生物人教版（2019）选择性必修3 1.2微生物的培养技术（共45张ppt）

(共45张PPT)
问题情境
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶。由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶。自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
制作工具和原料灭菌
控制发酵条件避免杂菌进入
接种纯的菌种
微生物的无菌培养技术
第二节 微生物的培养技术及应用
1.什么是培养基？如何配制？
2.什么是无菌技术？
3.怎样进行酵母菌的纯培养？
杂菌属于微生物，你知道杂菌属于微生物中的哪种类型吗？
微生物
微生物：难以用肉眼观察的微小生物的统称。
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
微生物的类群
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；
放线菌：链霉菌等
真菌：酵母菌、毛霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
培养基的配制
若想通过肉眼能看到细菌，我们又该如何？
菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
毛霉
培养基的配制
培养基（培养液）
1. 定义
人们按照微生物对营养物质的不同需求，
配制出供其生长繁殖的营养基质。
2. 用途
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
培养皿
培养基
培养基的配制
划分 培养基种类 特点 用途
物理性质
不加凝固剂
加凝固剂，如琼脂，明胶，硅胶等，
扩大培养、工业生产
观察微生物运动
获取单菌落、鉴定、活菌计数、保藏菌种
液体培养基
固体培养基
半固体培养基
少量凝固剂
培养基的配制
选择培养基
鉴别培养基
：根据某种微生物的特殊营养要求配置。
：加入能与目的菌的代谢产物发生显色
反应的指示剂。
②功能
选择
分离
鉴定
培养基的配制
选择培养基
鉴别培养基
：根据某种微生物的特殊营养要求配置。
：加入能与目的菌的代谢产物发生显色
反应的指示剂。
②功能
例1，加入青霉素的培养基：分离酵母菌、霉菌等真菌；
例2，不加氮源的无氮培养基：分离固氮菌；
例3，不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物
例1，加入伊红美蓝的培养基：鉴别大肠杆菌
例2，加入刚果红的培养基：鉴别纤维素分解菌
A.选择培养基：将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。
B.鉴别培养基：用于鉴别不同类型的微生物
培养基的配制
天然培养基
合成培养基
：含化学成分不明确的天然物质
：用已知的化学物质配制
③成分来源
工业生产
分类鉴定
培养基的配制
结合教材P10中“表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成”，分析培养微生物的培养基必备营养成分有哪些？
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素
蛋白胨 10g 氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 水
培养基的配制
（1）基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
1）碳源：
无机碳源：
CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：
葡萄糖、牛肉膏等
自养微生物
异养微生物
2）氮源：
无机氮源：
NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：
蛋白胨、尿素、氨基酸等
注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源
3）无机盐：
Ca、K 、Mg为大量元素
Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素
凡是能够为微生物提供C、N等元素的营养物质。
培养基的配制
（2）培养基的特殊需求
在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对___、____________以及___的需求；
pH
特殊营养物质
O2
微生物例子 培养基需要的特殊物质或条件
乳酸杆菌
霉菌
细菌
厌氧微生物
添加维生素
调至酸性
调至中性或弱碱性
提供无氧的条件
无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染
无菌技术
1.概念：
_____________的培养微生物的操作技术
2.手段：
主要包括____和____。
（1）对实验操作的____、操作者的________，进行清洁和消毒。
（2）将用于微生物培养的____、________和______等进行灭菌。
无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
还能有效避免操作者被微生物感染。
防止杂菌污染
消毒
灭菌
空间
衣着和手
器皿
接种用具
培养基
无菌技术
【消毒】用温和的理化因素仅杀死物体内外“部分”微生物（不包括芽孢和孢子）。方法有：
①煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min。
②巴氏消毒法：62-65℃下煮30min 或 80-90℃下煮30s-1min。
③化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。
④紫外线消毒法：
用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台
无菌技术
【灭菌】用强烈的理化因素杀死物体内外“所有”微生物（包括芽孢和孢子）。
【芽孢】有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
【孢子】细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
无菌技术
①湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121℃下维持15-30min。
注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。
②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170 ℃下加热2-3h。
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于玻璃器皿 、金属器具的灭菌。
③灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧
对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位
无菌技术
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121 ℃,15～30 min
接种室、接种箱，超净工作台
微生物的纯培养
培养物：
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。
该菌落是纯培养物吗？
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物（≈单菌落）
获得纯培养物的过程就是纯培养。
微生物的纯培养常用方法有：
平板划线法和稀释涂布平板法。
微生物的纯培养
微生物的纯培养
微生物的纯培养
微生物的纯培养，包括以下步骤：
1. 制备培养基、
2. 灭菌、
3. 接种
4. 分离
5. 培养等步骤。
微生物的纯培养
①制备培养基
配制培养基
称取去皮的马铃薯200g
切成小块
加水1000mL，加热煮沸至马铃薯软烂
用纱布过滤
滤液中加入20g葡萄糖，15~20g琼脂
用蒸馏水定容至1000mL
得到滤液
步骤:
微生物的纯培养
灭菌
将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞
包上牛皮纸，并用皮筋勒紧
压力100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15 ~ 30min
取5 ~ 8套培养皿
培养皿叠成一束
用几层牛皮纸包紧
放入干热灭菌箱内，160 ~ 170℃灭菌2h
①制备培养基
微生物的纯培养
倒平板
微生物的纯培养
思考2：为什么需要使锥形瓶的瓶口过火焰？
思考3：平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
思考5：怎么确定所倒平板未被杂菌污染？
思考1：培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
思考4：在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
微生物的纯培养
②接种和分离酵母菌
微生物的纯培养
②接种和分离酵母菌
通过接种环在固体培养基（平板）表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到由单个微生物繁殖而形成的单菌落。
▲注意：
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次；
②划线首尾不能相接；
③划线用力要注意，不要划破培养基表面；
④每次划线前接种环进行灭菌；
⑤划线后,培养皿倒置培养。
微生物的纯培养
灼烧时期 目的
取菌种前
每次划线前
接种结束后
为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞
杀死接种环上原有微生物
微生物的纯培养
③培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右 (培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异) 的恒温培养箱中培养24 ~ 48h。
微生物的选择培养
培养物
纯培养物
纯培养
将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
过程
配制培养基→灭菌→接种→分离→培养
菌落
如何从自然界中分离出需要的特定微生物？
微生物的选择培养
美国黄石国家公园
水生栖热菌(Thermus aquaticus)
提取
用于
聚合酶链式反应
体外DNA扩增
微生物的选择培养
2.实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的
培养基，叫做选择培养基。
不加有机碳源
不加氮源
自养微生物
酵母菌和霉菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)
固氮微生物
加入青霉素
加高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
石油是唯一碳源
能消除石油污染的微生物
微生物的选择培养
如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
尿素的立体结构
尿素含氮量高，化学性质稳定，是一种重要的农业氮肥，尿素施入土壤后，被某些细菌分解成NH3，NH3再转化成NO3-、NH4+等才能被植物吸收。
土壤中尿素分解菌之所以能将尿素分解，是因为它们能合成脲酶：
CO(NH2)2 + H2O 2NH3 + CO2
脲酶
微生物的数量测定
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。
90mL无菌水
2
铲取土样，将样品装入纸袋中。
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶，充分摇匀
1
3
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中
1×10
1×102
微生物的数量测定
1mL
1mL
1mL
1mL
1mL
3
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
微生物的数量测定
1×107
微生物的数量测定
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
微生物的数量测定
待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。在涂有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落
培养：
7
微生物的数量测定
微生物的数量测定
同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，选择菌落数为30~300的平板计数。
计算出菌落平均数。
稀释涂布平板法的计算方法：
其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(一般0.1ml)，M代表稀释倍数。则每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M
统计的菌落往往比活菌的实际数目低
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数。
微生物的数量测定
酵母菌是属于真核生物，可以用血细胞计数板对其进行种群数量的计数。血细胞计数板只适用于真核细胞的计数。要对细菌（原核细胞）进行计数则需要细菌计数板。
显微镜直接计数法
血细胞计数板和细菌计数板
显微镜直接计数法
——直接计数法
统计结果一般是活菌数和死菌数的总和，故计算结果比实际值偏大。
微生物计数的方法
微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。
项目 直接计数法 间接计数法
原理 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
主要用具 显微镜、细菌计数板 培养基
计数数据 菌体本身 培养基上菌落数
优点 计数方便、操作简单 计数的是活菌
缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较复杂，有一定误差
计算公式 每毫升原液含菌数=每小格平均菌体数×400×10000×稀释倍数 每毫升原液含菌数=培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积
微生物的数量测定
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
【课堂小结】