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动物细胞工程
第二课时
第2节
人教版 选择性必修3
1.能阐明动物细胞融合技术的定义。
2.能阐述单克隆抗体的制备过程。
3.能说出单克隆抗体制备在临床上的应用。
2024/1/15
植物体细胞杂交
植物细胞融合
植物组织培养
植物体细胞杂交技术可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障,培育出新的作物类型。那么,有没有技术让不同种动物的体细胞进行杂交,培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢?
2024/1/15
动物细胞融合也称细胞杂交,是指使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
细胞膜具有一定的流动性。
动物细胞融合技术
1.概念:
形成的具有原来 的 细胞,称为 。
两个或多个细胞遗传信息
杂交细胞
3.原理:
2.结果:
单核
4.动物细胞融合的方法:
与植物原生质体融合的方法相同
物理方法:
动物细胞没有细胞壁,可以直接诱导融合。
电融合法、离心法
化学方法:
聚乙二醇(PEG)法
生物方法:
灭活病毒诱导法
灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力,并不破坏它们的抗原结构。
——动物细胞融合特有
思考:19世纪30年代,科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象?
病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。
肺结核病人病理切片
原理是什么?
原理
病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用,使细胞相互凝集,细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。
5.构建动物细胞融合模型:
①融合过程:细胞膜融合→细胞质融合→ ________融合。
②重组细胞的特点: 具有____________________,杂种细胞表现出两个____________的特点。
③融合后的杂交细胞经过__________后仍能形成两个完整的杂交细胞。
动物细胞A
动物细胞B
膜融合、质融合
动物细胞培养
杂交细胞(单核)
物理、化学、生物法诱导
细胞核
亲本细胞
有丝分裂
两种细胞的遗传信息
动物细胞融合实质及完成的标志
6. 意义:
7. 应用:
突破了有性杂交方法的局限,使远缘杂交(种间、属间、科间、动植物之间)成为可能。
成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。
动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术的比较
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、
植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法;聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、
灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,培育植物新品种
突破了有性杂交的局限,使远缘杂交成为可能
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1.传统抗体制备方法及缺陷
(1)制备方法:向动物体内反复注射某种抗原,使动物产生抗体,然后从动物血清中分离所需抗体。
(2)缺陷:产量低、纯度低,而且特异性差。
2.单克隆抗体的制备
(1)单克隆抗体:由单一B淋巴细胞克隆产生的特异性抗体。
米尔斯坦
科勒
由于单克隆抗体的制备技术,米尔斯坦和科勒于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖
单克隆抗体及其应用
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
骨髓瘤细胞(癌细胞)能无限增殖
动物细胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞:既能迅速大量增殖,又能产生抗体
(2)单克隆抗体的制备思路
注射特定的抗原
多种B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
①未融合的细胞
②多种杂交细胞(包括B-B细胞、瘤-瘤细胞、杂交瘤细胞)
动物细胞融合
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(3)单克隆抗体制备的过程
①未融合的细胞
②多种杂交细胞
杂交瘤细胞
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞
(分泌的抗体能与特定抗原结合)
注射到小鼠腹腔内
(体内培养)
体外培养
获取单克隆抗体
从小鼠腹水中
从细胞培养液中
动物细胞培养
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用特定的选择培养基
第一次筛选
克隆化培养、抗体检测
第二次筛选(可进行多次)
特定的选择性培养基(HAT培养基)的筛选原理
①细胞合成DNA有两条途径,正常细胞
内两种途径都有,若全合成途径被阻
断,可以通过补救合成途径合成DNA;
②骨髓瘤细胞不能合成转化酶和激酶,
因此只能进行全合成途径;
③全合成途径能被氨基喋呤(A)阻断;
④次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶(T)是补救合成途径的原料;
⑤无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5~7天。
将诱导融合后的细胞接种于HAT培养基后两周,则细胞生存状况及原因为:①B细胞和B-B细胞死亡,能进行补救合成途径,但是无增殖能力;
②骨髓瘤细胞和瘤-瘤细胞死亡,两种途径均无法进行,无法合成DNA并增殖;
③杂交瘤细胞存活,能进行补救合成途径,能合成DNA并大量增殖。
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(4)第一次筛选
★
每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞
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有限稀释法
侧面模拟图
克隆化培养一段时间
取上清液进行抗体检测
(5)第二次筛选
克隆化培养和抗体检测
检测原理:抗原和抗体能够特异性结合
(分子水平的鉴定)
2024/1/15
(6)单克隆抗体制备过程中的两次筛选
第一次筛选 第二次筛选
原因
方法
结果
诱导融合后得到的细胞中,除杂交瘤细胞之外,还有未融合的亲本细胞,也有融合的具有同种核的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激,所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
用特定的选择培养基进行筛选
用96孔板培养,在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下,进行克隆化培养和抗体检测(进行多次筛选)
筛选获得杂交瘤细胞
获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(7)两次筛选的比较
2024/1/15
2024/1/15
3.不同水平的克隆及实例
(1)分子水平的克隆:如DNA复制、PCR技术。
(2)细胞水平的克隆:如细胞增殖、动物细胞培养。
(3)个体水平的克隆:如植物组织培养、动物细胞核移植。
(1)为了得到能产生抗新型冠状病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞,需要进行筛选。图中筛选1的培养基中进行细胞培养的结果是_______________________。图中筛选2含多次筛选,筛选所依据的基本原理是_____________________。
(2)单抗特异性比一般抗血清强,原因是一般抗血清中的抗体是_______________
_________________。
(3)若要使能产生抗新型冠状病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖,通常采用的方法有_______________________________________________________。
为研制抗新型冠状病毒的单克隆抗体,某研究性学习小组以兔子甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题:
只有杂交瘤细胞能够生存
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抗原与抗体特异性反应
一群识别不同抗原
部位的抗体混合物
将杂交瘤细胞体外培养、将杂交瘤细胞注射到兔子腹腔内增殖
2024/1/15
资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断,这比原来的诊断方法提前了10d左右,可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。
资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性,在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害,这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugates, ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合,
实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通
常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部
分组成,它的作用机制如下图所示。
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1.ADC的抗体和药物各具有什么作用?
2.除了细胞毒素,还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物?
3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势?
抗体主要发挥靶向运输作用,即通过特异性结合靶细胞表面的抗原,将连接的药物输送到靶细胞;药物发挥治疗效应,如杀伤靶细胞。
可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长,理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。
单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应,因此检测的特异性和灵敏度大大提高;生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用,有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用,因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
2024/1/15
4.单克隆抗体在临床上还有哪些应用?你可以课后搜集资料,然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题,出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。
单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗,如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤;曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面,单克隆抗体被广泛用于-些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例,用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体,可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位,辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
2024/1/15
4.单克隆抗体的应用
(1)广泛用作诊断试剂
①原理:单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异,与特定抗原发生特异性结合,并且可以大量制备。
②实例:利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术,可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
(2)运载药物:如ADC。
(3)直接用于治疗疾病。
如利妥昔单抗(美罗华)是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体,是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后能通过介导抗体依赖的细胞毒性作用、补体依赖的细胞毒性作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应,抑制细胞生长,改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞。
两个过程
动物细胞融合过程
单克隆抗体制备过程
三个“一”
一个诱导细胞融合的新方法
--灭活病毒
一个新细胞
--杂交瘤细胞
一个优势
--单克隆抗体特异性强、灵敏度高、可大量制备的优势