(共23张PPT)
第 1章 发酵工程
1.2 微生物的培养技术及应用 第1课时
微生物的基本培养技术
2 通过对培养皿和培养基进行灭菌 ， 了解消毒和
灭菌的原理及方法。
3 概述微生物纯培养的基本操作要求 ， 进行酵
通过配制培养基，掌握配制培养基的基本步
骤，以及培养基中各类营养物质的配比。
物
学习目标
母菌的纯培养。
1
向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经
过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家 里自制酸奶， 自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不 适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。
那么怎么才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？
防止杂菌污染 ， 获得纯净的微生物培养物 是研究和应用微生物
的前提，也是发酵工程的重要基础。
从社会中来
应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发 酵条件，避免杂菌进入。
一、微生物类群及实验室培养条件
1.什么是微生物？ 难以用肉眼观察的微小生物的统称。
本章提及的微生物主要指 用于发酵的细菌和真菌。
新冠病毒、噬菌体等
微生物的类群
无细胞结构的病毒
真核细胞
原核细胞
真菌、原生生物等
细菌、放线菌等
草履虫
青霉菌
2.实验室培养微生物的关键
微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微
生物，就必须对其进行培养和分离。
一、微生物类群及实验室培养条件
高压蒸汽灭菌锅
被污染的培养基
(1）提供微生物生长繁 殖所需营养和环境条件
(3)并将需要的微生物 分离出来
(2）确保其它微 生物无法混入
培养基
无菌技术
纯化培养
1、培养基概念： 人们按照微生物对营养物质的不同需求， 配制出供其生长繁殖的营养基质。
2、培养基作用： 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
3、培养基类型： 按物理性质分
二、培养基的配制（自主阅读课本P9 ，回答以下问题）
注：琼脂仅作为凝固剂，不能为微生物生长提供能量和碳源
微生物在固体培 养基表面生长， 可以形成肉眼可 见的菌落。
微生物的分离、鉴定、 活菌计数
扩大培养、工业生产
液体培养基
固体培养基
琼脂
有无
划分标准 培养基种类 特点
用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂
固体培养基
微生物分离、鉴定、 活菌计数、保藏菌种
化学成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成培养基 培养基成分明确
分类、鉴定
用途 选择培养基 在培养基中加入某种化学物质,以抑 制不需要的微生物的生长,促进所需 要的微生物的生长
培养、分离出特定 微生物
鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学 药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类
微生物
二、培养基的配制（补充资料1-培养基的类型及用途）
1）碳源：{无机碳源： CO2、CO3 、HCO3
、有机氮源： 牛肉膏、蛋白胨、尿素、 氨基酸等
注： ①一般有机碳既是碳源又是能源。
②为何培养基需要氮源？无机氮源也能提供能量吗？
培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
氨气氧化过程的化学能可以为硝化细菌提供能量，合成有机物。
-
2-
4、培养基的营养构成:
（1）基本成分：水、碳源、氮源、无机盐
二、培养基的配制（自主阅读课本P10）
2）氮源：{ 无机氮源： NH4＋ 、NO3- 、NH3等
有机碳源： 葡萄糖、 牛肉膏、蛋白胨等
例： 1.培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加
2.培养霉菌时，需要将培养基调制
3.培养细菌时，需要将培养基调制
4.培养厌氧微生物时，需要提供
二、培养基的配制
注： ③培养基还需满足微生物对 pH、特殊营养物质、氧气的需求
此培养基可用来培养自养型微生物。圆褐固氮菌虽可以固氮，但其同 化作用类型为异养型，培养基中必须提供有机碳源，所以该培养基不 能用来培养圆褐固氮菌。
2 ．培养微生物时，培养基中是否必须有碳源和氮源？
不一定。例如，培养自养型微生物时，一般不需要添加碳源，微生物可 以利用空气中的二氧化碳；培养固氮微生物时，一般不需要添加氮源， 微生物可以利用空气中的氮气。
编号 ① ② ③ ④
⑤
成分 (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4 CaCl2
H2O
含量/g 0.4 4.0 0.5 0.5
100 mL
1.下表是某微生物培养基的成分 ，请分析该培养基可用来培养哪种微生
物？若除去①,此培养基可用来培养圆褐固氮菌吗？
活学活用
微生物统统 杀 杀 杀
.消毒： 是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表 面或内部一部分微生物。
.灭菌： 是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括 芽孢和孢子。
（1）防止培养物被污染
（2）防止感染实验操作者
2 类型
三、无菌技术 超净工作台
1 目的（P10）
芽孢： 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体 (不是繁殖体)，叫作芽孢。 芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的 抵抗力。例如，有的细菌的芽孢煮沸3小时以后才死亡。芽孢 又小又轻，可以随风飘散。 当环境适宜(如温度、水分适宜) 的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。 孢子： 细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性 生殖细胞。能直接发育成新个体。
三、无菌技术
芽孢和孢子
u知识拓展
类型 操作方法
适用范围
消 毒
灭 菌
三、无菌技术
请同学们自主学习课本P10-11 页，尝试完成以下表格。
项目 主要方法
适用范围
消毒 63～65 ℃消毒30 min 或72～76 ℃处理15 s，或 80～85℃处理10-15 s
牛奶 、啤酒、果酒和酱 油等不耐高温的液体
100 ℃煮沸 5～6 min
家庭餐具等生活用品
30 W紫外灯照射30min (损伤细菌的DNA)
接种室、 接种箱或超 净工作台
体积分数为70%～75%的酒精
擦拭实验者双手
氯气
水源
三、无菌技术
常用的消毒方法
项目 主要方法
适用范围
灭菌 灼烧灭菌 直接在酒精灯火焰的 充分燃烧 层灼烧
接种工具，如涂布器、接 种环、接种针或其他金属 用具； 试管口或瓶口等
干热灭菌 干热灭菌箱中，160～ 170 ℃ 的热空气中维持 1～2 h 。
耐高温的、需要保持干燥的 物品，如玻璃器皿、 金属用 具等
湿热灭菌 100 kPa、 121 ℃的条件 下，维持15～30 min
培养基等
三、无菌技术
高压蒸汽灭菌锅
常用的灭菌方法
（1）培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下
形成的含特定种类微生物的群体称为培养物；
（2）纯培养物、纯培养：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称
2 纯培养的步骤：
配制培养基、灭菌、接种、分离和培养
四、微生物的纯培养
为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
1 概念
①概念： 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成
肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
②特征： 大小、形状、隆起程度、颜色等。
③功能： 鉴定菌种的重要依据
四、微生物的纯培养
(1)原理： 微生物群 分散或稀释 单个细胞 繁殖 单个菌落
(3)获得单菌落的方法：
平板划线法、稀释涂布平板法
3 酵母菌的纯培养
(2)菌落：
四、微生物的纯培养
(4)步骤
Ⅰ.制备培养基 ①配制培养基 ②灭菌 ③倒平板
4.等待培养基冷却凝 固后，将培养皿倒过 来放置
3.用拇指和食指将培养皿 打开一条稍大于瓶口的缝
隙，将培养基（10-20mL）
2.将瓶口迅速通 过火焰
倒入培养皿，立即盖上皿 盖
1.拔出锥形瓶的棉塞
总结操作注意事项
1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你 用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的 部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置， 既可以防止皿盖上的水珠
落入培养基，又可以防止水分过快蒸发。
四、微生物的纯培养
注意：
①每次划线前、最后一次划线后接种
环进行灭菌；
灼烧接种环后，要待其冷却后才能伸
入菌液，以免温度太高杀死菌种。
②接种环只蘸一次菌液,但要在培养基
不同位置连续划线多次；
划线时，最后一区不要与第一区相连，
划线时用力大小要适当，防止用力过 大将培养基划破。
③划线后,培养皿倒置培养。
接种环灭菌
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
四、微生物的纯培养
4
3
总结平板划线法的操作注意事项
2
5
1
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接
种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入
28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有
差异)的恒温培养箱中培养24-48 h。
思考: 为什么要同时放入未接种的平板？
作对照，通过观察未接种平板是否有菌落存在
以确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。
四、微生物的纯培养
Ⅲ.培养酵母菌
■ 课堂小结
练一练 P14 【练习与应用】(共26张PPT)
第 1章 发酵工程
1.2 微生物的培养技术及应用 第2课时
微生物的选择培养和计数
1 阐明微生物选择培养的原理
2 进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
物
学习目标
聚合酶链式反应（PCR）是
一种在体外扩增DNA片段的技术， 此项技术要求使用耐高温的DNA 聚合酶。 1973年，科学家从美国黄 石国家公园的热泉中筛选出水生栖 热菌，进而提取出耐高温的DNA 聚合酶。这种酶目前已被广泛用于 聚合酶链式反应（PCR）。
思考：为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下
生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
问题探讨
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
实验室筛选微生物原理：
人为提供 有利于目的菌生长 的条件（包括 营养 、 温度 和 pH 等）
,同时 抑制或阻止其他微生物的生。长
选择培养基：在微生物学中，允许特别种类的微生物生长，同时
抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
一、选择培养基
思考 讨论： 怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
方法：利用选择培养基分离
抗氨苄青霉
的菌落
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨
培养基） 作为对照，若基础培养基中生 长的菌落数多于该选择培养基，则说明 该选择培养基具有选择性。
一、选择培养基
怎样选择出抗氨苄青霉素能
力的细菌
具有抗氨苄 青霉素能力
的菌落
长出各种各 样的细菌
基础培养基+氨苄青霉素
培养基中加氨苄青霉素
没有
素能力
基础培养基
被淘汰
选择培养基配方的设计
尿素［CO(NH2)2 ］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的
氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3 ，再被转化为
NO3- 、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成
脲酶， 脲酶催化尿素分解产生
尿素 NH3 (细菌生长的氮源)
讨论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养
基的配方该如何设计？设计一种选择培养基，以尿素作为唯一氮源。
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
3 ，NH3可以作为细菌生长的氮源。
尿素分解菌
脲酶
尿素
NH
用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划
线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成
一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀
死一部分菌类。
二、微生物的选择培养
1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
分离： 获得分解尿素的细 菌的纯培养物
计数： 测定分解尿素的 细菌的数量
1×102 1×103 1×104 1×105 1×106 1×107
9 mL 无菌水
10g
1×10
将10 g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌 液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中， 依次等比稀释。
二、微生物的选择培养
稀释涂布平板法
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
90mL无菌水
系列稀释
1 mL
浸在盛有酒
精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧， 待酒精燃尽、涂布器冷却后， 再进行涂布。
二、微生物的选择培养
微量 移液器
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表 面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
稀释涂布平板法
③取0.1mL菌液，滴
加到培养基表面。
涂布平板
④将涂布器
恒温培养箱
二、微生物的选择培养
稀释涂布平板法
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置 （同时放一个未接种的培养基），放入
30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。
稀释104倍
稀释103倍
稀释105倍
空白对照
培养
比较 平板划线法
稀释涂布平板法
工具 接种环
涂布器
操作 接种环在固体培养基表面连续划线
系列梯度稀释操作和涂布平板操作
复杂，需涂布多个平板
特点 结果
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离 纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征
二、微生物的选择培养
常用微生物分离方法比较
稀释液中的一个 活菌 。通过统计平板上的菌落数， 就能推测出样品中
大约含有多少 活菌 。
② 计数原则： 选用一定稀释范围的样品液进行培养， 以保证获得菌落数为30～300、
适于计数的平板。
在同一稀释度下，应至少对 3 个平板进行重复计数，然后求出 平均值 。
缺点： 统计的 菌落数 往往比活菌 的实际数目少
【原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。】
方法1：稀释涂布平板法 间接计数法
① 原理： 当样品的稀释度足够高时 ，培养基表面生长的一个单菌落 ，来源于样品
三、微生物的数量测定
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M：代表稀释倍数；
三、微生物的数量测定
4号试管的结果表明每克土壤 中的活菌数约为 1.1 ×108个
方法1：稀释涂布平板法
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
③ 计算公式：
间接计数法
三、微生物的数量测定
常用于相对较大的酵母菌细胞、
霉菌孢子等的计数
血细胞计数板
对细菌等较小的细胞进
行观察和计数
方法2：显微镜直接计数法
思考:为了避免上述缺点，我们该如何做？
可以染色（如使用台盼蓝，死细胞会被染成 蓝色）后再进行显微镜计数。
优点： 快速、直观
缺点： 不能区分死菌与活菌
原理： 利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数。
两者计数 原理相同
直接计数法
项目 显微镜直接计数法
稀释涂布平板法
主要用具 显微镜、 血细胞计数板 或细菌计数板 等
培养基等
计数依据 菌株本身
培养基上的 菌落 数
优点 计数方便、操作简单
计数的都是活菌
缺点 死菌、活菌都计数在内
操作复杂、有一定误差
三、微生物的数量测定
比较稀释涂布平板法和显微镜直接计数法
1.土壤取样
细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距
地表3～8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准 备好的信封中。
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
取土样时用的铁铲和取样
袋在使用前都需要灭菌。操作 完成后， 一定要洗手。
操作步骤
注意
2.样品的稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不
同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平 板。 测细菌数： 一般用104 、105 、106稀释液。
思考：在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证 从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分 别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300 的平板进行计数。
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1 探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
选择培养基 （平行重复）
牛肉膏蛋白胨培养基
(作为对照)
2.样品的稀释与涂布平板
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒
温培养箱中，培养1-2d。
1 探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
3.培养与观察
问题1：你是否获得了某一稀释度下菌落数 为30～300的平板？
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作 比较成功，能够进行菌落的计数。
问题2：你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数与其他同学统计的 结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就 需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。
内容 现象
结论
有无杂菌污染的 判断 对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
实验组培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
选择培养基的筛 选作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目 大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
4.结果分析与评价
5.进一步探究
得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？
得到的菌落不一定就是分解尿素的细菌 ，如自生固氮菌或利用（分解尿素的）
细菌的代谢物进行生长繁殖的微生物
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
不一定，还需要进一步的鉴定
混合样品
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。
培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红 ， 说明该细菌能够分解尿素。
探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
原理： 脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红
CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3
鉴定分解尿素的细菌
5.进一步探究
鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正
常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药 品发生反应。从而达到鉴定目标微生物的作用。
1 探究 实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
伊红-亚甲蓝琼脂培 养基鉴别大肠杆菌 （若有，菌落呈深 紫色，有金属光泽）
刚果红培养基鉴别纤 维素分解菌
划分标准 培养基种类 特点
用途
物理性质 液体培养基 不加凝固剂
半固体培养基 加凝固剂，如琼脂
固体培养基
微生物分离、鉴定、 活菌计数、保藏菌种
化学成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成培养基 培养基成分明确
分类、鉴定
用途 选择培养基 在培养基中加入某种化学物质,以抑 制不需要的微生物的生长,促进所需 要的微生物的生长
培养、分离出特定 微生物
鉴别培养基 在培养基中加入某种指示剂或化学 药品,用以鉴别不同种类的微生物
鉴别不同种类
微生物
补充资料-培养基的类型及用途）
课堂小结
土壤中分解尿素的细菌的分离与 计数
微 生 物 的 选 择 培 养 和 计 数
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
（3）稀释涂布平板法接种
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
稀释涂布平板法的操作过程
（4）微生物的培养与观察
选择培养基的作用
微生物的数量测定
微生物的选择培养
（2）样品的稀释
（1）土壤取样
选择培养基的概念及举例
培养基的制备
实验设计
结果分析
选择培养基
科学实例
筛选原则
练一练 P20 【练习与应用】
