3.2基因工程的基本操作程序第3课时课件(共32张PPT2份视频)2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

(共32张PPT)
选择性必修3
第2节：基因工程的基本操作程序-4
探究实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
目的要求
1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理
2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
PCR仪器
电泳结果
PCR→PCR产物→电泳
实验
PCR仪
电泳装置
实验原理
1.DNA片段扩增原理
利用PCR在体外进行DNA片段扩增
①PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
高温
变性
延伸
复性
低温
中温
1次循环
②PCR仪能够自动调控温度，一次PCR一般要经历30次循环。
2.电泳鉴定
①电泳
在电场作用下，带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程称为电泳。
②琼脂糖凝胶电泳
PCR产物(DNA)一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
电源
+
—
电泳槽
缓冲液
琼脂糖凝胶
加样孔
实验原理
2.电泳鉴定
③影响DNA迁移速率的因素
a.凝胶的浓度
b.DNA分子大小和构象
在碱性缓冲溶液中，DNA分子带负电，电泳时DNA从负极向正极迁移。
电源
+
电泳槽
琼脂糖凝胶
加样孔
缓冲液
—
2.电泳鉴定
④电泳结果的显示
凝胶中DNA分子通过染色，在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
在同一浓度的凝胶中，较小的DNA片段迁移速度比大片段快。
大DNA片段
小DNA片段
Marker
bp：碱基对
常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。
⑥PCR扩增产物的鉴定
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
材料用具
1.PCR过程使用的材料用具
扩增缓冲液（Mg2+）
4种脱氧核苷酸的等量混合液
2种引物
无菌水
TaqDNA聚合酶
模板DNA
离心机
PCR仪
微量离心管
微量移液器
一次性吸液枪头
用具
试剂
微量移液器
一次性吸液枪头
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
（注意：吸取一种试剂更换一次枪头）
微量离心管
离心机
2.琼脂糖凝胶电泳过程使用的材料用具
琼脂糖
核酸染料
电泳缓冲液
凝胶载样缓冲液
电泳装置
(电泳仪、电泳槽等)
微量移液器
一次性吸液枪头
用具
试剂
电泳仪
电泳槽
制好的
琼脂糖凝胶
制胶模具
梳子
梳子
自主阅读书本P85，掌握探究实验的步骤。
1.DNA片段扩增的具体过程？
2.PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程？
一.DNA片段扩增的具体过程
1.移液
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
2.离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
3.反应
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
延伸时间：可根据目的片段长度适当调整
方法步骤
4.配制琼脂糖溶液
琼脂糖
电泳缓冲液
加热至融化
稍冷却
根据待分离DNA片段的大小，确定琼脂糖溶液浓度的大小。
一般配制质量分数为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。
制成琼脂糖溶液
加入核酸染料
二.PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程
5.制备琼脂糖凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
梳子
6.将凝胶放入电泳槽内
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
梳子
凝胶
电泳槽
凝胶
凝胶加样孔一极朝向电泳槽负极
7.加入电泳缓冲液
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
8.加样
扩增得到的PCR产物
凝胶载样缓冲液
混合液
注入凝胶加样孔
微量移液器
留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
内含指示剂
显示电泳的过程
9.电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm。
待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
10.电泳结果检测
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
标准参照物
PCR扩增产物
注意事项
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
结果分析
1.你是否成功扩增出DNA片段 判断的依据是什么
可以通过紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细来评价扩增结果。
该片段大小约为750bp。
结果分析
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带 如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
未出现条带的可能的原因有：
①漏加了PCR的反应成分，
②各反应成分的用量不当，
③PCR程序设置不当
④Taq酶失活
⑤Mg+浓度过低
⑥引物出现质量问题
⑦变性时温度过低，变性时间短
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：
①引物特异性不强，或形成引物二聚体
②复性温度过低
③模板DNA出现污染
总结
完成作业：
大本做到50页
一.概念检测
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 （ ）
（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ）
√
×
×
2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
D
P83【练习与应用】二、拓展应用
2. 八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtl表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是_____________________，标记基因是__________，质粒pSYN12424的作用是_______________________________。
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
ctrⅠ基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
不能。
若目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，则可能被切断。
二.PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程
制备凝胶
4.融化
5.倒模
6.凝固
用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
进行电泳
7.加液
8.加样
9.电泳
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。
留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳.
观察鉴定
10.取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。