3.2基因工程的基本操作程序 课件-(共49张PPT1份视频)2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

(共49张PPT)
第二节 基因工程的基本操作程序
人教版高中生物学教材《生物技术与工程》（选择性必修三）第三章
问题探讨
苏云金杆菌
培育转基因抗虫棉需要哪几步？
Bt基因
表达
苏云金伴胞晶体蛋白
（Bt抗虫蛋白）
摄食
害虫死亡
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
问题探讨
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
1
2
3
4
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因的筛选与获取
一、目的基因
（1）概念：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。（Bt抗虫蛋白基因：转基因抗虫棉）。
主要是编码特定蛋白质的基因
（2）实例：
目的基因的筛选与获取
二、筛选合适的目的基因
方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。
DNA测序仪
核苷酸序列比对
氨基酸序列比对
美国国家生物信息中心
越来越多基因的功能和结构被分析。
PCR技术：PCR是__________________的缩写，是一项根据________________
的原理，在______提供参与DNA复制的__________与____________，对_______________________进行___________的技术；
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
特异性地快速扩增目的基因
原理
操作环境
目的
优点：
目的基因的筛选与获取
三、目的基因的获取
DNA复制所需的基本条件:
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（体外用耐高温的DNA聚合酶）
（体外用高温代替）
（2种）
引物是一小段能与__________的一段碱基序列__________的____________
DNA母链
互补配对
短单链核酸
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
子链延伸
子链延伸
PCR条件
耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
PCR条件
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
PCR过程
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
思考： 1.PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
PCR过程
思考：2. PCR技术最终哪部分被大量复制了？
引物对之间的部分
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
3’
思考：3. PCR引物设计应遵循哪些原则？
引物自身及引物之间不应存在互补序列等
思考：4.一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次：
复制过程中共需引物__________个
2n＋1 - 2
PCR过程
基因表达载体的构建
一、基因表达载体的目的
（1）？
（2）？
二、基因表达载体的组成
位置：
功能：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。
基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）
人们所需要的基因
位置：
功能：
基因的下游（一段特殊的DNA片断）
终止mRNA的转录
用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞
基因表达载体的构建
三、基因表达载体的构建过程
基因表达载体构建模式图
载体
（质粒）
DNA分子
（含目的基因）
限制酶处理
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同一种
培育抗虫棉的简要过程
使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
问题探讨
选择用2种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，减少自身环化的情况。
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
培育抗虫棉的简要过程
阅读81-82页，思考下列问题：
1.将目的基因导入受体细胞时分别采用哪些方法？
①植物细胞
②动物细胞
②微生物细胞
2.目的基因的检测与鉴定包括哪些水平的鉴定？具体做法分别是？
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——Ca2+转化法
显微注射法
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
目的基因
目的基因
适用生物：开花植物
1.目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
1.目的基因导入植物细胞
1.什么是转化？
2.农杆菌转化法利用了农杆菌哪些特点。
3.农杆菌转化法中涉及到几次DNA的拼接和几次导入？
（可转移的DNA）
关于农杆菌
培育抗虫棉的简要过程
阅读81-82页，思考下列问题：
1.将目的基因导入受体细胞时分别采用哪些方法？
①植物细胞
②动物细胞
②微生物细胞
2.目的基因的检测与鉴定包括哪些水平的鉴定？具体做法分别是？
1.基因工程的基本操作程序（4个步骤）,核心步骤？
2.利用基因工程的培育抗虫棉，抗虫基因来自于？
3.筛选目的基因较为有效的方法是？人们通过哪些技术研究基因的结构和功能？
4.PCR的全称、原理、操作环境、优点、条件分别是？
5.PCR每次循环分为哪3步？对应温度及具体过程分别是？鉴定PCR产物的技术是？
6.构建基因表达载体的2个目的？
7.基因表达载体必须包含哪些结构？启动子、终止子的位置和功能分别是？
8.怎样避免质粒和目的基因的自身环化？
9.将目的基因导入植物细胞的方法有哪些？
10.花粉管通道法的两种操作分别是？
11.转化的概念？农杆菌转化法利用了农杆菌的哪些特点？整个过程进行了几次DNA的拼接？几次导入？
12.将目的基因导入动物细胞、原核生物的具体方法分别是？
13.在分子水平对目的基因检测与鉴定的方法有哪些？还需要进行什么水平的鉴定？
14.PCR的原理？步骤？离心的目的？预变性的目的？
15.鉴定PCR产物的方法？鉴定原理？加样时，留两个孔，分别加入什么物质？分别有什么目的？
16.怎样避免外来DNA的污染？缓冲液和酶怎样保存？怎样解冻？
第二节 基因工程的基本操作程序2
人教版高中生物学教材《生物技术与工程》（选择性必修三）第三章
探究·实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；
DNA半保留复制
变性
90 C
延伸
72 C
复性
50 C
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_______________来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关
④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
DNA片段的扩增及电泳鉴定
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
凝胶电泳原理示意图
二、材料用具
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
一次性
吸液枪头
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。(离心管)
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
二、材料用具
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合
三、方法步骤
DNA片段的扩增
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR技术
移液
离心
扩增
DNA片段的电泳鉴定
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
②待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
三、方法步骤
DNA片段的扩增及电泳鉴定
配制
琼脂糖溶液
制备
琼脂糖凝胶
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
DNA片段的电泳鉴定
三、方法步骤
DNA片段的扩增及电泳鉴定
加样
电泳
观察
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
特别注意
DNA片段的扩增及电泳鉴定
四、结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
第二节 基因工程的基本操作程序3
人教版高中生物学教材《生物技术与工程》（选择性必修三）第三章
实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR仪
DNA分子电泳
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的______原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_____________的仪器，一次PCR一般要经历___次循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；
DNA半保留复制
变性
90 C
延伸
72 C
复性
50 C
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些________会向着________________的电极移动，这个过程就是_____；
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、______________和_____等有关
③凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的______下被检测出来。
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
凝胶电泳原理示意图
1.仪器
2.材料
PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
微量离心管
微量移液器
电泳装置
PCR仪
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
3.PCR反应体系的配方
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
移液
离心
扩增
1.DNA片段的扩增
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
2.DNA片段的电泳鉴定
2.DNA片段的电泳鉴定
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
注意
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？
　 (2022·天津一中高二期中)下列有关电泳的叙述，不正确的是
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电
泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
例1
√
　用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是
例2
A.PCR产物的分子大小在250～500 bp
之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
√
1. 利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增,下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,错误的是 (　　)
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
B.PCR利用了DNA的热变性原理
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化
D.在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换
C
2.下列有关电泳的叙述,不正确的是 (　　)
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时,带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
C
3.一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割,切割产物通过电泳分离,用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子质量标记。关于该双链DNA,下列说法错误的是 (　　)
A.呈环状结构
B.分子质量大小为10 kb
C.有一个NotⅠ和两个EcoRⅠ切点
D.其NotⅠ切点与EcoRⅠ切点的最短距离为2 kb
D