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第3章 基因工程
探究一 目的基因的筛选与获取
素养点拨
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海
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●
●
●
●
目的基因
目的基因的
已知序列
筛选与获取
筛选方法
基因文库
原理
PCR
条件
过程
基因表达载
组成
体的构建
构建过程
基因工程的基
本操作程序
植物细胞
花粉管通道法、农杆菌转化法
将目的基因导
入受体细胞
动物细胞
显微注射
微生物细胞
Ca2+转化法
分子杂交
分子水平
目的基因的
抗原一抗体杂交
检测与鉴定
个体水平
抗虫、抗病接种实验第2节 基因工程的基本操作程序
[基础检查]
1.下列关于基因工程的叙述中,正确的是 ( )
①基因工程打破了物种与物种之间的界限 ②基因治疗是基因工程技术的应用 ③载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞 ④所需要的工具酶有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和运载体 ⑤常使用的运载体有大肠杆菌、质粒和动植物病毒等
A.②③⑤ B.①②③
C.①②⑤ D.①③④
2.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ( )
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR扩增目的基因 ③逆转录 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A.①② B.②③ C.③④ D.①③
3.(2021·东莞)PCR是一项体外扩增DNA的技术,需在反应溶液中添加模板、原料、酶等物质,通过加热(90 ℃以上)使模板DNA解旋,冷却后在一定温度(72 ℃左右)下利用DNA聚合酶合成子代脱氧核苷酸链,如此循环往复,可使特定DNA片段以指数形式扩增。与体内DNA复制相比,有关PCR技术叙述错误的是 ( )
A.以DNA分子的一条链作为模板
B.添加的DNA聚合酶热稳定性较高
C.反应溶液中无须额外添加解旋酶
D.新合成的DNA分子会作为复制模板
4.(2021·佛山)实时荧光RT-PCR技术可快速检测新型冠状病毒的核酸。检测原理如图所示,探针是含荧光基团并有特定序列的DNA单链。下列说法错误的是 ( )
病毒RNA单链DNA杂交DNADNA(发出荧光)
A.逆转录和杂交DNA扩增所需的原料相同
B.逆转录、扩增和分子杂交中碱基配对情况相同
C.病毒RNA的遗传信息通过逆转录传递给单链DNA
D.逆转录和杂交DNA扩增所需酶种类不同
5.将目的基因导入大肠杆菌细胞和小鼠受精卵,常用的方法分别是 ( )
A.显微注射,农杆菌转化法
B.农杆菌转化法,花粉管通道法
C.Ca2+转化法,显微注射
D.基因枪法,显微注射
6.下图为基因工程的部分过程示意图,甲~丁代表各不同阶段参与的成分。下列叙述正确的是 ( )
A.甲可以是细菌的质粒
B.乙是某种激素分子
C.丙可以是植物的RNA分子
D.丁为抗体分子
7.下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述,正确的是 ( )
A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA逆转录获得
B.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点
C.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
8.下列技术依据碱基互补配对原理的是 ( )
①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译产生蛋白质 ④通过观察害虫吃棉叶是否死亡判断棉花是否被赋予了抗虫特性
A.①②③④ B.①②
C.①②④ D.①②③
9.利用外源基因在受体细胞中表达,可生产人类所需要的产品。下列能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是 ( )
A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
10.(2021·佛山)新型冠状病毒由RNA与蛋白质等成分构成。通过核酸检测可快速准确地发现人群中的传染源,所用的检测原理或方法是 ( )
A.核酸易与一些碱性染料结合产生颜色反应,即可确定有新型冠状病毒
B.用水解法处理采样,因变量是测定能否产生基本单位核糖核苷酸
C.用同位素标记新型冠状病毒的RNA或蛋白质,能鉴别遗传物质
D.用有特异性碱基序列的荧光探针进行检测,测定荧光产生的情况
11.下图为某种质粒载体的简图,小箭头所指部位分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的切割位点,AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR为四环素抗性基因,P为启动子,T为终止子,ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的切割位点。请分析回答下列问题。
(1)将含有目的基因的DNA片段与质粒分别用EcoR Ⅰ切割,产物用DNA连接酶进行连接后,其中由两个DNA片段连接形成的产物有 、
、 三种。
(2)在上述实验中,为了防止目的基因和质粒用限制酶切割后产生的末端发生任意连接,应选用的限制酶是 。
[拓展应用]
12.(2023·新课标Ⅱ卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 ( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coliDNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用 E.coliDNA连接酶连接
13.PCR一般要经过30多次循环,从第二次循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将 ( )
A.仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B.与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C.同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸
D.无须与引物结合,在酶的作用下从头合成子链
14.某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp),先用限制酶a切割,再把得到的产物用限制酶b切割,得到的DNA片段大小如下表。限制酶a、b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法正确的是 ( )
酶a切割产物(bp) 酶b再次切割产物(bp)
2 100,1 400,1 000,500 1 900,200,800,600,1 000,500
A.该DNA分子中,酶a与酶b分别识别了3个和2个序列
B.酶a与酶b切出的黏性末端不能互相连接
C.酶a与酶b切断的化学键不相同
D.若酶a切割与该DNA序列相同的质粒,得到的切割产物为4种
15.(2021·东莞)下图是用基因工程技术培育抗棉铃虫的转基因棉花过程,有关该过程叙述错误的是 ( )
A.抗虫基因的表达产物为蛋白质
B.抗虫基因的插入引起的变异属于基因重组
C.用Ca2+处理农杆菌利于重组DNA分子的导入
D.通过Ti质粒上的抗性基因筛选试管苗
16.(2023·广东)为评估外源基因Vgb在菊花中的稳定性以及对生态环境的影响,研究人员在种植转基因菊花的第二年,随机选取转基因菊花株系及周边非转基因菊花和各种杂草,提取DNA。根据Vgb设计特异性引物进行PCR扩增,电泳结果如图。回答下列问题。
(1)将外源基因Vgb整合到菊花细胞需要先构建基因表达载体,构建基因表达载体时,需要使用的酶有 。重组载体进入菊花细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。构建基因表达载体时,外源基因Vgb插在启动子的上游,则在菊花细胞中检测不到表达产物,主要原因是 。
(2)设计引物是PCR技术的关键步骤之一,根据Vgb设计特异性引物进行PCR扩增,某同学设计的一组引物(只标注了部分碱基序列)为,此引物设计 (填“合理”或“不合理”),理由是 。
(3)设置空白对照的目的是 。对于外源基因Vgb在菊花中的稳定性以及对周边植物的影响方面,图中实验结果表明 。
探究实践课:DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验目的
1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理。
2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
二、实验原理
1.解旋。
PCR利用了DNA的 原理,通过调节 来控制DNA双链的解聚与结合。
2.鉴定。
(1)DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着 移动(即电泳)。
(2)PCR的产物一般通过 来鉴定。
(3)凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
三、实验材料
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置、4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
四、探究过程
1.DNA片段的扩增。
准备:用 按照PCR反应体系的配方或PCR试剂盒的说明书,在微量离心管中依次加入各组分
离心:待所有的组分都加入后,盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里,离心约10 s,使反应液集中在 .
扩增:设置好PCR仪的 ,将装有反应液的微量离心管放入 中进行反应
2.电泳鉴定。
配制琼脂糖溶液:根据 ,用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液,一般配制质量分数为 的琼脂糖溶液,加热至琼脂糖熔化。稍冷却后,加入适量的 混匀
制备琼脂糖凝胶:将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具,并插入合适大小的梳子,以形成 .
填充电泳槽:待凝胶溶液完全凝固后,小心拔出梳子,取出凝胶放入电泳槽内,并将 加入电泳槽中, 没过凝胶1 mm为宜
加PCR产物:将扩增得到的PCR产物与 (内含指示剂)混合,再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的 内。留一个加样孔加入指示分子大小的 .
电泳:接通电源,根据 来设定电压,一般为1~
5 V/cm,待 时,停止电泳
结果分析:取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
五、实验操作
1.操作提醒。
(1)为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)实验用到的酶和缓冲液应分装成小份,并在-20 ℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱中拿出,放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。
(4)待凝胶溶液完全凝固后(一般需要20~30 min)才能拔出梳子,方向一定要垂直向上,不要弄坏加样孔。
(5)凝胶放入电泳槽后,将电泳缓冲液加入电泳槽时应确保加样孔内充满电泳缓冲液且没有气泡,电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
(6)本实验部分试剂对人体有害,操作时一定要穿好实验服、戴好一次性手套。
2.实验报告。
实验时间 。 实验地点 。 实验环境 。
实验结果 实验记录
实验结论 。
实验反思 成功之处 。
不足之处 。
3.实验拓展。
你进行电泳鉴定的结果是几条条带 如果不止一条条带,请分析产生这个结果的可能原因。
实验评价
1.PCR控制DNA的解聚与结合是利用了DNA的 ( )
A.特异性 B.稳定性
C.热变性 D.多样性
2.使用PCR仪的具体实验操作顺序应为 ( )
①设计好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分③用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心,使反应液集中在离心管底部
A.②③⑤④① B.①⑤③②④
C.②③⑤①④D.④②⑤③①
3.下图表示PCR扩增的产物,则它是哪次循环的产物 ( )
A.第一次循环 B.第二次循环
C.第三次循环 D.第四次循环
4.下图为DNA变性和复性示意图,下列相关说法正确的是 ( )
A.向左的过程为加热(90~100 ℃)变性的过程
B.向右的过程是DNA双链迅速制冷复性
C.变性与生物体内的解旋过程的实质相同
D.图中左侧DNA片段共有4个游离的磷酸基团、4个3'端
5.在PCR扩增DNA的实验中,根据设计,一分子DNA经30次循环后,应得到约230个DNA分子,但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因可能是 ( )
①循环次数不够 ②Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制 ③引物不能与亲链结合 ④系统设计欠妥
A.①②③ B.①②④
C.①③④ D.②③④
6.下列有关PCR实验操作的叙述,错误的是 ( )
A.在向微量离心管中添加各种试剂时,只需要一个枪头
B.离心管的盖子一定要盖严
C.用手指轻弹离心管侧壁
D.离心的目的是使反应液集中在离心管的底部
7.若用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是 ( )
A.图中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
8.(2021·天津)下列有关电泳的叙述,错误的是 ( )
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时,带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
9.(2022·辽宁)染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白,对得到的DNA片段进行凝胶电泳,结果如图所示。若先将染色质中的蛋白质去掉后用同样的非特异性核酸酶处理,则得到随机长度的DNA片段。据此分析,下列有关叙述错误的是 ( )
A.凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来
B.染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用
C.构成核小体的基本单位是脱氧核糖核苷酸
D.在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关
10.现有一长度为3 000 碱基对(bp)的线性 DNA 分子,用限制性内切核酸酶酶切后,进行凝胶电泳,使降解产物分开。用酶 H 单独酶切,结果如图 1。用酶 B 单独酶切,结果如图 2。用酶 H 和酶 B 同时酶切,结果如图 3。该 DNA 分子的结构及其酶切图谱是 ( )
A.
B.
C.
D.
11.PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术,下图表示合成过程,请据图分析回答下列问题。
(1)A过程高温使DNA变性解旋,对该过程的叙述,正确的是 。
A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键
B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键
C.该过程不需要解旋酶的作用
D.该过程与人体细胞内的过程完全相同
(2)C过程要用到的酶是 。这种酶在高温下仍保持活性,因此在PCR扩增时可以 加入, (填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除需要提供酶外,还需要满足的基本条件有 。
(3)如果模板DNA分子共有a个碱基对,其中含有胞嘧啶m个,那么该DNA复制10次,需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个。
(4)PCR中由碱基错配引起的变异属于 。假设对一个DNA分子进行扩增,第一次循环时一条模板链上发生碱基错配,之后正常配对,则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段,与原DNA相应片段相同的占 。
第2节 基因工程的基本操作程序
[基础检查]
1.下列关于基因工程的叙述中,正确的是 ( )
①基因工程打破了物种与物种之间的界限 ②基因治疗是基因工程技术的应用 ③载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞 ④所需要的工具酶有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和运载体 ⑤常使用的运载体有大肠杆菌、质粒和动植物病毒等
A.②③⑤ B.①②③
C.①②⑤ D.①③④
解析:基因工程的优点是能定向地改变生物的性状,突破了物种之间的生殖隔离界限,可用于基因治疗;载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞;运载体不是工具酶;常使用的运载体是质粒、噬菌体和动植物病毒等,大肠杆菌不能作为运载体。
答案:B
2.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ( )
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR扩增目的基因 ③逆转录 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A.①② B.②③ C.③④ D.①③
解析:PCR的原理是DNA半保留复制,即将双链DNA之间的氢键打开,变成单链DNA,作为反应的模板,②需要;逆转录则是以目的基因转录出的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下,先形成互补的单链DNA,再合成双链DNA,③需要;①④则均不需要模板。
答案:B
3.(2021·东莞)PCR是一项体外扩增DNA的技术,需在反应溶液中添加模板、原料、酶等物质,通过加热(90 ℃以上)使模板DNA解旋,冷却后在一定温度(72 ℃左右)下利用DNA聚合酶合成子代脱氧核苷酸链,如此循环往复,可使特定DNA片段以指数形式扩增。与体内DNA复制相比,有关PCR技术叙述错误的是 ( )
A.以DNA分子的一条链作为模板
B.添加的DNA聚合酶热稳定性较高
C.反应溶液中无须额外添加解旋酶
D.新合成的DNA分子会作为复制模板
解析:PCR的原理是DNA复制,以DNA分子的两条链分别作为模板。
答案:A
4.(2021·佛山)实时荧光RT-PCR技术可快速检测新型冠状病毒的核酸。检测原理如图所示,探针是含荧光基团并有特定序列的DNA单链。下列说法错误的是 ( )
病毒RNA单链DNA杂交DNADNA(发出荧光)
A.逆转录和杂交DNA扩增所需的原料相同
B.逆转录、扩增和分子杂交中碱基配对情况相同
C.病毒RNA的遗传信息通过逆转录传递给单链DNA
D.逆转录和杂交DNA扩增所需酶种类不同
解析:逆转录和杂交DNA扩增的产物都是DNA,故所需的原料都是脱氧核苷酸;逆转录碱基配对原则是U—A、A—T、C—G、G—C,扩增和分子杂交中碱基配对原则是T—A、A—T、C—G、G—C;病毒RNA的遗传信息传递给单链DNA,该过程叫逆转录;逆转录需要逆转录酶,杂交DNA扩增所需酶是DNA聚合酶。
答案:B
5.将目的基因导入大肠杆菌细胞和小鼠受精卵,常用的方法分别是 ( )
A.显微注射,农杆菌转化法
B.农杆菌转化法,花粉管通道法
C.Ca2+转化法,显微注射
D.基因枪法,显微注射
解析:大肠杆菌作为受体细胞,一般用Ca2+处理,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态;对于动物细胞来说,常用的方法是显微注射。
答案:C
6.下图为基因工程的部分过程示意图,甲~丁代表各不同阶段参与的成分。下列叙述正确的是 ( )
A.甲可以是细菌的质粒
B.乙是某种激素分子
C.丙可以是植物的RNA分子
D.丁为抗体分子
解析:甲、乙、丙、丁分别表示质粒、限制酶、目的基因、DNA连接酶。
答案:A
7.下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述,正确的是 ( )
A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA逆转录获得
B.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点
C.借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
解析:人肝细胞中胰岛素基因不表达,因而不存在胰岛素mRNA;复制原点是基因表达载体复制的起点,而胰岛素基因表达的起点是启动子;借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来;启动子与RNA聚合酶结合启动转录过程,终止密码子是翻译的终止信号。
答案:C
8.下列技术依据碱基互补配对原理的是 ( )
①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因 ②检测目的基因是否转录出了mRNA ③检测目的基因是否翻译产生蛋白质 ④通过观察害虫吃棉叶是否死亡判断棉花是否被赋予了抗虫特性
A.①②③④ B.①②
C.①②④ D.①②③
解析:检测目的基因是否翻译产生蛋白质采用抗原—抗体杂交,③不符合题意;通过用棉叶饲喂害虫判断棉花是否被赋予了抗虫特性,属于个体水平的检测,④不符合题意。
答案:B
9.利用外源基因在受体细胞中表达,可生产人类所需要的产品。下列能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是 ( )
A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
解析:基因表达的产物是蛋白质,因此,只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达。
答案:D
10.(2021·佛山)新型冠状病毒由RNA与蛋白质等成分构成。通过核酸检测可快速准确地发现人群中的传染源,所用的检测原理或方法是 ( )
A.核酸易与一些碱性染料结合产生颜色反应,即可确定有新型冠状病毒
B.用水解法处理采样,因变量是测定能否产生基本单位核糖核苷酸
C.用同位素标记新型冠状病毒的RNA或蛋白质,能鉴别遗传物质
D.用有特异性碱基序列的荧光探针进行检测,测定荧光产生的情况
解析:碱性染料可以鉴别核酸,但不能精确判断是否为新型冠状病毒的核酸;即使测定出水解产物中含有核糖核苷酸,也只能说明其含有RNA,但不能确定是否为新型冠状病毒的RNA;用同位素标记新型冠状病毒的RNA或蛋白质,可以确定新型冠状病毒的遗传物质,但不能在人群中确定个体是否被新型冠状病毒感染;不同核酸的碱基排列顺序不同,因此用有特异性碱基序列的荧光探针进行检测,利用碱基互补配对的原则测定荧光产生的情况,可以用于检测人群中的传染源。
答案:D
11.下图为某种质粒载体的简图,小箭头所指部位分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的切割位点,AmpR为氨苄青霉素抗性基因,TetR为四环素抗性基因,P为启动子,T为终止子,ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的切割位点。请分析回答下列问题。
(1)将含有目的基因的DNA片段与质粒分别用EcoR Ⅰ切割,产物用DNA连接酶进行连接后,其中由两个DNA片段连接形成的产物有 、
、 三种。
(2)在上述实验中,为了防止目的基因和质粒用限制酶切割后产生的末端发生任意连接,应选用的限制酶是 。
解析:(1)将含有目的基因的DNA片段与质粒分别用EcoRⅠ切割后,所产生的黏性末端相同,用DNA连接酶处理后,不同的片段随机结合,其中由两个DNA片段连接可形成三种不同的连接物,即目的基因—质粒连接物、质粒—质粒连接物、目的基因—目的基因连接物。(2)由图示和题干信息可知,同时运用EcoRⅠ和BamHⅠ可有效防止末端任意连接的发生。
答案:(1)目的基因—质粒连接物 质粒—质粒连接物 目的基因—目的基因连接物 (2)EcoRⅠ和BamHⅠ
[拓展应用]
12.(2023·新课标Ⅱ卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是 ( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coliDNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用 E.coliDNA连接酶连接
解析:构建基因表达载体时,为避免目的基因和质粒自身环化或反向连接,应选择两种酶进行切割,A项不符合题意;据图可知,限制酶3切割后的末端是平末端,而限制酶1切割后的末端是黏性末端,若用两种酶分别切割质粒和目的基因,会导致DNA连接酶无法连接,B项不符合题意;质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,可避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,且二者均形成黏性末端,此后再用T4 DNA连接酶连接,可构建重组表达载体,效率较高,C项符合题意; 限制酶4会破坏质粒上的标记基因(抗生素抗性基因),故不能选择该酶进行切割,D项不符合题意。
答案:C
13.PCR一般要经过30多次循环,从第二次循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将 ( )
A.仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B.与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C.同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸
D.无须与引物结合,在酶的作用下从头合成子链
解析:当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时,此单链引物端为5'端,因此与它互补的子链应从另一端开始合成,即与引物Ⅱ结合延伸DNA子链。
答案:B
14.某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp),先用限制酶a切割,再把得到的产物用限制酶b切割,得到的DNA片段大小如下表。限制酶a、b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法正确的是 ( )
酶a切割产物(bp) 酶b再次切割产物(bp)
2 100,1 400,1 000,500 1 900,200,800,600,1 000,500
A.该DNA分子中,酶a与酶b分别识别了3个和2个序列
B.酶a与酶b切出的黏性末端不能互相连接
C.酶a与酶b切断的化学键不相同
D.若酶a切割与该DNA序列相同的质粒,得到的切割产物为4种
解析:酶a切完有4个不同的片段,识别了3个序列,而酶b只切了2 100和1 400两个片段,则识别了2个序列;酶a与酶b切出的黏性末端相同,用DNA连接酶可以将它们连接起来;限制酶切割的化学键都是磷酸二酯键;质粒是环状DNA分子,与线性DNA相同碱基序列的质粒含有3个酶a的切割位点,则其被酶a切割后可以得到3种切割产物。
答案:A
15.(2021·东莞)下图是用基因工程技术培育抗棉铃虫的转基因棉花过程,有关该过程叙述错误的是 ( )
A.抗虫基因的表达产物为蛋白质
B.抗虫基因的插入引起的变异属于基因重组
C.用Ca2+处理农杆菌利于重组DNA分子的导入
D.通过Ti质粒上的抗性基因筛选试管苗
解析:抗虫基因的表达包括转录和翻译两个过程,产物是蛋白质;抗虫基因被插入到受体细胞的染色体DNA中,该过程属于基因重组;用Ca2+处理农杆菌会使农杆菌处于容易吸收外来DNA分子的状态,因此利于重组DNA分子的导入;通过Ti质粒上的抗性基因筛选含有目的基因的受体细胞,而试管苗的筛选需要用个体生物学鉴定的方法,即用抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫,观察其存活情况,来鉴定棉花幼苗是否具有抗虫特性。
答案:D
16.(2023·广东)为评估外源基因Vgb在菊花中的稳定性以及对生态环境的影响,研究人员在种植转基因菊花的第二年,随机选取转基因菊花株系及周边非转基因菊花和各种杂草,提取DNA。根据Vgb设计特异性引物进行PCR扩增,电泳结果如图。回答下列问题。
(1)将外源基因Vgb整合到菊花细胞需要先构建基因表达载体,构建基因表达载体时,需要使用的酶有 。重组载体进入菊花细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。构建基因表达载体时,外源基因Vgb插在启动子的上游,则在菊花细胞中检测不到表达产物,主要原因是 。
(2)设计引物是PCR技术的关键步骤之一,根据Vgb设计特异性引物进行PCR扩增,某同学设计的一组引物(只标注了部分碱基序列)为,此引物设计 (填“合理”或“不合理”),理由是 。
(3)设置空白对照的目的是 。对于外源基因Vgb在菊花中的稳定性以及对周边植物的影响方面,图中实验结果表明 。
解析:(1)构建基因表达载体时,需要的酶有限制酶(切割目的基因和运载体)和DNA连接酶(连接切割后的目的基因和运载体) ;重组载体进入受体(菊花)细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化;启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,用于驱动基因的转录,构建基因表达载体时,外源基因Vgb插在启动子的上游,则由于目的基因(或Vgb) 无法转录而导致菊花细胞中检测不到表达产物。(2)据题图可知,引物Ⅰ和引物Ⅱ存在碱基互补配对关系,会因局部发生碱基互补配对而失效,故此引物设计不合理。(3)为排除实验操作、试剂污染等对结果的影响,实验需要设置空白对照;分析题图,CK为质粒阳性对照组,1为空白对照组,结合图示电泳结果可知,2年内Vgb基因在菊花细胞中稳定存在(在2~10有电泳条带),且未发生向周边植物的扩散(11~20均不出现阳性条带)。
答案:(1)限制酶和DNA连接酶 转化 目的基因无法转录 (2)不合理 引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效 (3)排除实验操作、试剂污染等对结果的影响 2年内Vgb基因在菊花细胞中稳定存在,且未发生向周边植物的扩散
探究实践课:DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验目的
1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理。
2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
二、实验原理
1.解旋。
PCR利用了DNA的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
2.鉴定。
(1)DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动(即电泳)。
(2)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
(3)凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
三、实验材料
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置、4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
四、探究过程
1.DNA片段的扩增。
准备:用微量移液器按照PCR反应体系的配方或PCR试剂盒的说明书,在微量离心管中依次加入各组分
离心:待所有的组分都加入后,盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里,离心约10 s,使反应液集中在管的底部
扩增:设置好PCR仪的循环程序,将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应
2.电泳鉴定。
配制琼脂糖溶液:根据待分离DNA片段的大小,用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液,一般配制质量分数为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液,加热至琼脂糖熔化。稍冷却后,加入适量的核酸染料混匀
制备琼脂糖凝胶:将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具,并插入合适大小的梳子,以形成加样孔
填充电泳槽:待凝胶溶液完全凝固后,小心拔出梳子,取出凝胶放入电泳槽内,并将电泳缓冲液加入电泳槽中,电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜
加PCR产物:将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合,再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳:接通电源,根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压,一般为1~
5 V/cm,待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时,停止电泳
结果分析:取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
五、实验操作
1.操作提醒。
(1)为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)实验用到的酶和缓冲液应分装成小份,并在-20 ℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱中拿出,放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。
(4)待凝胶溶液完全凝固后(一般需要20~30 min)才能拔出梳子,方向一定要垂直向上,不要弄坏加样孔。
(5)凝胶放入电泳槽后,将电泳缓冲液加入电泳槽时应确保加样孔内充满电泳缓冲液且没有气泡,电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
(6)本实验部分试剂对人体有害,操作时一定要穿好实验服、戴好一次性手套。
2.实验报告。
实验时间 某年某月某日。 实验地点 实验室。 实验环境 常温、常压等。
实验结果 实验记录
实验结论 PCR后,将扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,显示片段大约为××bp,与预期大小一致,表明DNA片段扩增成功。
实验反思 成功之处 微量移液器使用规范,PCR反应体系配比合理。
不足之处 个别加样孔内有微量气泡,导致加样时有微量样品飘出,但不影响实验结果。
3.实验拓展。
你进行电泳鉴定的结果是几条条带 如果不止一条条带,请分析产生这个结果的可能原因。
提示:如果扩增结果不止一条条带,可能的原因有引物设计不合理,它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体;复性温度过低;DNA聚合酶的质量不好等。
实验评价
1.PCR控制DNA的解聚与结合是利用了DNA的 ( )
A.特异性 B.稳定性
C.热变性 D.多样性
解析:DNA分子在超过90 ℃的温度条件下变性,双链解开成单链;当温度缓慢降低时,又能重新结合形成双链。因此,PCR控制DNA的解聚与结合是利用了DNA的热变性。
答案:C
2.使用PCR仪的具体实验操作顺序应为 ( )
①设计好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分③用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心,使反应液集中在离心管底部
A.②③⑤④① B.①⑤③②④
C.②③⑤①④D.④②⑤③①
解析:PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括将配方所需各组分放于实验台上)→移液→混合→离心→反应。因PCR仪是一种能自动控制温度的仪器,设计好循环程序就可以进行反应了。
答案:C
3.下图表示PCR扩增的产物,则它是哪次循环的产物 ( )
A.第一次循环 B.第二次循环
C.第三次循环 D.第四次循环
解析:在PCR反应中以引物为标记,第一次循环时,以加入的DNA为模板,两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合,并在DNA聚合酶的作用下延伸,所以,形成的每个子代DNA中只有一种引物。从第二次循环开始,第一次产生的DNA分子又可作为模板参与反应,形成的DNA分子中,只有两个仅一端含有引物,其他DNA分子两端都含有引物。
答案:A
4.下图为DNA变性和复性示意图,下列相关说法正确的是 ( )
A.向左的过程为加热(90~100 ℃)变性的过程
B.向右的过程是DNA双链迅速制冷复性
C.变性与生物体内的解旋过程的实质相同
D.图中左侧DNA片段共有4个游离的磷酸基团、4个3'端
解析:向右的过程为加热(90~100 ℃)变性的过程,即高温变性,使DNA解旋,A项错误;向左的过程是DNA双链缓慢降温复性,B项错误; DNA体外的变性和体内的解旋,其实质是相同的,都是使氢键断裂,DNA双螺旋打开,只是体内解旋需要解旋酶,体外变性需要高温条件,C项正确;由于DNA双链是反向平行的,所以图中DNA双链片段共有2个游离的磷酸基团、2个3'端,D项错误。
答案:C
5.在PCR扩增DNA的实验中,根据设计,一分子DNA经30次循环后,应得到约230个DNA分子,但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因可能是 ( )
①循环次数不够 ②Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制 ③引物不能与亲链结合 ④系统设计欠妥
A.①②③ B.①②④
C.①③④ D.②③④
解析:①循环次数过少,会导致产物的量比预期的少;②Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制,会导致扩增效率低,得到的产物比预期的少;③如果引物设计不合理,则无法进行扩增;④PCR仪的系统设置不妥,将达不到预期的效果。
答案:B
6.下列有关PCR实验操作的叙述,错误的是 ( )
A.在向微量离心管中添加各种试剂时,只需要一个枪头
B.离心管的盖子一定要盖严
C.用手指轻弹离心管侧壁
D.离心的目的是使反应液集中在离心管的底部
解析:在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,以确保实验的准确性;离心管的盖子需盖严,目的是防止实验中外源DNA的污染;用手指轻弹离心管侧壁,目的是使反应液混合均匀;离心的目的是使反应液集中在离心管的底部,提高反应效果。
答案:A
7.若用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性内切核酸酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是 ( )
A.图中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
解析:限制性内切核酸酶可以识别特定的脱氧核苷酸序列,不同的酶能识别不同的核苷酸序列;同种限制酶分别切割载体和目的基因,再用 DNA连接酶进行连接,目的基因和运载体结合,构成重组DNA;SalⅠ将DNA片段切成4段,XhoⅠ将DNA片段切成3段,根据电泳结果可知泳道①为SalⅠ,泳道②为XhoⅠ;限制酶切割双链DNA。
答案:D
8.(2021·天津)下列有关电泳的叙述,错误的是 ( )
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时,带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
解析:电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程;待测样品中各种分子的构象、大小及带电性质的差异等都会影响其在电泳中的迁移速率;由于同性相斥、异性相吸,带电粒子会向着与其所带电荷相反的电极移动;PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
答案:C
9.(2022·辽宁)染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白,对得到的DNA片段进行凝胶电泳,结果如图所示。若先将染色质中的蛋白质去掉后用同样的非特异性核酸酶处理,则得到随机长度的DNA片段。据此分析,下列有关叙述错误的是 ( )
A.凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来
B.染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用
C.构成核小体的基本单位是脱氧核糖核苷酸
D.在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关
解析:凝胶中的DNA分子经染色后,对波长为300 nm 的紫外光吸收性强,可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来;由图可知,染色质用核酸酶处理后,得到的是部分水解的染色质,但若先将染色质中的蛋白质去掉后用核酸酶处理,则得到随机长度的DNA片段,说明染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用;染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的,核小体的组成成分是蛋白质和DNA,其基本单位是脱氧核糖核苷酸和氨基酸;在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
答案:C
10.现有一长度为3 000 碱基对(bp)的线性 DNA 分子,用限制性内切核酸酶酶切后,进行凝胶电泳,使降解产物分开。用酶 H 单独酶切,结果如图 1。用酶 B 单独酶切,结果如图 2。用酶 H 和酶 B 同时酶切,结果如图 3。该 DNA 分子的结构及其酶切图谱是 ( )
A.
B.
C.
D.
解析:据图1、图2分析,该线性DNA分子上有一个酶H的切割位点,且能把该DNA切割成长度为1 000和2 000个碱基对的片段;该线性DNA分子上有2个酶B的切割位点,且能把该DNA切割成400、600和2 000个碱基对的片段;据图3可知酶B的两个切割位点位于酶H切割位点的两侧,且分别把酶H切割的片段,切割成长度为400、600、600、1 400个碱基对的片段。
答案:A
11.PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术,下图表示合成过程,请据图分析回答下列问题。
(1)A过程高温使DNA变性解旋,对该过程的叙述,正确的是 。
A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键
B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键
C.该过程不需要解旋酶的作用
D.该过程与人体细胞内的过程完全相同
(2)C过程要用到的酶是 。这种酶在高温下仍保持活性,因此在PCR扩增时可以 加入, (填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除需要提供酶外,还需要满足的基本条件有 。
(3)如果模板DNA分子共有a个碱基对,其中含有胞嘧啶m个,那么该DNA复制10次,需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个。
(4)PCR中由碱基错配引起的变异属于 。假设对一个DNA分子进行扩增,第一次循环时一条模板链上发生碱基错配,之后正常配对,则扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段,与原DNA相应片段相同的占 。
解析:(1)高温所起的作用类似于解旋酶,使双链DNA分子变为单链。(2)C过程是PCR的延伸阶段,当系统温度上升至72 ℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。耐高温的DNA聚合酶在高温下仍保持活性,一次性加入即可,不需要再添加。(3)在一个双链DNA分子中,C+T占碱基总数的一半,则T的数目为(a-m)个,复制10次,新增加了(210-1)个DNA分子,故需补充胸腺嘧啶脱氧核苷酸(210-1)(a-m)个。(4)基因中碱基对的改变属于基因突变。对一个DNA分子进行扩增,第一次循环时一条模板链上发生碱基错配,以后按正常配对方式进行扩增,以错配链作为模板扩增的DNA分子都是错误的,原正常链扩增得到的DNA分子都是正常的,故扩增若干次后检测所有DNA的扩增片段,与原DNA相应片段相同的占75%(或3/4)。
答案:(1)C (2)耐高温的DNA聚合酶 一次 不需要 DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、4种脱氧核苷酸,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 (3)(210-1)(a-m) (4)基因突变 75%(或3/4)
