3.2 课时2 基因工程的基本操作程序 课件 (共19张PPT)2023-2024学年高二生物人教版（2019）选择性必修3
文档属性
| 名称 | 3.2 课时2 基因工程的基本操作程序 课件 (共19张PPT)2023-2024学年高二生物人教版（2019）选择性必修3 |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 3.1MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-01-15 20:49:49 | ||
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文档简介
(共19张PPT)
基因工程的基本操作程序
第二课时
第2节
人教版 选择性必修3
1.能阐述将目的基因导入受体细胞的方式及原理。
2.能阐明目的基因的检测与鉴定所涉及的技术原理。
3.能阐述DNA片段扩增及电泳鉴定的实验流程。
2024/1/15
1.将目的基因导入植物细胞
（1）花粉管通道法（受体细胞：受精卵）
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
将目的基因导入受体细胞
2024/1/15
②特点：a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（2）农杆菌转化法
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
③实验思路（过程）：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
④具体转化方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。
b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
农杆菌转化法示意图
2024/1/15
2.将目的基因导入动物细胞——显微注射法
（1）受体细胞：受精卵。因为受精卵容易表现出全能性。
（2）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
3.将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法
（1）受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
（2）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
一般利用温度变化导入
2024/1/15
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
1.分子水平的检测
（1）PCR等技术
检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否转录出了mRNA
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。
目的基因的检测与鉴定
（2）抗原—抗体杂交技术
检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
2024/1/15
2.个体生物学水平的检测
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
2024/1/15
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
（一）实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。
（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理：
（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些
基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些
带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过
程就是电泳。
（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与
凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。
（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
1.试剂：
（1）无菌水、琼脂糖；
（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；
（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；
（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
（5）PCR反应体系的配方
（二）材料用具
2024/1/15
2.用具：
（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）；
（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）；
（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）；
（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）；
（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
1.DNA片段的扩增
移液
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
反应
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
2024/1/15
（三）方法步骤
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
2024/1/15
2.DNA片段的电泳鉴定
2024/1/15
（四）注意
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
2024/1/15
结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
目的基因是否插入
mRNA
蛋白质
个体
转录
翻译
检测
检测
DNA分子杂交
分子杂交
抗原—抗体杂交
抗虫或抗病接种实验
现象
现象
现象
现象
是否出现杂交带
是否出现杂交带
是否出现杂交带
是否抗虫或抗病
鉴定
分子水平检测
个体水平检测
基因工程的基本操作程序
第二课时
第2节
人教版 选择性必修3
1.能阐述将目的基因导入受体细胞的方式及原理。
2.能阐明目的基因的检测与鉴定所涉及的技术原理。
3.能阐述DNA片段扩增及电泳鉴定的实验流程。
2024/1/15
1.将目的基因导入植物细胞
（1）花粉管通道法（受体细胞：受精卵）
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
将目的基因导入受体细胞
2024/1/15
②特点：a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（2）农杆菌转化法
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
③实验思路（过程）：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
④具体转化方法：a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。
b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
Ti质粒
目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
表现出新性状的植株
植物组织培养
农杆菌转化法示意图
2024/1/15
2.将目的基因导入动物细胞——显微注射法
（1）受体细胞：受精卵。因为受精卵容易表现出全能性。
（2）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
3.将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理法
（1）受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。
（2）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程
Ca2+处理大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性
这种细胞称为感受态细胞
一般利用温度变化导入
2024/1/15
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
1.分子水平的检测
（1）PCR等技术
检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否转录出了mRNA
在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。
目的基因的检测与鉴定
（2）抗原—抗体杂交技术
检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。
2024/1/15
2.个体生物学水平的检测
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
2024/1/15
1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。
（一）实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。
（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理：
（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些
基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些
带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过
程就是电泳。
（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与
凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。
（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
1.试剂：
（1）无菌水、琼脂糖；
（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；
（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；
（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
（5）PCR反应体系的配方
（二）材料用具
2024/1/15
2.用具：
（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）；
（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）；
（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）；
（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）；
（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
1.DNA片段的扩增
移液
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
反应
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
可根据目的片段长度适当调整延伸时间
2024/1/15
（三）方法步骤
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
2024/1/15
2.DNA片段的电泳鉴定
2024/1/15
（四）注意
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
2024/1/15
结果分析与评价
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
目的基因是否插入
mRNA
蛋白质
个体
转录
翻译
检测
检测
DNA分子杂交
分子杂交
抗原—抗体杂交
抗虫或抗病接种实验
现象
现象
现象
现象
是否出现杂交带
是否出现杂交带
是否出现杂交带
是否抗虫或抗病
鉴定
分子水平检测
个体水平检测