3.2 基因工程的基本操作程序课件(共64张PPT)（第1课时）

(共64张PPT)
3.2 基因工程的基本操作程序-1
新教材 人教版 选择性必修三
【教学过程】
Teaching Process
1.概念图
3.教学总结、综合
2.课堂教
学内容
4.课堂练习巩固
典型习题
规律总结
探究 实践
建立模型
基本步骤
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉与普通棉花
从社会中来
抗虫棉的培育过程
2.基因表达载体的构建
1.目的基因的筛选与获取
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
Bt基因
Ti质粒
重组DNA分子
将目的基因插入染色体DNA中
从社会中来
基因工程的基本操作程序：
获：目的基因的筛选与获取
构：基因表达载体的构建
导：将目的基因导入受体细胞
检：目的基因的检测和鉴定
（核心）
从社会中来
（1）定义：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要是指编码蛋白质的基因。
如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
一.目的基因的筛选与获取
1.目的基因
非编码区
非编码区
启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录
编码区
（1）原核生物基因
终止子：终止转录
非编码区
组成：编码区上游与编码区下游
功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
启动子：RNA聚合酶结合位点 转录起始的信号
终止子：终止RNA的合成
编码区：编码蛋白质的合成
一.目的基因的筛选与获取
2.基因的结构
　 科学工作者分离得到了某原核生物基因，并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使RNA杂交配对，结果如图所示。
非编码区
非编码区
编码区
信使RNA
基因的一条链
Ａ
Ｂ
Ｃ
一.目的基因的筛选与获取
1.目的基因
（1）原核生物基因
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
加 工
mRNA前体
成熟mRNA
不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列
编码序列=外显子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
一.目的基因的筛选与获取
1.目的基因
（2）真核生物基因
转 录
成熟信使RNA
对应基因的一条链
编码区
非编码区
非编码区
Ａ
Ｂ
Ｃ
一.目的基因的筛选与获取
1.目的基因
（2）真核生物基因
【思考1】从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是 。
胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
（2）编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？
连续
不连续
编码区
非编码
（1）非编码序列：
包括非编码区和内含子
【思考2】
一.目的基因的筛选与获取
1.目的基因
目的基因获取方法
利用PCR获取和扩增目的基因
一.目的基因的筛选与获取
2.目的基因的获取方法
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
通过DNA合成仪直接合成
从基因文库中获取
基因组文库
部分基因文库（cDNA文库）
基因文库：
①基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。
一.目的基因的筛选与获取
2.目的基因的获取方法
(1)从基因文库中直接获取
①建立基因组文库
某生物所有DNA
特定的限制酶
基因组所有基因
每个基因和载体结合重组DNA分子
导入受体菌
基因组文库
一.目的基因的筛选与获取
(1)从基因文库中直接获取
②建立cDNA基因文库
某种生物的成熟mRNA
单链DNA
双链DNA片段（cDNA）
导入受体菌中储存
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
与载体连接
一.目的基因的筛选与获取
(1)从基因文库中直接获取
基因组文库和部分基因文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
一.目的基因的筛选与获取
(1)从基因文库中直接获取
DNA合成仪
①前提：基因比较小、核苷酸序列已知
②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
一.目的基因的筛选与获取
2.目的基因的获取方法
(2)人工合成
目的基因的mRNA
单链DNA (cDNA）
双链DNA
(即目的基因)
反转录
合成
反转录法：
根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
推测
推测
目的基因
化学合成
一.目的基因的筛选与获取
2.目的基因的获取方法
(2)人工合成
PCR由穆里斯等人（先入为主）于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖
如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。
一.目的基因的筛选与获取
2.目的基因的获取方法
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献。钱嘉韵（中国台湾省，1976年）
PCR是_______________的缩写，是一项根据___________
________的原理，在____提供参与DNA复制的_______与_________，对____________________进行________的技术；
PCR技术：
聚合酶链式反应
DNA半保
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
全称
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
可以在短时间内大量扩增目的基因
一.目的基因的筛选与获取
2.目的基因的获取方法
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
留复制
原理
操作环境
目的
优点：
①DNA复制所需的基本条件:
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（体外用耐高温的DNA聚合酶）
（体外用高温代替）
（2种）
引物是一小段能与__________的一段碱基序列__________的____________
DNA母链
互补配对
短单链核酸
3’
5’
DNA母链
3’
5’
DNA母链
3’
5’
引物
3’
5’
引物
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
②PCR条件:
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
B.复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
③PCR反应过程
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
目的基因DNA__________后__________，______与单链相应互补序列结合；然后以___________为模板在____________作用下进行_____，即将4种____________加到____________，如此重复循环多次。
过程归纳：
受热变性
解为单链
引物
延伸
单链DNA
DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，即成_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
产物
模板
一倍
指数
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
3`
5`
5`
3`
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
模板DNA
目的基因
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
变性
3`
5`
5`
3`
第一轮
含有目的基因的双链DNA片段
DNA解聚为单链
温度上升到90℃以上
变性
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
退火
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第一轮
两条DNA单链
引物和两条单链DNA碱基互补配对
温度下降到50℃左右
复性
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
延伸
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第一轮
引物和互补DNA结合
脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则合成新的DNA链
温度上升到72℃左右
延伸
思考：循环N次，会得到多少个DNA分子呢？
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
变性
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
退火
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
延伸
Taq聚合酶
引物1
引物2
原料
第二轮
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
变性
第三轮
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
退火
第三轮
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
92
55
75
℃
延伸
第三轮
思考：继续循环N次，会得到多少个DNA分子呢？
一.目的基因的筛选与获取
③PCR反应过程
一.目的基因的筛选与获取
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
【例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
(1）第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
一.目的基因的筛选与获取
(2)两种引物与模板链如何配对？ 。
引物的5′端与模板链3′端互补配对
【例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
一.目的基因的筛选与获取
(2)两种引物与模板链如何配对？ 。
引物的5′端与模板链3′端互补配对
【例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
一.目的基因的筛选与获取
(3)延伸时需要加入两种引物，原因是
。
(4)两种引物的要求：
。
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
①引物自身不能环化
②两种引物之间不能互补配对
③引物长度不宜过短，防止引物随机结合
【例1】设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
一.目的基因的筛选与获取
(1)在PCR技术扩增目的基因时 （需要/不需要）解旋酶，原因是
。
(2)利用PCR技术扩增目的基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计
种引物，进行PCR时需加热至90∽95度然后冷却至55∽60度，此操作的目的是
。
【例2】如图为PCR技术扩增图解，请回答下列问题
不需要
PCR过程中是通过高温使DNA双链解聚为单链的，而不是用解旋酶
两
①90∽95度高温使DNA解聚为单链，
②然后冷却至55∽60度使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
一.目的基因的筛选与获取
（3）利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入两种引物，原因是
　　 ，在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。DNA聚合酶只能特异地复制处于　　 之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。
(4)目的基因能被准确扩增的原因是
。
DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
两个引物
从子链的5′端向3′端延伸
5
目的基因独特的双螺旋结构提供了精确的复制模板；碱基互补配对原则保证复制准确的进行
(2n+1-2)=62
一.目的基因的筛选与获取
(5)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的__________和_________，前者由________ 自动调控，后者则靠___________来维持。
（6）从理论上讲，在PCR技术中，循环4次产生的DNA分子中，第四次循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
（7）假设DNA片段有150个脱氧核苷酸对，若DNA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸有70个，则5次循环，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个（不考虑引物所对应的片段）
（8）假设DNA片段有200个脱氧核苷酸对，经3次扩增后，从理论上计算，除需要引物14个外（注：每个引物中含有20个脱氧核苷酸），还需要游离的脱氧核苷酸 个。
温度
PH值
PCR扩增仪
缓冲液
15/16
2480
2520
(2n-1)T
(2n-1)400 - 20×14
(2n+1-2)=14
一.目的基因的筛选与获取
（9）用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如下图所示，X为某限制酶识别序列。扩增得到的绝大部分DNA片段是图A-D中的（ ）
D
一.目的基因的筛选与获取
(10)如图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向．
(11)若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是 。
引物甲、引物丙
一.目的基因的筛选与获取
获得了足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？若这样操作，效果如何？
核心步骤——基因表达载体构建
目的：确保目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，并且能遗传给下一代。
二.基因表达载体的构建
1.目的
作为基因表达载体，除了目的基因外，还需要哪些元件呢？
启动子：
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
终止子：
终止目的基因转录的脱氧核苷酸序列。
初步筛选出接受了目的基因的受体细胞。常用的标记基因有抗性基因（如抗生素抗性基因）等。
二.基因表达载体的构建
2.组成
辨析：“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”
启动子与终止子位于DNA分子中，
作用：起始和终止转录过程。
启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，
作用：起始和终止翻译过程。
二.基因表达载体的构建
【思考1】
结合图示，概述基因表达载体构建的流程：
①用限制酶切割载体，使它出现一个缺口；
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，获取目的基因；
③用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体缺口处，形成重组DNA分子。
目的基因
重组DNA分子
目的基因
二.基因表达载体的构建
【思考2】
（1）如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)
？
目的基因——载体连接物、
载体——载体连接物、
目的基因——目的基因连接物。
二.基因表达载体的构建
【思考3】
（2）如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
双酶切
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
二.基因表达载体的构建
【思考3】
启动子
首端
RNA聚合酶
转录
终止子
尾端
RNA聚合酶
转录
标记
目的基因
基因表达载体的组成：
二.基因表达载体的构建
【小结】
【例9】（2021，高三一模改编，衡水）目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于 。观察上图，如果A为质粒，则C表示 。
供重组DNA的鉴定和选择
重组质粒
二.基因表达载体的构建
(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
。
二.基因表达载体的构建
(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过____________作用恢复________________________键，成功地获得了重组质粒。能形成重组质粒的原因是______________________________________________。
DNA连接酶
磷酸二酯键
两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同
二.基因表达载体的构建
(4) 作为受体大肠杆菌应不含________________，以方便筛选已导入重组质粒的受体大肠杆菌。将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是
_，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________。
ampR和tetR（或氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因）
能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素
pBR322 质粒
二.基因表达载体的构建
（5）基因工程中使用的限制酶，其特点是______
_________________，下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。
将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X－1混合连接，连接后获得的质粒类型有 。（可多选）
A．X－1 B．X－2 C．X－3 D．X－4
ABC
识别双链DNA
分子某种特定核苷酸序列，切割特定部位的磷酸二酯键
Tcr
Tcr
Apr
Apr
E1
E1
E1
E1
E1
E1
E1
E2
E2
E2
E2
E2
X－1
X－2
X－3
X－4
二.基因表达载体的构建
(6)若将上图所示X-1、X-2、X-3、X-4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上．在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有______、______．
无质粒细胞
Tcr
Tcr
Apr
Apr
E1
E1
E1
E1
E1
E1
E1
E2
E2
E2
E2
E2
X－1
X－2
X－3
X－4
含X-3的细胞
二.基因表达载体的构建
（7）图1为某种常用质粒的序列图，LacZ基因编码的酶能使无色的X﹣gal变为蓝色，Ampr为氨苄青霉素抗性基因．图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列．请回答下列问题：
实验小组用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒，若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有 和 ．
氨苄青霉素
X﹣gal
二.基因表达载体的构建
（7）图1为某种常用质粒的序列图，LacZ基因编码的酶能使无色的X﹣gal变为蓝色，Ampr为氨苄青霉素抗性基因．图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列．请回答下列问题：
成功导入重组质粒的大肠杆菌菌落显 ， 若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入 ． 没有导入任何外源DNA的大肠杆菌 （填“能”或“不能）在该培养基上生存．
白色
无目的基因的空质粒
不能
二.基因表达载体的构建
（8）为制备目的基因Y（图19）与质粒X（图20）的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性核酸内切酶BgIⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR
要筛选含有重组质粒的Z细胞，应选择 的培养基。
含卡那霉素但不含亮氨酸的培养基
二.基因表达载体的构建