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第3章 基因工程
探究一 基因工程的诞生和发展
理论基础
基因工程的诞生和发展
相关技术
定向改造生物的
遗传性状
目的
催生
操作水平
分子水平
基因工程
基因重组
原理
结果
新的生物类型和生物产品
重组DNA技术
的基本工具
工具
限制酶
DNA连接酶
载体
联系
类型
种类
条件
特点
结果
均作用于磷
E.coli DNA
T4 DNA
质粒、噬菌
具有一个至多个限制
酸二酯键
连接酶
连接酶
体、动植物
酶切割位点；能在宿
病毒等
主细胞内稳定存在并
黏性末端
平末端
复制；具有标记基因第1节 重组DNA技术的基本工具
[基础检查]
1.下列不属于质粒作为载体的理由的是 ( )
A.能自我复制
B.有一个至多个限制酶切割位点
C.具有标记基因
D.它是环状DNA
2.下列关于下图所示黏性末端的说法,错误的是 ( )
甲
乙
丙
A.甲、乙、丙黏性末端是由各自不同的限制酶催化产生的
B.甲、乙可形成重组DNA分子,但甲、丙之间不能
C.DNA连接酶的作用位点在b处,催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键
D.切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
3.下列叙述符合基因工程概念的是 ( )
A.加热致死的S型细菌和R型活细菌一起培养,得到S型活细菌
B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株
C.用紫外线照射青霉菌,使其DNA发生改变,通过筛选获得青霉素高产菌株
D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
4.下列有关基因工程中限制酶的描述,正确的是 ( )
A.限制酶只能识别6个或8个脱氧核苷酸组成的序列
B.限制酶的活性受温度的影响
C.限制酶能识别和切割RNA
D.限制酶只能从原核生物中提取
5.下面是4种限制酶所识别的DNA分子序列和切割位点图(↓表示切割位点,切口为黏性末端),下列叙述正确的是 ( )
限制酶1:
限制酶2:
限制酶3:
限制酶4:
A.限制酶1和3切出的黏性末端相同
B.限制酶1、2、4识别的序列都由4个脱氧核苷酸组成
C.在使用限制酶的同时还需要解旋酶
D.限制酶1和2切出的DNA片段可通过T4 DNA 连接酶拼接
6.下列关于几种酶作用的叙述,错误的是 ( )
A.DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接
B.RNA聚合酶能与基因的特定位点结合,催化遗传信息的转录
C.一种限制酶能识别多种核苷酸序列,并切割出多种目的基因
D.DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链
7.质粒是细菌中的有机分子,下列描述正确的是 ( )
A.质粒完全水解后最多可产生4种化合物
B.质粒能够自我复制
C.质粒中含有2个游离的磷酸基团
D.质粒是基因工程的工具酶
8.下列有关DNA连接酶的说法,正确的是 ( )
A.DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反,DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段“缝合”起来
B.DNA连接酶和DNA聚合酶一样能连接单链DNA片段
C.E.coli DNA连接酶可以连接有平末端的DNA片段,也能连接有黏性末端的DNA片段
D.T4 DNA连接酶只能连接有平末端的DNA片段
9.下图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是 ( )
A.①②③④ B.①②④③
C.①④②③ D.①④③②
10.(2021·广东)下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述,正确的是 ( )
A.用限制酶切割获得一个目的基因时得到2个切口,有2个磷酸二酯键被断开
B.限制酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大
C.序列-CATG↓-和-G↓GATCC-被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D.T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接
11.下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图,请据图回答下列问题。
(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是 ,二者还具有其他共同点,如① ,② (写出两条即可)。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为,则与之连接的目的基因切割末端应为 ;可使用 把质粒和目的基因连接在一起。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为 ,其作用是 。
(4)下列常在基因工程中用作载体的是 。
A.苏云金杆菌的抗虫基因
B.土壤农杆菌中的RNA分子
C.大肠杆菌的质粒
D.动物细胞的染色体
[拓展应用]
12.下列关于图示黏性末端的叙述,正确的是 ( )
①
②
③
④
A.①与③是由相同的限制酶切割产生的
B.DNA连接酶可催化①与③的连接
C.经限制酶切割形成④需要脱去2分子水
D.DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端
13.限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是和。下图表示目的基因和四种质粒,其中,质粒上箭头所指部位为酶的识别位点,阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是 ( )
A
B
C
D
14.(2021·佛山)限制酶是一种核酸切割酶,可识别并切割DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。右上图所示为四种限制酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ以及Bgl Ⅱ的识别序列,箭头表示每种限制酶的特定切割位点,切割出来的DNA片段末端可以互补黏合的及其正确的末端互补序列应该为 ( )
A.BamHⅠ和EcoRⅠ;末端互补序列为-AATT-
B.BamHⅠ和HindⅢ;末端互补序列为-GATC-
C.EcoRⅠ和HindⅢ;末端互补序列为-AATT-
D.BamHⅠ和BglⅡ;末端互补序列为-GATC-
15.(2021·珠海)CRISPR/Cas9是近年来生物学科研的热门技术,该技术源于细菌的一种防御机制。如图所示,当细菌感知到噬菌体侵入时,会通过gRNA识别噬菌体DNA,并通过Cas9蛋白切断目标DNA,从而起到防御作用。下列关于该机制的叙述错误的是 ( )
A.gRNA与目标DNA结合片段中最多含有8种核苷酸
B.噬菌体DNA与gRNA的结合遵循碱基互补配对原则
C.Cas9蛋白可破坏DNA分子的磷酸二酯键
D.光学显微镜下可观察到图中的现象
16.1型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原,能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱,从而缓解症状。科研人员利用1型糖尿病模型小鼠进行动物实验,使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原,为此构建重组表达载体,技术路线如图所示。请据图回答下列问题。
(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达,需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析,转录形成的mRNA中,该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有 个。
(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列,确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是 (不定项)。
A.引入的短肽编码序列不能含终止子序列
B.引入的短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C.引入的短肽不能改变A链氨基酸序列
D.引入的短肽不能改变原人胰岛素抗原性
(3)在重组表达载体中,限制酶SacⅠ和XbaⅠ仅有图示的切割位点。用这两种限制酶充分切割重组表达载体,可形成 种DNA片段。
(4)检测转化的乳酸菌发现,信号肽—重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测,信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是 。
(5)用转化的乳酸菌饲喂1型糖尿病模型小鼠一段时间后,小鼠体内出现人胰岛素抗原,能够特异性识别它的免疫细胞有 (不定项)。
A.B细胞 B.T细胞
C.吞噬细胞 D.浆细胞
探究实践课:DNA的粗提取与鉴定
一、实验目的
1.了解DNA的物理和化学性质,理解DNA粗提取和鉴定的原理。
2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。
二、实验原理
1.DNA的粗提取。
利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在 方面存在的差异,提取DNA,去除其他成分。
2.DNA与蛋白质在物理、化学性质方面的差异。
比较项目 DNA 蛋白质
溶解性 浓度为2 mol/L的NaCl溶液中 ① . ②部分 .
浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中 析出 溶解
酒精溶液中 ③ . 溶解
耐受性 蛋白酶 无影响 ④ .
高温 80 ℃以上 变性 不能耐受 60~80 ℃ 的高温
3.DNA的鉴定。
DNA+ . .色。
三、材料用具
1.材料。
新鲜洋葱、研磨液、体积分数为95%的酒精、浓度为2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。研磨液和二苯胺试剂的配制方法参见教科书附录2。
2.用具。
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、陶土网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
四、实验过程
(
在漏斗中垫上
过滤洋葱研磨液
,4 ℃冰箱中静置后取上清
液
;或将洋葱研磨液倒入
中离心,取上清液液;或将洋葱研磨液倒入塑料离心管中离心,取上清液
)破碎细胞——称取洋葱,切碎,放入研钵,倒入研磨液,充分研磨
去除杂质——
(
在上清液中加入体积相等的、预冷的
,静置
,溶液中出现的
就是粗提取的DNA
)
DNA的析出——
(
在溶有DNA的NaCl溶液中加入
,混合均匀后,将试管置于沸水中加热5 min
)
DNA的鉴定——
五、实验操作
1.操作提醒。
(1)研磨液的作用为溶解并提取DNA;体积分数为95%的酒精的作用为析出DNA,使DNA与杂质分开;浓度为2 mol/L的NaCl溶液的作用为溶解丝状物用于DNA的鉴定。
(2)在将待鉴定的提取物加入浓度为2 mol/L的NaCl溶液中溶解时,需要不断搅拌以增加溶解的DNA的量,建议搅拌3 min以上。
(3)二苯胺试剂要现配现用,以保证实验效果。同时,加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5 min及以上,且要等到冷却后再观察效果,这样才可以观察到较为明显的颜色反应。
2.实验报告。
实验时间 。 实验地点 。 实验环境 。
实验结果 实验记录 。
实验结论 。
实验反思 成功之处 。
不足之处 。
3.实验拓展。
若利用鸡血作为实验材料进行“DNA的粗提取”,请你概述相关实验过程。
实验评价
1.玻璃棒搅拌出的较纯净的DNA的颜色以及DNA遇二苯胺试剂(沸水浴)显现的颜色分别是 ( )
A.黄色、紫色
B.白色、砖红色
C.白色、蓝色
D.蓝色、砖红色
2.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是 ( )
A.利用DNA能溶于酒精溶液,而蛋白质不溶于酒精溶液的特性,可将DNA与蛋白质分离
B.利用高温能使DNA变性,却对蛋白质没有任何影响的特性,可将DNA与蛋白质分离
C.利用DNA在浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最大的特点,可将DNA与蛋白质分离
D.在DNA滤液中加入嫩肉粉,通过木瓜蛋白酶的作用,可将DNA与蛋白质分离
3.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的操作及原理的叙述,正确的是 ( )
A.用蒸馏水使家兔的红细胞涨破以获取含DNA的滤液
B.向菜花组织中加入蒸馏水并搅拌可释放核DNA
C.控制NaCl溶液的浓度可以实现去除杂质的目的
D.DNA在酒精溶液中析出时,用玻璃棒轻缓搅拌,会使析出的DNA量减少
4.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是 ( )
选项 试剂 操作 作用
A 柠檬酸 钠溶液 与鸡血混合 防止血液凝固
B 蒸馏水 与鸡血细胞液混合 保持细胞形状
C 蒸馏水 加入溶有DNA的NaCl溶液中 析出蛋白质
D 预冷的 酒精 加入过滤后含DNA的NaCl溶液中 产生特定的颜 色反应
5.研究人员比较了不同储藏条件对棉叶DNA纯度及提取率(提取率越高,获得的DNA越多)的影响,实验结果见下图。下列有关叙述正确的是 ( )
A.提纯DNA时,加入酒精可以去除不溶的蛋白质、酚类等物质
B.从新鲜棉叶中提取的DNA纯度最高,提取的DNA的量也最多
C.木瓜蛋白酶和不同浓度的NaCl溶液均可用于提纯DNA
D.用二苯胺试剂鉴定,颜色最深的是冷冻7 d 处理后提取的DNA
6.下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。请分析并回答下列问题。
(1)图中实验材料A可以是 等,研磨前加入的B应该是 。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后, 再向滤液中加入体积分数为95%的预冷的酒精的目的是 。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中,将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中,经搅拌后过滤,获得如下表所示的4种滤液,其中含DNA最少的是滤液 。
编号 溶液名称 操作 获得溶液
1 研磨液 搅拌研磨 后过滤 滤液E
2 浓度为2 mol/L 的NaCl溶液 搅拌后过滤 滤液F
3 浓度为0.14 mol/L 的NaCl溶液 搅拌后过滤 滤液G
4 预冷的体积分数为 95%的酒精溶液 搅拌后过滤 滤液H
(4)DNA鉴定的原理是 。
7.下图是设计DNA鉴定实验的试管1(对照组)与试管2(实验组)示意图,其中正确的是 ( )
A.
B.
C.
D.
8.下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验中涉及的两个操作装置。叙述正确的是 ( )
甲
乙
A.图甲的烧杯和图乙的试管中所用溶剂都为NaCl溶液,但二者浓度不同
B.图乙试管经少许加热后,即可观察到一支试管中的溶液明显变蓝,另一支试管中的溶液不变蓝
C.图甲操作需用玻璃棒迅速搅拌以使DNA成为絮状沉淀,并缠绕在玻璃棒上
D.图乙操作中所用的二苯胺试剂需现配现用,以达到较好的鉴定效果
9.下图是某中学生物学兴趣小组进行的DNA粗提取实验,其中SDS(一种表面活性剂)除了能瓦解细胞膜和核膜,还能与脂质和蛋白质结合。当SDS遇到钾离子时,钾离子可以置换SDS中的钠离子,产生不溶于水的PDS沉淀。请分析回答下列问题。
(1)实验中,向剪碎的羊肝中加入食盐的主要作用是 。将羊肝匀浆放入65 ℃水浴锅中水浴10 min可以去除部分杂质的主要实验原理是 。
(2)方法一的步骤①中加入洗涤剂的作用是 。方法三的步骤③中,离心后应取 。
(3)方法一、二获得的絮状物均带黄色,从DNA在细胞中的存在形式分析,杂质分子最可能是 ,其可用 试剂鉴定。
(4)要比较三种方法获得的絮状物中DNA的含量,请写出实验思路: 。
第1节 重组DNA技术的基本工具
[基础检查]
1.下列不属于质粒作为载体的理由的是 ( )
A.能自我复制
B.有一个至多个限制酶切割位点
C.具有标记基因
D.它是环状DNA
解析:质粒是双链环状DNA分子,能进行自我复制,A项不符合题意;基因工程的载体必须有一个至多个限制酶切割位点,便于与目的基因连接形成重组DNA分子,B项不符合题意;作为载体的质粒应带有特殊的标记基因,以便对重组DNA进行筛选,C项不符合题意;基因工程的载体不一定是环状形态的DNA分子,D项符合题意。
答案:D
2.下列关于下图所示黏性末端的说法,错误的是 ( )
甲
乙
丙
A.甲、乙、丙黏性末端是由各自不同的限制酶催化产生的
B.甲、乙可形成重组DNA分子,但甲、丙之间不能
C.DNA连接酶的作用位点在b处,催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键
D.切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
解析:三种限制酶识别的碱基序列不同,故限制酶种类也不同,A项正确;三个末端中甲、乙的碱基可互补配对,故二者可形成重组DNA分子,该重组DNA分子不具有切割甲的限制酶识别的碱基序列,故不能被切割甲的限制酶识别切割,B、D两项正确;b处表示氢键,而DNA连接酶的作用是使两个DNA片段之间的磷酸二酯键连接起来形成一个DNA分子,C项错误。
答案:C
3.下列叙述符合基因工程概念的是 ( )
A.加热致死的S型细菌和R型活细菌一起培养,得到S型活细菌
B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株
C.用紫外线照射青霉菌,使其DNA发生改变,通过筛选获得青霉素高产菌株
D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
解析:基因工程又叫重组DNA技术,是一种人为的操作过程。A项所述内容属于基因重组,但由于S型细菌的基因不是人为导入R型细菌的,故不属于基因工程的范畴,不符合题意;B项所述内容符合基因工程的概念,符合题意;C项所述内容属于诱变育种,不符合题意;D项所述内容外源基因导入细菌不是人为操作的,不属于基因工程的范畴,不符合题意。
答案:B
4.下列有关基因工程中限制酶的描述,正确的是 ( )
A.限制酶只能识别6个或8个脱氧核苷酸组成的序列
B.限制酶的活性受温度的影响
C.限制酶能识别和切割RNA
D.限制酶只能从原核生物中提取
解析:限制酶能够识别并切割双链DNA上特定的核苷酸序列,大多数限制酶能够识别6个核苷酸组成的序列,少数可以识别4个、8个或其他数量的核苷酸组成的序列;限制酶的化学本质是蛋白质,其活性受温度影响;限制酶只能识别和切割DNA;限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。
答案:B
5.下面是4种限制酶所识别的DNA分子序列和切割位点图(↓表示切割位点,切口为黏性末端),下列叙述正确的是 ( )
限制酶1:
限制酶2:
限制酶3:
限制酶4:
A.限制酶1和3切出的黏性末端相同
B.限制酶1、2、4识别的序列都由4个脱氧核苷酸组成
C.在使用限制酶的同时还需要解旋酶
D.限制酶1和2切出的DNA片段可通过T4 DNA 连接酶拼接
解析:限制酶1和3切出的黏性末端相同,都是—CTAG,A项正确;限制酶4识别的序列由6个脱氧核苷酸组成,B项错误;限制酶切割双链DNA分子时,不需要解旋酶,C项错误;限制酶1和2切出的DNA片段的黏性末端分别是—CTAG和—CATG,不能通过DNA连接酶拼接,D项错误。
答案:A
6.下列关于几种酶作用的叙述,错误的是 ( )
A.DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接
B.RNA聚合酶能与基因的特定位点结合,催化遗传信息的转录
C.一种限制酶能识别多种核苷酸序列,并切割出多种目的基因
D.DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链
解析:DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接,形成磷酸二酯键,A项正确;RNA聚合酶能与基因的特定位点(启动子)结合,催化遗传信息的转录,B项正确;一种限制酶只能特异性的识别一种核苷酸序列,体现了酶的专一性,C项错误;DNA分子复制时,DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链,D项正确。
答案:C
7.质粒是细菌中的有机分子,下列描述正确的是 ( )
A.质粒完全水解后最多可产生4种化合物
B.质粒能够自我复制
C.质粒中含有2个游离的磷酸基团
D.质粒是基因工程的工具酶
解析:质粒是一种具有自我复制能力的双链环状DNA分子,不含游离的磷酸基团,完全水解后最多可产生6种化合物,即脱氧核糖、磷酸、4种含氮碱基。质粒是基因工程的载体,不是工具酶。
答案:B
8.下列有关DNA连接酶的说法,正确的是 ( )
A.DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反,DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段“缝合”起来
B.DNA连接酶和DNA聚合酶一样能连接单链DNA片段
C.E.coli DNA连接酶可以连接有平末端的DNA片段,也能连接有黏性末端的DNA片段
D.T4 DNA连接酶只能连接有平末端的DNA片段
解析:DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反,DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段“缝合”起来,A项正确;DNA连接酶不能连接单链DNA片段,DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上,B项错误;E.coli DNA连接酶只能连接有黏性末端的DNA片段,C项错误;T4 DNA连接酶既可以连接有黏性末端的DNA片段,也可以连接有平末端的DNA片段,D项错误。
答案:A
9.下图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是 ( )
A.①②③④ B.①②④③
C.①④②③ D.①④③②
解析:限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂,因此①符合;DNA聚合酶用于DNA分子的复制,能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来,因此④符合;DNA连接酶能在具有相同末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,即将其“缝合”起来,因此②符合;解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开,因此③符合。
答案:C
10.(2021·广东)下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述,正确的是 ( )
A.用限制酶切割获得一个目的基因时得到2个切口,有2个磷酸二酯键被断开
B.限制酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大
C.序列-CATG↓-和-G↓GATCC-被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D.T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接
解析:用限制酶切割获得一个目的基因时得到2个切口,有4个磷酸二酯键被水解;限制酶识别序列越短,则该序列在DNA中出现的概率就越大;序列-CATG↓-和-G↓GATCC-被限制酶切出的黏性末端碱基数相同,都是4个;T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化黏性末端的连接,只有T4 DNA连接酶还可以连接平末端。
答案:B
11.下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图,请据图回答下列问题。
(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是 ,二者还具有其他共同点,如① ,② (写出两条即可)。
(2)若质粒DNA分子的切割末端为,则与之连接的目的基因切割末端应为 ;可使用 把质粒和目的基因连接在一起。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为 ,其作用是 。
(4)下列常在基因工程中用作载体的是 。
A.苏云金杆菌的抗虫基因
B.土壤农杆菌中的RNA分子
C.大肠杆菌的质粒
D.动物细胞的染色体
解析:(1)a代表的物质是拟核DNA,质粒是细胞质中的DNA分子,二者都是环状DNA分子,其共同点有能够自我复制、具有遗传效应、具有双螺旋结构等。(2)根据碱基互补配对原则,目的基因的切割末端应为;将目的基因与质粒连接在一起需要用到DNA连接酶。(3)质粒上的氨苄青霉素抗性基因是标记基因,可以用作重组DNA分子的鉴定和筛选。(4)大肠杆菌的质粒是基因工程中常用的载体。
答案:(1)DNA 能够自我复制 具有遗传效应
(2) DNA连接酶
(3)标记基因 供重组DNA分子的鉴定与筛选
(4)C
[拓展应用]
12.下列关于图示黏性末端的叙述,正确的是 ( )
①
②
③
④
A.①与③是由相同的限制酶切割产生的
B.DNA连接酶可催化①与③的连接
C.经限制酶切割形成④需要脱去2分子水
D.DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端
解析:①与③的黏性末端相同,但它们被识别的碱基序列不同,应是由不同的限制酶切割产生的,A项错误;由于①与③的黏性末端相同,所以DNA连接酶可催化①与③的连接,B项正确;限制酶切割获得④需要消耗2分子水,C项错误;DNA聚合酶作用于单个游离的脱氧核苷酸,D项错误。
答案:B
13.限制酶Mun Ⅰ和EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是和。下图表示目的基因和四种质粒,其中,质粒上箭头所指部位为酶的识别位点,阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是 ( )
A
B
C
D
解析:A项中用限制酶MunⅠ切割质粒后,不会破坏标记基因,而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端,适于作为图示目的基因的载体;B项中质粒没有标记基因,不适于作为图示目的基因的载体;C、D两项中质粒含有标记基因,但用限制酶切割后,标记基因会被破坏,因此不适于作为图示目的基因的载体。
答案:A
14.(2021·佛山)限制酶是一种核酸切割酶,可识别并切割DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。右上图所示为四种限制酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ以及Bgl Ⅱ的识别序列,箭头表示每种限制酶的特定切割位点,切割出来的DNA片段末端可以互补黏合的及其正确的末端互补序列应该为 ( )
A.BamHⅠ和EcoRⅠ;末端互补序列为-AATT-
B.BamHⅠ和HindⅢ;末端互补序列为-GATC-
C.EcoRⅠ和HindⅢ;末端互补序列为-AATT-
D.BamHⅠ和BglⅡ;末端互补序列为-GATC-
解析:BamHⅠ切割出的末端序列为GATC-,EcoRⅠ切割出的末端序列为AATT-,HindⅢ切割出的末端序列为AGCT-,BglⅡ切割出的末端序列为GATC-,BamHⅠ与BglⅡ切割出的末端序列一致,故只有D项所示两种限制酶所切割出来的DNA片段末端才能互补黏合,D项正确。
答案:D
15.(2021·珠海)CRISPR/Cas9是近年来生物学科研的热门技术,该技术源于细菌的一种防御机制。如图所示,当细菌感知到噬菌体侵入时,会通过gRNA识别噬菌体DNA,并通过Cas9蛋白切断目标DNA,从而起到防御作用。下列关于该机制的叙述错误的是 ( )
A.gRNA与目标DNA结合片段中最多含有8种核苷酸
B.噬菌体DNA与gRNA的结合遵循碱基互补配对原则
C.Cas9蛋白可破坏DNA分子的磷酸二酯键
D.光学显微镜下可观察到图中的现象
解析:gRNA为RNA,最多含有4种核糖核苷酸,DNA含有4种脱氧核苷酸,故gRNA与目标DNA结合片段中最多含有8种核苷酸;噬菌体DNA与gRNA的结合具有特异性,在结合时遵循碱基互补配对原则;“Cas9蛋白切断目标DNA”,其作用相当于限制酶,故Cas9蛋白可破坏DNA分子的磷酸二酯键;该过程属于分子水平的改变,光学显微镜下无法观察到该现象。
答案:D
16.1型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原,能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱,从而缓解症状。科研人员利用1型糖尿病模型小鼠进行动物实验,使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原,为此构建重组表达载体,技术路线如图所示。请据图回答下列问题。
(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达,需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析,转录形成的mRNA中,该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有 个。
(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列,确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是 (不定项)。
A.引入的短肽编码序列不能含终止子序列
B.引入的短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C.引入的短肽不能改变A链氨基酸序列
D.引入的短肽不能改变原人胰岛素抗原性
(3)在重组表达载体中,限制酶SacⅠ和XbaⅠ仅有图示的切割位点。用这两种限制酶充分切割重组表达载体,可形成 种DNA片段。
(4)检测转化的乳酸菌发现,信号肽—重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测,信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是 。
(5)用转化的乳酸菌饲喂1型糖尿病模型小鼠一段时间后,小鼠体内出现人胰岛素抗原,能够特异性识别它的免疫细胞有 (不定项)。
A.B细胞 B.T细胞
C.吞噬细胞 D.浆细胞
解析:(1)比较改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列,其中有7个核苷酸发生了替换,则其转录形成的mRNA中,也会有7个核苷酸发生改变,1个密码子由mRNA上3个连续的碱基组成,由此可知,该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。(2)要确保等比例表达A、B肽链,则需A、B肽链一起合成,即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码序列两端,在其中间加入一段短肽编码序列后,序列中间不能出现终止子,所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子,同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能。(3)在重组表达载体中,限制酶SacⅠ和XbaⅠ的切割位点分别有2个和1个,当将重组表达载体用限制酶SacⅠ和XbaⅠ充分切割后,会形成3个缺口,得到3种不同的DNA片段。(4)乳酸菌属于原核生物,信号肽在核糖体上合成后,到细胞质基质中加工,再将其运输到细胞膜上,进而转移到细胞壁。(5)人胰岛素抗原能引起小鼠的特异性免疫。在特异性免疫过程中,B细胞和T细胞能特异性识别抗原;吞噬细胞能识别抗原,但不是特异性识别;浆细胞不能识别抗原。
答案:(1)6 (2)ABCD (3)3 (4)核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁 (5)AB
探究实践课:DNA的粗提取与鉴定
一、实验目的
1.了解DNA的物理和化学性质,理解DNA粗提取和鉴定的原理。
2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。
二、实验原理
1.DNA的粗提取。
利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异,提取DNA,去除其他成分。
2.DNA与蛋白质在物理、化学性质方面的差异。
比较项目 DNA 蛋白质
溶解性 浓度为2 mol/L的NaCl溶液中 ①溶解 ②部分析出
浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中 析出 溶解
酒精溶液中 ③析出 溶解
耐受性 蛋白酶 无影响 ④水解
高温 80 ℃以上 变性 不能耐受 60~80 ℃ 的高温
3.DNA的鉴定。
DNA+二苯胺蓝色。
三、材料用具
1.材料。
新鲜洋葱、研磨液、体积分数为95%的酒精、浓度为2 mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。研磨液和二苯胺试剂的配制方法参见教科书附录2。
2.用具。
烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、陶土网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
四、实验过程
(
在漏斗中垫上
纱布
过滤洋葱研磨液
,4 ℃冰箱中静置后取上清
液
;或将洋葱研磨液倒入
塑料离心管
中离心,取上清液液;或将洋葱研磨液倒入塑料离心管中离心,取上清液
)破碎细胞——称取洋葱,切碎,放入研钵,倒入研磨液,充分研磨
去除杂质——
(
在上清液中加入体积相等的、预冷的
酒精溶液
,静置
2~3 min
,溶液中出现的
白色丝状物
就是粗提取的DNA
)
DNA的析出——
(
在溶有DNA的NaCl溶液中加入
二苯胺试剂
,混合均匀后,将试管置于沸水中加热5 min
)
DNA的鉴定——
五、实验操作
1.操作提醒。
(1)研磨液的作用为溶解并提取DNA;体积分数为95%的酒精的作用为析出DNA,使DNA与杂质分开;浓度为2 mol/L的NaCl溶液的作用为溶解丝状物用于DNA的鉴定。
(2)在将待鉴定的提取物加入浓度为2 mol/L的NaCl溶液中溶解时,需要不断搅拌以增加溶解的DNA的量,建议搅拌3 min以上。
(3)二苯胺试剂要现配现用,以保证实验效果。同时,加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5 min及以上,且要等到冷却后再观察效果,这样才可以观察到较为明显的颜色反应。
2.实验报告。
实验时间 某年某月某日。 实验地点 实验室。 实验环境 常温、常压等。
实验结果 实验记录 提取到白色丝状的物质,用二苯胺试剂鉴定后呈现蓝色。
实验结论 经鉴定,提取到的白色丝状物质为DNA。
实验反思 成功之处 研磨充分,提取到的DNA量大,显色明显。
不足之处 体积分数为95%的酒精忘记预冷,导致加入酒精后未看到白色丝状物,将混合后的烧杯放入 4 ℃冰箱约2 h后,看见白色絮状物。
3.实验拓展。
若利用鸡血作为实验材料进行“DNA的粗提取”,请你概述相关实验过程。
提示:向鸡血中加入一定量的蒸馏水,使血细胞破裂,释放核物质,收集滤液→向滤液中加入浓度为2 mol/L 的NaCl溶液,过滤去除不溶的杂质→调节NaCl溶液的浓度为0.14 mol/L,析出DNA,过滤去除溶液中的杂质→加入浓度为2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA→加入等体积预冷的酒精溶液(体积分数为95%),静置2~3 min,出现的白色丝状物质即为DNA。
实验评价
1.玻璃棒搅拌出的较纯净的DNA的颜色以及DNA遇二苯胺试剂(沸水浴)显现的颜色分别是 ( )
A.黄色、紫色
B.白色、砖红色
C.白色、蓝色
D.蓝色、砖红色
解析:DNA在体积分数为95%的冷酒精中析出时的颜色为白色,DNA遇二苯胺试剂(沸水浴)显现的颜色为蓝色。
答案:C
2.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是 ( )
A.利用DNA能溶于酒精溶液,而蛋白质不溶于酒精溶液的特性,可将DNA与蛋白质分离
B.利用高温能使DNA变性,却对蛋白质没有任何影响的特性,可将DNA与蛋白质分离
C.利用DNA在浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最大的特点,可将DNA与蛋白质分离
D.在DNA滤液中加入嫩肉粉,通过木瓜蛋白酶的作用,可将DNA与蛋白质分离
解析:DNA不溶于酒精,而某些蛋白质溶于酒精,A项错误;蛋白质对温度的耐受性比DNA更差,因此更容易变性,B项错误;DNA在浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最小,而蛋白质在该浓度的NaCl溶液中溶解度较大,因此可将DNA与蛋白质分离,C项错误;嫩肉粉中的木瓜蛋白酶只能催化蛋白质水解,而对DNA没有影响,因此,可将DNA与蛋白质分离,D项正确。
答案:D
3.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的操作及原理的叙述,正确的是 ( )
A.用蒸馏水使家兔的红细胞涨破以获取含DNA的滤液
B.向菜花组织中加入蒸馏水并搅拌可释放核DNA
C.控制NaCl溶液的浓度可以实现去除杂质的目的
D.DNA在酒精溶液中析出时,用玻璃棒轻缓搅拌,会使析出的DNA量减少
解析:DNA主要存在于细胞核中,哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核,因此家兔的红细胞不能作为提取DNA的材料。菜花细胞为植物细胞,有细胞壁保护,加蒸馏水不会吸水涨破。由于DNA和蛋白质等物质在NaCl溶液中的溶解度不同,因此可以通过控制NaCl溶液的浓度来去除杂质。DNA在酒精溶液中析出时,用玻璃棒轻缓搅拌,以便获得较完整的DNA。
答案:C
4.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是 ( )
选项 试剂 操作 作用
A 柠檬酸 钠溶液 与鸡血混合 防止血液凝固
B 蒸馏水 与鸡血细胞液混合 保持细胞形状
C 蒸馏水 加入溶有DNA的NaCl溶液中 析出蛋白质
D 预冷的 酒精 加入过滤后含DNA的NaCl溶液中 产生特定的颜 色反应
解析:柠檬酸钠与鸡血混合的作用是防止血液凝固,A项正确;蒸馏水与鸡血细胞液混合的目的是使血细胞吸水涨破,释放出核物质,B项错误;将蒸馏水加入溶有DNA的NaCl溶液中,NaCl溶液的浓度降低,蛋白质的溶解度增大,C项错误;将预冷的酒精加入过滤后含DNA的NaCl溶液中,目的是进一步析出DNA,D项错误。
答案:A
5.研究人员比较了不同储藏条件对棉叶DNA纯度及提取率(提取率越高,获得的DNA越多)的影响,实验结果见下图。下列有关叙述正确的是 ( )
A.提纯DNA时,加入酒精可以去除不溶的蛋白质、酚类等物质
B.从新鲜棉叶中提取的DNA纯度最高,提取的DNA的量也最多
C.木瓜蛋白酶和不同浓度的NaCl溶液均可用于提纯DNA
D.用二苯胺试剂鉴定,颜色最深的是冷冻7 d 处理后提取的DNA
解析:提纯DNA时,加入酒精,可以去除可溶的蛋白质、酚类等物质,A项错误;据题图可知,从新鲜棉叶中提取的DNA纯度最高,但提取的DNA的量并不是最多,B项错误;木瓜蛋白酶可去除蛋白质,DNA在浓度为0.14 mol/L 的NaCl溶液中溶解度最低,在浓度为2 mol/L 的NaCl溶液中溶解度高,因此木瓜蛋白酶和不同浓度的NaCl溶液均可用于提纯DNA,C项正确;冷冻3 d处理后提取的DNA量最多,用二苯胺试剂鉴定时颜色最深,D项错误。
答案:C
6.下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。请分析并回答下列问题。
(1)图中实验材料A可以是 等,研磨前加入的B应该是 。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后, 再向滤液中加入体积分数为95%的预冷的酒精的目的是 。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中,将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中,经搅拌后过滤,获得如下表所示的4种滤液,其中含DNA最少的是滤液 。
编号 溶液名称 操作 获得溶液
1 研磨液 搅拌研磨 后过滤 滤液E
2 浓度为2 mol/L 的NaCl溶液 搅拌后过滤 滤液F
3 浓度为0.14 mol/L 的NaCl溶液 搅拌后过滤 滤液G
4 预冷的体积分数为 95%的酒精溶液 搅拌后过滤 滤液H
(4)DNA鉴定的原理是 。
解析:(1)选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时,要在切碎的材料中加入一定的研磨液,充分地搅拌和研磨。(2)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA和蛋白质。(3)DNA不溶于冷酒精,因此在4种滤液中含DNA最少的是滤液H。(4)DNA鉴定的原理是在沸水浴加热条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
答案:(1)洋葱(或菜花) 研磨液(2)溶解蛋白质,初步分离DNA和蛋白质 (3)H(4)在沸水浴加热条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
7.下图是设计DNA鉴定实验的试管1(对照组)与试管2(实验组)示意图,其中正确的是 ( )
A.
B.
C.
D.
解析:DNA的鉴定实验组应加入NaCl溶液、二苯胺试剂、DNA,实验条件是沸水浴加热,结果是溶液出现浅蓝色;对照组应加入NaCl溶液、二苯胺,实验条件是沸水浴加热,结果是无浅蓝色。
答案:B
8.下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验中涉及的两个操作装置。叙述正确的是 ( )
甲
乙
A.图甲的烧杯和图乙的试管中所用溶剂都为NaCl溶液,但二者浓度不同
B.图乙试管经少许加热后,即可观察到一支试管中的溶液明显变蓝,另一支试管中的溶液不变蓝
C.图甲操作需用玻璃棒迅速搅拌以使DNA成为絮状沉淀,并缠绕在玻璃棒上
D.图乙操作中所用的二苯胺试剂需现配现用,以达到较好的鉴定效果
解析:图甲为在体积分数为95%的冷酒精中析出DNA,图乙的试管中所用溶剂为NaCl溶液;DNA鉴定需要进行沸水浴;图甲操作需用玻璃棒缓慢搅拌,避免DNA断裂;二苯胺容易被氧化,图乙操作中所用的二苯胺试剂需现配现用,以达到较好的鉴定效果。
答案:D
9.下图是某中学生物学兴趣小组进行的DNA粗提取实验,其中SDS(一种表面活性剂)除了能瓦解细胞膜和核膜,还能与脂质和蛋白质结合。当SDS遇到钾离子时,钾离子可以置换SDS中的钠离子,产生不溶于水的PDS沉淀。请分析回答下列问题。
(1)实验中,向剪碎的羊肝中加入食盐的主要作用是 。将羊肝匀浆放入65 ℃水浴锅中水浴10 min可以去除部分杂质的主要实验原理是 。
(2)方法一的步骤①中加入洗涤剂的作用是 。方法三的步骤③中,离心后应取 。
(3)方法一、二获得的絮状物均带黄色,从DNA在细胞中的存在形式分析,杂质分子最可能是 ,其可用 试剂鉴定。
(4)要比较三种方法获得的絮状物中DNA的含量,请写出实验思路: 。
解析:(1)在DNA粗提取实验中,向剪碎的羊肝中加入食盐的主要作用是溶解DNA。蛋白质和DNA对高温的耐受性不同,即蛋白质在65 ℃高温下会变性,而DNA能耐受这一温度,因此将羊肝匀浆放入65 ℃水浴锅中水浴10 min可以去除蛋白质类的杂质。(2)方法一的步骤①中加入洗涤剂,可以瓦解细胞膜和核膜。方法三的步骤③中,SDS在氯化钾溶液中形成不溶于水的PDS沉淀,又因为SDS能瓦解细胞膜、核膜,并能与脂质和蛋白质结合,应该将该沉淀物去除,因此离心后应该取含有DNA的上清液。(3)细胞中的DNA主要存在于染色体上,染色体的主要成分是DNA和蛋白质,因此该杂质最可能是蛋白质,可以用双缩脲试剂进行鉴定。(4)比较三种方法获得的絮状物中DNA的含量,可以利用二苯胺试剂进行鉴定。实验思路是分别取等量的三种絮状物,并用等量的浓度为2 mol/L NaCl溶液溶解;再向各试管中加入等量的二苯胺试剂并置于沸水中加热;比较三支试管中蓝色的深浅。
答案:(1)溶解DNA 蛋白质在65 ℃高温下会变性,而DNA能耐受这一温度 (2)瓦解细胞膜和核膜 上清液 (3)蛋白质 双缩脲 (4)分别取等量的三种絮状物,并用等量的浓度为2 mol/L的NaCl溶液溶解;再向各试管中加入等量的二苯胺试剂并置于沸水中加热;比较三支试管中蓝色的深浅
