3.2基因工程的基本操作程序第1课时课件(共32张PPT3份视频)2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

(共32张PPT)
课前回顾
重组DNA技术的基本工具？工具酶？
限制酶的来源？本质？作用？作用的化学键？结果？
DNA连接酶的本质？作用？作用的化学键？种类？
载体的种类？
什么是质粒？作为载体需要的条件？
DNA粗提取的原理？鉴定的原理？方法步骤
第三章《基因工程》
第3.2节 基因工程的基本操作程序
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
转基因抗虫棉与普通棉花
转基因抗虫棉与普通棉花
棉花的抗虫基因哪里来的？
主要是棉铃虫
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
Bt抗虫蛋白基因——Bt基因
Bt基因
补充：当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后,多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性,而人和牲畜的胃液呈酸性,肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
表达
(转录、翻译)
Bt抗虫蛋白
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
从社会中来
第一步：目的基因的筛选与获取
目的基因：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
主要是编码蛋白质的基因
△ 根据不同的需要，
目的基因是不同的
[资料一] 棉花本身不具有抗虫基因。苏云金杆菌有一种抗虫基因，能
表达出抗虫蛋白来杀死棉铃虫。利用基因工程将抗虫基因导
入棉花细胞，培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种。
[资料二] 胰岛素是治疗糖尿病的特效药。健康人含有胰岛素基因，能
表达胰岛素，从而降低血糖浓度。大肠杆菌本身不具有胰岛
素基因。1978年，科学家将编码人胰岛素的基因导入大肠杆
菌细胞中，使大肠杆菌表达重组人胰岛素。
什么是目的基因？
第一步：目的基因的筛选与获取
实例
如生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。
人胰岛素基因、
人干扰素基因等
抗虫基因、
抗病基因、
抗除草剂基因等
第一步：目的基因的筛选与获取
如何筛选目的基因？
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入了解
苏云金杆菌制成的生物杀虫剂可防治棉花虫害
Bt基因是培育转基因抗虫棉的目的基因
目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
序列数据库
明确了目的基因后，该怎么获得它
第一步：目的基因的筛选与获取
越来越多基因的结构和功能被分析。
目的基因的获取
人工合成
目的基因获取方法：
利用PCR技术扩增
（常用）
构建基因文库p82
目的基因的获取——利用PCR获取和扩增目的基因
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
1’
2’
3’
4’
5’
C
1’
2’
3’
4’
5’
G
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
体内DNA复制要点回顾
条件
原料：游离的4种脱氧核苷酸（A、T、G、C）
模板：DNA的两条链
酶：解旋酶、DNA聚合酶等
能量：ATP
复制原则：
碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）
目的基因的获取——利用PCR获取和扩增目的基因
1、 概念：
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶（体外用高温代替） 打开DNA双链（断开氢键）
DNA母链（2条） 提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 催化合成DNA子链（形成磷酸二酯键）
引物 （2种，分别与两条母链结合） 使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸
缓冲溶液（Mg2+） 激活DNA聚合酶的活性
2、 条件:
引物
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。
体内复制的引物为RNA单链（复制结束后被降解）
使DNA聚合酶从引物3’端开始连接脱氧核苷酸，延伸形成子链。
(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
a.什么是引物
b.引物的作用
使DNA聚合酶从引物3’端开始连接脱氧核苷酸，延伸形成子链。
(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能)
b.引物的作用
5’
3’
5’
3’
5’
3’
引物
引物
子链延伸
子链延伸
3’
5’
目的基因的获取——利用PCR获取和扩增目的基因
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
①PCR条件:
目的基因的获取——利用PCR获取和扩增目的基因
②PCR过程
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
目的基因的获取——利用PCR获取和扩增目的基因
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
②PCR过程
问1：1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出 个DNA片段，即以_____形式扩增。　　　
指数
2n
问2：1个模板DNA分子经过n轮PCR，则共需消耗多少个引物？
共需消耗2n＋1－2个引物
=2n－1对引物。
DNA解聚为单链
高温(90℃)以上变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA母链
Taq酶从引物3’端延伸合成子链
PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。
②PCR过程
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋 方式 解旋酶催化 边解旋边复制 DNA在高温下变性解旋
全部解旋后再复制
场所 主要在细胞核内 体外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 大量特定DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要DNA两条链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸 ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端连接脱氧核苷酸
用PCR可以扩增mRNA吗？
不可以（Taq酶以DNA为模板，且RNA不稳定，需要逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子
A
A
C
G
G
C
T
T
A
A
T
T
1.用于PCR扩增的DNA片段往往为了保证目的基因的完整，经切割后目的基因的两端会有一小段非基因序列，其也可能随目的基因一起扩增。PCR技术扩增目的基因时至少要经过几次循环才能从中分离两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？
第
一
次
循
环
90℃以上，DNA双链解开(变性)
50℃左右，引物与DNA结合（复性）
72℃左右，新DNA合成（延伸）
3’
5’
5’
3’
5’
5’
第
二次
循
环
5’
3’
5’
5’
3’
5’
高温变性
低温复性
中温延伸
高温变性
第
三次
循
环
3’
5’
低温复性
中温延伸
A
A
C
G
G
C
T
T
A
A
T
T
用于PCR扩增的DNA片段往往为了保证目的基因的完整，经切割后目的基因的两端会有一小段非基因序列，其也可能随目的基因一起扩增。PCR技术扩增目的基因时至少要经过几次循环才能从中分离两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？
3次
2.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
(1）第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效