(共24张PPT)
第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
二 微生物的选择培养和计数
一、选择培养基
自然界中微生物数量繁多,种类庞杂,要想从中分离出需要的特定微生物并不容易,尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时,仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。
1973年,科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌,进而提取出耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢?
这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存,而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
根据微生物对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。
实例:寻找耐高温的DNA聚合酶
一、选择培养基
1.实验室中微生物筛选的原理
人为提供_____________________的条件(包括_______、_______和_____等),同时_________________________________。
有利于目的菌生长
抑制或阻止其他微生物的生长
营养
温度
pH
2.选择培养基的概念
在微生物学中,将允许____________________生长,同时______或_______其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。
特定种类的微生物
抑制
阻止
培养基
培养基+
氨苄青霉素
长出各种各样的细菌
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
一、选择培养基
3.类型:
(1)改变培养条件。
70~80℃的高温
分离耐高温的水生栖热菌
使用将pH调至酸性的培养基
分离耐酸菌
(2)改变培养基中的营养成分。
不加碳源(含碳有机物)的培养基
不加氮源的培养基
分离出固氮菌
分离出自养型微生物
(3)添加某种化学物质。
加入青霉素
分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基
分离得到金黄色葡萄球菌
一、选择培养基
思考 讨论
选择培养基配方的设计
尿素[CO(NH2)2]含氮量高,化学性质稳定,是现代农业生产中一种重要的氮肥。
尿素施入土壤后,会被土壤中的某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
在选择培养基中,以尿素作为唯一氮源,只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
1.将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来,培养基的配方该如何设计?
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点?
除以尿素作为唯一氮源外,该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
一、选择培养基
只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,缺乏脲酶的微生物不能分解尿素,而缺乏氮源的微生物是不能生长发育繁殖的。
利用以尿素作唯一氮源的选择培养基,可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
配方:
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g MgSO4·7H2O 0.2g -
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml -
思考 讨论
选择培养基配方的设计
应该设置基础培养基或完全培养基作为对照,若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基,则该选择培养基具有选择性。
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢?
碳源
氮源
提供无机盐,调节pH
凝固剂
二、微生物的选择培养
由于土壤细菌的数量庞大,要想得到特定微生物的纯培养物,必须要对土壤进行__________,然后再将菌液_______到制备好的______________上。
充分稀释
涂布
选择培养基
如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌,仅有选择培养基是不够的,还需要对土样进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法。
主要过程:
A. 梯度稀释菌液 B. 涂布平板
二、微生物的选择培养
A.梯度稀释菌液
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中,依次等比稀释。
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
二、微生物的选择培养
取0.1mL菌液,滴加到培养基表面。
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
将涂布器放在火焰上灼烧,待酒精燃尽、涂布器冷却后,再进行涂布。
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿,使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,培养。
微量移液器
B.涂布平板
二、微生物的选择培养
注意事项:
10g土样加入盛有90mL无菌水中后,已稀释10倍,再计算时,不要忽略;
由于使用的是选择培养基,所以一般情况下,获得的单菌落即目的菌,但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖,所以还需要进一步验证;
过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行;
将涂布器从酒精中取出时,要让多余的酒精在烧杯中滴尽,然后再放在火焰上灼烧;不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中,以免引燃酒精。
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具
原理
特点
平板 示图
共同点 将菌液进行一系列的_________,稀释度足够高时,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。
通过接种环在琼脂固体培养基的表面_________操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面
连续划线
梯度稀释
二、微生物的选择培养
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
接种环
涂布器
方法简单,但不适宜计数
可以计数,但操作复杂
使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
三、微生物的数量测定
①原理:
当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。
选择30-300个菌落的平板进行计数;
每个稀释度至少取3个平板取其平均值;
统计的菌落往往比活菌的实际数目低;
统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示;
恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。
②计数原则:
因为当两个或多个细胞连在一起时,繁殖后形成的还是一个菌落。
1.间接计数法 — 稀释涂布平板法
三、微生物的数量测定
M代表稀释倍数;
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数;
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数=(C÷V)×M
③计算公式:
例:甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板,菌落数分别是80、90、100,涂布平板时均使用0.1ml菌液,试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目?
(80+90+100)/3
0.1
× 105 = 9 ×107个
1.间接计数法——稀释涂布平板法
三、微生物的数量测定
不能区分死菌与活菌→导致结果偏大;
个体小的细菌在显微镜下难以观察;
2.直接计数——计数板计数法
①原理:
利用细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。
②缺点:
血细胞计数板:
细菌计数板:
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
(“染色排除法”)
三、微生物的数量测定
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具
计数依据
优点
计算公式
缺点
结果
3.两种计数方法的比较
细菌计数板或血细胞计数板
涂布器
细菌个数
培养基上菌落数
计数方便、操作简单
计数的是活菌
每毫升原液含菌株数=每小格平均菌株数×400×1 0000×稀释倍数
每克样品中的菌株数:(C÷V)×M
不能区分死菌与活菌
当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
比实际值偏大
比实际值偏小
探究 实践 土壤中分离尿素的细菌的分离与计数
绝大多数微生物都能利用葡萄糖,但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的选择培养基,可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
常见的分解尿素的微生物:芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌,某些真菌和放线菌也能分解尿素。
1.实验目的:
(1)从土壤中分离出能够分解尿素的细菌
(2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌
2.实验原理:
3.操作步骤:
(1)土壤取样
(2)配制培养基
取样地点要求:酸碱度接近中性的潮湿土壤
取样过程:铲去表土(一般3cm左右)
注意事项:铁铲和取样袋在使用前都要灭菌;事毕洗手。
选择培养基 *以尿素为唯一氮源
完全培养基
——作为对照,来判断选择培养基是否具有选择作用
探究 实践 土壤中分离尿素的细菌的分离与计数
(3)样品的稀释与涂布平板
选择培养基
(平行重复)
牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照)
探究 实践 土壤中分离尿素的细菌的分离与计数
3.操作步骤:
测细菌数:一般用104、105、106稀释液
测放线菌:一般用103、104、105稀释液
测真菌数:一般用102、103、104稀释液
选择一个比较宽的范围,将1×103~1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养,以保证能从中选择出菌落数在30~300的平板进行计数。
思考:在初次实验中,对于稀释的范围没有把握,怎样做才能保证从中选择出菌落数在30~300的平板进行计数??
探究 实践 土壤中分离尿素的细菌的分离与计数
3.操作步骤:
放线菌
①不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和培养时间。
细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。
②每隔24h统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记录作为结果,
防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③一般来说,在相同的培养条件下,同种微生物表现出稳定的菌落特征。
4.微生物的培养与观察
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗?
不一定,还需要进一步的鉴定
探究 实践 土壤中分离尿素的细菌的分离与计数
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后,如果PH升高,指示剂将变红,说明该细菌能够分解尿素。
CO(NH2)2+H2O CO2+2NH3
脲酶
原理:脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性
①液体培养基可以直接看液体的变色情况;
②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带,红色环带直径与菌落直径比值越大,说明分解能力越强。
5. 鉴定培养基
土壤中分解尿素的细菌的鉴定
探究 实践 土壤中分离尿素的细菌的分离与计数
P20.地球上的植物每年产生的纤维素超过70 亿吨,其中40%~ 60%能被土壤中某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用,使人们能够利用秸秆等生产酒精,用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料,它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时,刚果红与纤维素形成红色复合物;而当纤维素被纤维素分解菌分解后,复合物就无法形成,培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈。
(2)有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
可以选择纤维素丰富的环境,如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
可行,这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
(1)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌?为什么?
探究 实践 土壤中分离尿素的细菌的分离与计数
四、练习与应用
1.研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌,判断下列相关表述是否正确。
(1)这种培养基是一种选择培养基。( )
(2)利用这种石油降解菌可以降解石油,修复土壤。( )
(3)相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。( )
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是( )
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D