的基因转化法——农杆菌介导喷花转基因法，即将农杆菌悬浮液用微型喷壶均匀喷洒于棉花柱头和花药等器官上，该方法集合了 两种转化法的优点，可用 技术确认Bt毒蛋白基因是否插入到了转基因植物的染色体DNA上。
（4）通过对Bt毒蛋白三维结构图及氨基酸序列进行分析，发现若将该蛋白质结构中一段由14个氨基酸组成的螺旋结构缺失，结构变化后的Bt蛋白质能使棉铃虫具有更高的致死率。若要根据蛋白质工程的原理设计实验对Bt蛋白进行改造，以提高其致死率，实验设计思路是 。
27．（2023高二下·兖州期中）玉米是重要的粮食作物，其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白，由P基因编码，在植物生长发育过程中对水分的吸收具有重要的调节功能。科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米，回答下列问题。
（1）利用PCR技术以图1中的DNA片段为模板扩增P基因，需要的引物有____________（从A、B、C、D四种单链DNA片段中选择）。
A．A B．B C．C D．D
（2）科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米，在P基因表达过程中转录所需的原料是 。
（3）研究人员利用PCR技术获得了P基因，有关该过程的叙述正确的是______
A．需要了解P基因的全部碱基序列
B．新链的合成只能从3'→5'
C．反应体系加入的酶需要具有热稳定性
D．G/C含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高
（4）培育超量表达P蛋白的转基因玉米过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图2所示（Ti质粒上的T-DNA可转移到被侵染的细胞，并整合到该细胞的染色体DNA上）。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用 酶组合，理由是 ；不选用图中其它限制酶的原因是 。
（5）图2中强启动子是 的结合位点，可驱动基因的表达。将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入 （填“潮霉素”“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”）进行筛选。
（6）P蛋白在玉米株系的表达量如图3所示，可作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究实验材料的有 。
三、综合题
28．（2021高三下·吉林月考）甜味蛋白 Brazzein 是从一种西非热带植物的果实中分离得到的一种相对分子质量较小的蛋白质，它含有54
个氨基酸，是目前最好的糖类替代品。迄今为止，已发现 Brazzein基因在数种细菌、真菌和高等植物、动物细胞中都能表达。回答下列问题:
（1）从基因文库中提取Brazzein
基因时，根据 Brazzein 基因的核苷酸序列 、 、 ，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取 。
（2）基因工程的核心步骤是 。将Brazzein
基因导入细菌、真菌和高等植物细胞时都可使用的常用载体是 。
（3）若受体细胞是大肠杆菌，首先用 处理细胞，使其成为感受态细胞。Brazzein基因在大肠杆菌细胞内表达时， 表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用 的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加 的抑制剂。
29．（2020·临汾模拟）科学家采用转基因体细胞克隆技术获得转基因绵羊，以通过乳腺生物反应器生产人 —抗胰蛋白酶，其技术路线如图：
回答下列问题：
（1）基因表达载体应当包括 ，构建基因表达载体常用的酶是 ，常用载体有 。
（2）核移植的受体应选用 期卵母细胞，之后通过 （写出一种具体方法）激活受体细胞使其完成细胞分裂和发育进程。
（3）进行胚胎移植时，胚胎应发育到 阶段，移植的方法有 。为一次性获得多个体，可使用胚胎分割技术，在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要注意 。
30．（2022·天津）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
（1）如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端引入XhoⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
（2）PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含 （EcoRⅠ∕HindⅢ∕XhoⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
（3）将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
（4）用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感 D．卡那霉素和链霉素都不敏感
（5）可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
答案解析部分
1．【答案】B
【解析】【解答】A、囊胚包括滋养层细胞和内细胞团细胞，其中内细胞团细胞属于胚胎干细胞，过程①选择的囊胚中的细胞只进行有丝分裂，A不符合题意；
B、对于目的基因的导入，动物细胞一般采用显微注射法，用Ca2+处理是针对细菌的处理方法，B符合题意；
C、过程④表示胚胎移植，进行胚胎移植时，要求受体和供体处于相同的生理状态，所以要对代孕母鼠进行同期发情处理，以免发生排斥反应，C不符合题意；
D、子代小鼠的遗传物质不是来自代孕母鼠，所以不会表现出代孕母鼠的性状，D不符合题意。
故答案为：B
【分析】1、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
2、胚胎移植的主要过程：
（1）对供、受体的选择和处理：①选择：遗传性能和生产性能优秀的供体、有健康的体质和正常繁殖能力的受体；②处理：同期发情处理和对供体母畜进行超数排卵处理。
（2）配种或进行人工授精。
（3）对胚胎的收集、检查、处理：①收集：冲卵；②检查：对胚胎进行质量检查，这时胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段；③处理：直接向受体移植或放人-196℃的液氮中保存。
（4）胚胎移植——方法：手术法和非手术法。
（5）胚胎移植后的检查——检查受体是否妊娠。
2．【答案】A
【解析】【解答】A、获得相同黏性末端用不同种类的限制酶切割DNA，不能体现统一性，A错误；
B、构建基因表达载体的结构基础是运载体和目的基因都是双链DNA，体现了统一性，B正确；
C、基因能在异体细胞中表达的基础是各种生物共用一套遗传密码，体现了生物的统一性，C正确；
D、人的胰岛素能在细菌内合成的结构基础是细菌也有核糖体，体现了细胞结构的统一性，D正确。
故答案为：A。
【分析】1、DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
DNA连接酶：两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，形成重组DNA。
常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。2、基因工程的原理为基因重组。
3．【答案】B
【解析】【解答】A、PCR是体外进行DNA复制，以半保留复制为原理，为了维持反应的稳定，反应需要在缓冲液中进行，A正确；
B、耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，B错误；
C、反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三步，C正确；
D、常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，D正确。
故答案为：B。
【分析】PCR技术的过程：
①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；
②低温复性：引物结合到互补链DNA上；
③中温延伸：合成子链。
4．【答案】B
【解析】【解答】A、动物细胞的受体通常是受精卵，故需要将该表达载体导入受精卵以获得转基因小鼠，A错误；
B、PCR技术的条件之一是需设计特异性的一对引物，B正确；
C、构建该表达载体需要限制酶（切割目的基因和运载体）和DNA连接酶，C错误；
D、基因的表达通常包括转录和翻译，表达的产物通常是蛋白质，故检测目的基因是否完成表达常用抗原抗体杂交技术，D错误。
故答案为：B。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法（主要用于双子叶植物和裸子植物）、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
5．【答案】A
【解析】【解答】A、PCR技术就是体外大量扩增DNA的技术，即以少量DNA制备大量DNA的技术，其原理是DNA复制；通过运用PCR技术可以针对性地检测遗传多样性，A正确；
B、对于每个个体而言其DNA中都有各自特定的碱基序列，要进行遗传多样性检测只需要对一些特定基因或序列进行比对即可，而不需要对基因组全序列测定，B错误；
C、同一物种的不同个体细胞内的染色体数一般相同，C错误；
D、遗传多样性也称基因多样性，主要是指基因的种类不同，所以检测DNA的含量不能反应遗传多样性，D错误。
故答案为：A。
【分析】1、生物多样性包括3个层次：遗传多样性（所有生物拥有的全部基因）、物种多样性（指生物圈内所有的动物、植物、微生物）、生态系统多样性。
2、PCR技术
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚台酶(Taq酶)。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩増中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
6．【答案】A
【解析】【解答】A、质粒通常具有控制质粒DNA转移的基因，即T_DNA（可转移DNA），A正确；
B、基因工程的基本原理是基因重组，B错误；
C、用氯化钙处理微生物细胞，可增加细胞壁的通透性，C错误；
D、将控制乙肝抗原表达的基因导入酵母菌可以获得能生产乙肝疫苗的工程菌，D错误。
故答案为：A。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
7．【答案】D
【解析】【解答】A、过程①表示反转录，需要反转录酶的催化，A错误；
B、过程②表示目的基因的获取，在利用PCR技术对获取的目的基因进行扩增的过程中，不需要使用解旋酶，解旋是通过高温解链实现的，B错误；
C、过程③表示将目的基因导入受体细胞，若受体细胞为大肠杆菌细胞，则需要用CaCl2溶液处理，使之成为感受态细胞，C错误；
D、过程④可利用DNA分子杂交技术，鉴定目的基因是否已导入受体细胞，D正确。
故答案为：D。
【分析】图中过程①表示利用mRNA通过反转录法合成相应的DNA；过程②表示目的基因的获取；过程③表示将目的基因导入受体细胞；过程④表示通过筛选获得工程菌。
8．【答案】C
【解析】【解答】质粒中含有限制酶HindⅢ和PstⅠ的切割位点，且各含一个，因此用这两种限制酶切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；由图乙可知，限制酶AluⅠ的切割位点位于目的基因上，因此不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA，否则会破坏目的基因，B正确；用SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒会导致两个抗性基因均被破坏，无法筛选导入重组DNA的细菌，因此构建重组DNA时，不能选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，C错误；构建基因表达载体时，应该选择HindⅢ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，这样会破坏氯霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长，而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。 故答案为：C。
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
9．【答案】C
【解析】【解答】据图分析，图中A细胞表示去核的卵母细胞，B细胞表示良种猪的体细胞，为重组细胞提供细胞核，A正确；
基因是选择性表达的，所以在早期胚胎发育的不同时期提取的总mRNA是不同的，B正确；
图中过程X表示逆转录，获得的cDNA不含非编码序列，所以不可用于克隆猪基因组的测序，C错误；
在PCR过程中可检测出cDNA中Bcl-2 cDNA的分子数，进而计算总mRNA中Bcl-2 mRNA的分子数，从而反映出Bcl-2基因的转录水平，D正确。
【分析】图示表示克隆猪的培育及该基因转录水平检测流程，图中涉及动物体细胞核移植技术、动物细胞培养技术、胚胎移植及PCR技术，其中A细胞表示去核的卵母细胞，B细胞表示良种猪的体细胞，为重组细胞提供细胞核；mRNA→cDNA的X过程为逆转录过程。据此答题。
10．【答案】C
【解析】【解答】A、空白试验应该是DNA标准样液（Marker），未加入DNA模板得到的电泳结果，作为空白对照，A正确；
B、根据杂草6和7含有转基因成分可以推测，杂草6和7可能与抗虫棉的亲缘关系较近，获得了转基因特性，B正确；
C、根据6和7含有转基因成分可知，杂草可能与棉花的亲缘关系较近，不能说明两者是否存在生殖隔离，C错误；
D、转基因成分进入杂草内，可能导致杂草获得转基因特性，可能会引发生态问题，D正确。
故答案为：C。
【分析】1、目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、DNA分子杂交技术可以用来比较不同种生物DNA分子的差异。当两种生物的DNA分子的单链具有互补的碱基序列时，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补的碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链，形成泡状结构。形成杂合双链区的部位越多，说明这两种生物的亲缘关系越近。
11．【答案】D
【解析】【解答】A、质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有具有标记基因、具有一个或多个限制酶切点、能在受体细胞中复制（复制原点），若是同时作为表达载体，还需要具有启动子和终止子等结构，A正确；
B、稀释涂布平板法可以用于微生物的分离计数，题中培养基乙后需要影印接种，可以使用稀释涂布平板法接种转化处理后的大肠杆菌的菌液，B正确；
C、配制培养基乙时应加入青霉素，使转化环状目的基因的大肠杆菌筛选掉，C正确；
D、培养基乙中生长的菌落为转化质粒载体或者含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌；培养基丙中生长的菌落为导入质粒载体的大肠杆菌，故不能在培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌，D错误。
故答案为：D。
【分析】1、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
2、 微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
12．【答案】B
【解析】【解答】A、限制酶BsaB Ⅰ处理GNA和ACA时，能够识别GNA和ACA的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，A正确；
B、启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列，它含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，即pBI121上的启动子是具有特殊核苷酸序列的DNA片段，B错误；
C、将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，因此可通过花粉管通道法将构建好的重组载体导入受体细胞，C正确；
D、个体水平上的鉴定有抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等，因此可通过采摘抗虫棉的叶片饲喂蚜虫进行个体生物学水平的鉴定，D正确。
故答案为：B。
【分析】基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
13．【答案】C
【解析】【解答】要获得B链，则要获得引物之间的DNA片段，根据PCR中子链延伸方向为5，到3，，故需选择引物2与引物3进行扩增，选C。
【分析】本题考查PCR的相关知识。PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。PCR的原理是DNA复制，需要的条件包括：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。PCR扩增DNA的过程包括：高温变性、低温复性、中温延伸过程。
14．【答案】B
【解析】【解答】A、限制酶、DNA连接酶作用的化学键都相同，都是DNA一条链中相邻两个核苷酸之间的磷酸二酯键，而解旋酶的作用部位是氢键，A错误；
B、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，并在特定位点进行切割，B正确；
C、植物的细胞壁主要成分是纤维素和果胶，氯化钙对其无效，用氯化钙处理的细胞，应该是类似于大肠杆菌一类的细胞，其细胞壁主要是肽聚糖，氯化钙可以增加它的通透性，C错误；
D、基因工程所需载体有质粒、动植物病毒和噬菌体等，细菌拟核不能作为载体，载体需有一个或多个限制酶识别位点，以便连接不同的目的基因，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、基因工程的基本工具：
（1）限制性内切核酸酶：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
（2）DNA连接酶：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。
（3）载体：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因，能携带外源DNA片段进入受体细胞。
2、基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
15．【答案】D
【解析】【解答】利用番茄表达人凝血因子属于基因工程的技术范畴。基因工程的基本步骤：获取目的基因，构架表达载体，受体细胞的转化，目的基因的表达及检测。对植物细胞进行转化通常用农杆菌转化法。综合可知正确的排序应为：③②①⑤④⑥，D正确。
故答案为：D。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
16．【答案】C
【解析】【解答】A、限制酶具有专一性，不同的限制酶切割形成的黏性末端也可能相同，也可能不同，A错误；
B、PCR反应中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的，与扩增的目的基因和引物有关，B错误；
C、在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体，这样获得基因表达载体的概率更高，C正确；
D、质粒本身也是DNA，也能自我复制，所以进入受体细胞以后，既可以自己进行表达，也可以整合到体细胞的DNA 并表达，D错误。
故答案为：C。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
17．【答案】D
【解析】【解答】A、题意显示，野生大熊猫数量较少，且其体型较大，调查分布范围小、数量少、个体较大的种群的密度时，可采用逐个计数法，不适合用标记重捕法，A正确；
B、由于DNA分子具有特异性，因而可推测，PCR扩增的序列应在大熊猫的不同个体间存在差异，B正确；
C、大熊猫粪便中的脱落细胞可为PCR提供模板DNA，进而可通过PCR技术扩增DNA来区分不同大熊猫个体，据此统计大熊猫种群密度，C正确；
D、由于大熊猫个体数量过少，即遗传多样性较低，因此，不同粪便样本的PCR扩增结果未必一定存在明显差异，D错误。
故答案为：D。
【分析】1、种群密度的调查方法： （1）逐个计数法：分布范围小，个体较大的生物。 （2）黑灯诱捕法：趋光性昆虫。 （3）样方法：多数植物和活动范围小活动能力弱的动物。 （4）标志重捕法：活动范围大活动能力强的动物。
2、PCR扩增过程： （1）变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。 （2）复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
18．【答案】D
【解析】【解答】A、基因文库包括基因组文库和部分基因文库。其中基因组文库包含某种生物所有的基因，而部分基因文库只包含某种生物的部分基因，可利用DNA分子杂交技术从基因文库中筛选目的基因，A正确；
B、DNA分子杂交技术是当两种生物的DNA分子的单链具有互补的碱基序列时，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补的碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链，所以杂合双链区不一定含有完整的遗传信息单位，B正确；
C、DNA分子杂交技术是当两种生物的DNA分子的单链具有互补的碱基序列时，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补的碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链，C正确；
D、双链区是通过碱基对中的氢键形成的，D错误。
故答案为：D。
【分析】DNA分子杂交技术可以用来比较不同种生物DNA分子的差异。当两种生物的DNA分子的单链具有互补的碱基序列时，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补的碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链，形成泡状结构。形成杂合双链区的部位越多，说明这两种生物的亲缘关系越近。
19．【答案】C
【解析】【解答】A、④为对照组，把含CYP3A基因启动子及LUC基因的表达载体导入细胞，A错误；
B、T-2毒素是无关变量，每组加入含量要相同，因此与④组相比，①组中加入T-2毒素的含量相同，B错误；
C、实验的因变量是荧光素酶的活性，可通过检测荧光素酶的活性来计算启动子活性相对值，荧光素酶的活性越大，启动子活性相对值就越大，C正确；
D、由图可知，②③④这三组的启动子活性相对值都大于0，说明调控序列的缺失使T-2毒素可以诱导CYP3A基因表达，D错误。
故答案为：C。
【分析】1、生物实验应遵循的原则：（1）单一变量原则，（2）对照原则，（3）可重复原则，（4）科学性原则。
2、自变量与因变量：自变量是实验中由实验者操纵的因素或条件，而因变量是指由实验变量而引起的变化结果，二者之间是前因后果的关系。
3、分析题图可知，实验的自变量为是否含有CCAAT box和GC box，因变量是荧光素酶的活性。
20．【答案】A
【解析】【解答】A、表达载体应含有目的基因、启动子、终止子和标记基因等结构，A正确；
B、基因的表达均启动于启动子，复制启动于复制原点，B错误；
C、终止密码子位于mRNA上，终止翻译过程，C错误；
D、由于基因的选择性表达，在人的肝细胞中，没有胰岛素基因转录的mRNA，D错误。
故答案为：A。
【分析】基因表达载体的构建：1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2、组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质；（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端；（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，常用的标记基因是抗生素抗性基因。
21．【答案】A
【解析】【解答】A、目的基因内有BamHⅠ识别序列，因此不能选择BamHⅠ切割目的基因，因此目的基因左侧应选择限制酶XbaⅠ切割，由目的基因的转录方向可以推测，目的基因右侧应选择靠近终止子的限制酶HindⅢ，而不能选择靠近启动子的EcoRⅠ，因此需要用XbaⅠ和HindⅢ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒，A正确；
B、若用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因，则目的基因与质粒会发生反向连接，不能正常按转录方向转录，B错误；
C、启动子能被RNA聚合酶识别，启动转录，C错误；
D、重组质粒中含有的是卡那霉素抗性基因，不是卡那霉素合成基因，不能合成卡那霉素，D错误。
故答案为：A。
【分析】1、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。其中目的基因的获取需要限制酶，基因表达载体的构建需要限制酶和DNA连接酶。
22．【答案】D
【解析】【解答】A、农杆菌的拟核DNA不会与番木瓜基因发生重组，和番木瓜基因发生重组的是其质粒上的基因，A错误；
B、构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；
C、含重组Ti质粒的农杆菌具有卡那霉素抗性，而不具有四环素抗性，C错误；
D、因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T-DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病番木瓜不含有卡那霉素抗性基因，故不具有卡那霉素抗性，D正确。
故答案为：D。
【分析】农杆菌转化法：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的 Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进人植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
23．【答案】D
【解析】【解答】A、构建基因表达载体常用的工具酶有限制酶（基因“剪刀”）与DNA连接酶（缝合的“针线”），A正确；
B、PCR扩增目的基因psy时，需要2种引物分别与两条模板链结合，B正确；
C、pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，其编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长，故黄金大米培育过程中构建基因表达载体时可用pmi基因作为标记基因，C正确；
D、Ca2+处理可改变细菌细胞膜的通透性，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，但Ca2+只能处理原核细胞，不能处理真核细胞，D错误。
故答案为：D。
【分析】常用的转化方法：
①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法（是双子叶植物中常用方法，因为它易感染双子叶植物，其Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞上。），其次还有基因枪法和花粉管通道法等。
②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。方法的受体细胞多是受精卵。
③将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
24．【答案】C
【解析】【解答】A、①是基因表达载体的构建过程；若使用EcoRⅠ切割质粒会将目的基因掐入启动子上游，目的基因不能正确表达；使用HamdⅢ切割质粒将破坏标记基因，不利于目的基因的鉴定和筛选，因此该过程中应使用限制酶 BamHⅠ切割质粒，A错误；
B、由于DNA聚合酶只能从5′→3′延伸子链，因此扩增目的基因时应选择引物1和4，B错误；
C、将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法，所以过程②可用Ca2+处理来促进大肠杆菌的转化，C正确；
D、PCR 技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n+1-2，因此PCR过程完成6轮循环，理论上至少需加入引物26+1-2=126个，D错误。
故答案为：C。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、分析题图：图中甲为目的基因，乙为载体，①表示构建基因表达载体，②是将目的基因导入受体细胞。
25．【答案】D
【解析】【解答】A、RT-PCR技术是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入逆转录酶、Taq酶，A正确；
B、引物与模板链的3'端碱基互补配对，故引物1、引物2、引物7和引物8不合适，扩增得到的RBD蛋白基因也应该含有限制酶的酶切位点，故引物3和引物6不合适，故答案为：引物4和引物5，B正确；
C、PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准（Marker），2号泳道是以RBD蛋白基因片段为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组，C正确；
D、质粒上没有SmaⅠ酶切位点，且若使用EcoRⅠ酶切，易造成目的基因和质粒自身环化，故应该选择BamHⅠ和HindⅢ，D错误。
故答案为：D。
【分析】PCR扩增过程： （1）变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。 （2）复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
26．【答案】（1）四；构建基因表达载体
（2）目的基因（Bt毒蛋白基因）和标记基因；位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
（3）农杆菌转化法和花粉管通道法；DNA分子杂交
（4）参照密码子表，找到控制该14个氨基酸的碱基对序列所在的基因位置，将这些碱基对序列进行缺失处理
【解析】【解答】(1)获取抗虫转基因棉B植株需要采用基因工程技术，该技术主要包括四个步骤，核心步骤是基因表达载体的构建。
(2)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；启动子是位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程。
(3)农杆菌介导喷花转基因法是指将农杆菌悬浮液用微型喷壶均匀喷洒于棉花柱头和花药等器官上，该方法集合了农杆菌转化法和花粉管通道法两种转化法的优点。检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因常用的方法为DNA分子杂交技术。
(4)蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。再根据题干信息“将该蛋白质结构中一段由14个氨基酸组成的螺旋结构缺失，结构变化后的Bt蛋白质能使棉铃虫具有更高的致死率”可知，要根据蛋白质工程的原理对Bt蛋白进行改造，以提高其致死率，可参照密码子表，找到控制该14个氨基酸的碱基对序列所在的基因位置，将这些碱基对序列进行缺失处理。
【分析】基因工程技术的基本步骤︰
（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
27．【答案】（1）B；C
（2）4种核糖核苷酸
（3）C；D
（4）BamHI和Sacl；能将P基因和强启动子完整切割，且在与Ti质粒连接的过程中可避免自身环化等问题；EcoRI和NotI会破坏P基因，HindIII会将强启动子和P基因分离
（5）RNA聚合酶；潮霉素
（6）a1、a2、a3
【解析】【解答】（1）因为DNA子链是从引物的3'端开始延伸，由图可知，需要用B、C两个引物。
故填：B C。
（2）P基因转录形成RNA，而RNA的基本组成单位是核糖核苷酸，因此所需原料是4种核糖核苷酸。
故填：4种核糖核苷酸。
（3）PCR技术扩增目的基因，只需要知道目的基因两侧部分的碱基序列用来设计引物，A不符合题意；DNA新链的合成只能从5'→3'，B不符合题意；在PCR过程中，是在较高温度的条件下进行，因此反应体系中加入的DNA聚合酶需要具有热稳定性，C符合题意；引物有可能会与模板链非特异性结合，因此若使用G/C含量高的引物，需要提高复性温度，降低非特异性扩增的概率，D符合题意。
故填：C D。
（4）若要使P基因在玉米植株中超量表达，则要保证重组质粒上P基因左侧含有启动子，右侧含有终止子，在选择限制酶时，要保证该限制酶酶切位点在T-DNA上，并且不会破坏启动子和P基因、终止子、潮霉素抗性基因等，此外，最好选择两种限制酶，能够防止目的基因或质粒自身环化，由此可推知，应选择BamHI和Sacl。
故填：BamHI和Sacl；能将P基因和强启动子完整切割，且在与Ti质粒连接的过程中可避免自身环化等问题；EcoRI和NotI会破坏P基因，HindIII会将强启动子和P基因分离。
（5）图中强启动子是转录的起始位点，即RNA聚合酶的结合位点，可驱动基因的表达，由图可知，T-DNA上含有潮霉素抗性基因，若愈伤组织转化成功，则应当表现为抗潮霉素性状，因此培养基中需加入潮霉素进行筛选。
故填：RNA聚合酶；潮霉素。
（6）由图可知，a1、a2、a3的P蛋白相对表达量显著高于其他两组，因此应选择a1、a2、a3来作为超量表达P蛋白转基因玉米的生理特性研究实验材料。
故填：a1、a2、a3。
【分析】1、PCR的每一次循环都包括变性、复性和延伸三个步骤，其中变性就是指在高温条件下是DNA双螺旋结构打开，有利于DNA的复制，复性的目的是使引物能够结合在模板DNA上，而延伸是利用耐高温的DNA聚合酶从引物的3'末端开始对子链进行延伸。
2、基因工程的基本工具及作用
①限制酶：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，使一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有一定的专一性；在选择限制酶时，要保证该限制酶不会切割目的基因和载体上的标记基因、启动子、终止子和复制原点等，并且限制酶酶切位点应介于载体的启动子与终止子之间，最好选用两种能够产生不同黏性末端的限制酶分别对目的基因和载体的两侧进行切割，避免目的基因或载体自身环化；
②DNA连接酶：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键；
③载体：能运载目的基因进入受体细胞，并使目的基因能在受体细胞中稳定存在并表达。
作为载体应具备的条件：能稳定存在并自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因以及对受体细胞无害。
28．【答案】（1）基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA
（2）基因表达载体的构建；质粒
（3）Ca2+；蛋白酶缺陷型；蛋白酶
【解析】【解答】（1）要从基因文库中得到我们需要的目的基因，需根据目的基因的有关信息。例如，从基因文库中提取Brazzein
基因时，根据 Brazzein 基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因翻译产物蛋白质等特性来获取。
（2）基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心步骤。将目的基因导入受体细胞时常用的载体是质粒，在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等，其中，将Brazzein
基因导入细菌、真菌和高等植物细胞时都可使用的载体是质粒。
（3）若受体细胞是大肠杆菌，首先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞。Brazzein基因在大肠杆菌细胞内 表达出的蛋白质可能会（在蛋白酶催化下）被降解。因此在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，以避免Brazzein基因在大肠杆菌细胞内表达出的蛋白质被降解，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂以提高蛋白质的含量。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
29．【答案】（1）启动子、终止子、目的基因；限制性核酸内切酶、DNA连接酶；质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒
（2）MⅡ；电脉冲、钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂
（3）桑椹胚或囊胚；手术法和非手术法；将内细胞团均等分割
【解析】【解答】（1）基因表达载体的组成包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因等；构建基因表达载体常用的工具酶是限制酶和DNA连接酶；常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。（2）动物细胞的核移植到一个去核的MII卵母细胞中；核移植的过程中，用物理或化学方法（如电脉冲、钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等）激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程。（3）进行胚胎移植时，胚胎应发育到桑椹胚或囊胚阶段，移植的方法有手术法和非手术法。为一次性获得多个体，可使用胚胎分割技术，在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
【分析】（1）基因表达载体的构建（基因工程的核心）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点；启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质；标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来；（2）动物核移植是将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。原理：动物细胞核具有全能性；（3）胚胎移植是指将雌性动物体内的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。（4）分析题图可知：转基因绵羊涉及的技术手段有转基因技术、核移植、胚胎移植，据此答题。
30．【答案】（1）1；4；5'
（2）XhoⅠ
（3）卡那霉素
（4）B
（5）PCR
【解析】【解答】（1）根据引物箭头方向可知，去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1和4。在进行PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物 3＇端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5＇端到 3＇端延伸的，所以在引物的5＇端引入XhoI酶识别序列。
故填：1；4；5＇。
（2）由图可知，载体4中RpSL（链霉素敏感基因）的两侧具有XhoI酶识别序列，载体3中不含XhoI酶识别序列，所以引物应包含XhoⅠ酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
故填：XhoⅠ。
（3）将改进的P1基因整合到载体4构建载体5，载体5中含有RpSL（链霉素敏感基因）和KanR（卡那霉素抗性基因），将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。
故填：卡那霉素。
（4）P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失，该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B正确，ACD错误。
故填：B。
（5）通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中，所以可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
故填：PCR。
【分析】1、目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取（基因组文库包含某种生物所有的基因，部分基因文库包含某种生物的部分基因，如：CDNA文库）、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建︰基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。a、启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；b、终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；c、标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
3、将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。①将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；②将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；③将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（Ca2+处理法）。
4、目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
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