(共26张PPT)
第3章 基因工程
第 1节 重组DNA技术的基本工具
从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番 木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科 学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基 因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺
旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作， 是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工 具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工
具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
转基因番木瓜
非转基因番木瓜
什么是基因工程？
基因工程
是按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特
性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操 作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，
因此又叫做重组DNA技术。
1.原理： 基因重组
2.操作对象： 基因
3.操作水平 分子水平
4.结果： 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的 生物类型和生物制品。
基因工程发展历程
20世纪70年代初， 多 种限制酶、DNA连接 酶和逆转录酶被相继 发现。这些发现为
DNA的切割、连接以 及功能基因的获得创 造了条件。
1944年艾弗里等人通 过肺炎链球菌的转化 实验，不仅证明了遗 传物质是DNA，还证 明了DNA可以在同种 生物的不同个体之间 转移。
1950年埃特曼发 明了一种测定氨 基酸序列的方法。 2年后，桑格首次 完成了对胰岛素 氨基酸序列的测 定。
1961年尼伦伯格和 马太破译了第一个 编码氨基酸的密码 子。截至1966年， 64个密码子均被破 译成功。
1958年梅塞尔森和 斯塔尔用实验证明 了DNA的半保留复 制。随后不久，克 里克提出中心法则。
1967年，科学家 发现，在细菌拟 核DNA之外的质 粒有自我复制能 力，并可以在细 菌细胞间转移。
1953年沃森和 克里克建立了 DNA双螺旋结 构模型并提出 了遗传物质自 我复制的假说。
1970年科学家在细 菌中发现了第一个
限制性核酸内切酶 （简称限制酶）
1973年，科学家证明 质粒可以作为基因工 程的载体，构建重组 DNA，导入受体细胞， 使外源基因在原核细 胞中成功表达，并实 现物种间的基因交流。 至此， 基因工程正式 问世。 1982年，第一个 基因工程药物-重 组人胰岛素被批 准上市。基因工 程药物成为世界 各国研究和投资 开发的热点。 1984年，我国科 学家朱作言领导 的团队培育出世 界上第一条转基 因鱼。 1990年，人 类基因组计 划启动。 2003年，该 计划的测序 任务顺利完 成。
2013年，华人科学家张 锋及其团队首次报道利 用最新的基因组编辑技 术—CRISPR（成簇规律 间隔短回文重复）技术 编辑了哺乳动物基因组。 该技术可以实现对特定 基因的定点插入、敲除 或替换。
基因工程发展历程
21世纪以来，科学
1977年，桑格等科学家 发明了DNA序列分析的方 法，为基因序列图的绘 制提供了可能。此后， DNA合成仪的问世为体外 合成DNA提供了方便。 1983年，科学家采用 农杆菌转化法培育出 世界上第一例转基因 烟草。此后， 基因工 程进入了迅速发展的 阶段。
家发明了多种高通 量测序技术，可以 实现低成本测定大 量核酸序列，加速 了人们对基因组序 列的了解。
1972年伯格首先在体 外进行了DNA改造的研 究，成功地构建了第 一个体外重组DNA分子。
1985年，穆里 斯等人发明了 PCR，为获取目 的基因提供了 有效手段。
“分子缝合针
“工欲善其事，必先利其器”。在培育转基因番木瓜时，既
要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接
”;又要将重组DNA分子导入番木瓜体内，并使其表达。
DNA分子极小，实现这些精确操作需要哪些“分子工具”呢？
将体外重组好的DNA 分子导入受体细胞
” 准确切割 DNA分子
“分子手术刀
将DNA片段 连接起来
“分子运输车”
”
核苷酸组成，
其他数量的核苷酸组成。
5.识别序列：
6.结果：
3.作用： 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条 链中特定部位的磷酸二酯键断开。
4.作用部位： 特定部位的磷酸二酯键
1.来源： 主要是从原核生物中分离纯化来的。
2.种类： 数千种
一、限制性内切核酸酶（限制酶)——“分子手术刀”
自学 自主阅读课本P71，思考以下问题：
一、限制性内切核酸酶（限制酶)——“分子手术刀”
点学
1.限制酶作用部位：
5’
4’
3’
G
A
1’
2’
1’
2’
5’端
5’端
3’端
3’端
4’
3’
5’
能被限制性内切酶特异性识 别的切割部位都具有回文序列。
限制酶所识别序列的特点是：
呈现碱基互补对称，无论是奇数 个碱基还是偶数个碱基，都可以 找到一条中心轴线，中轴线两侧 的双链DNA上的碱基是反向对称 重复排列的，称为回文序列。
在切割部位， 一条链正向读 的碱基顺序与另一条链反向读的 顺序完全一致。
一、限制性内切核酸酶（限制酶)——“分子手术刀”
2.限制酶的识别序列：
限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸， 它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
黏性末端
3.EcoRI 限制酶的切割： 点学
EcoRI 只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
一、限制性内切核酸酶（限制酶)——“分子手术刀”
黏性末端
黏性末端
一、限制性内切核酸酶（限制酶)——“分子手术刀”
3.EcoRI 限制酶的切割：
点学
黏性末端
4.Sma I 限制酶的切割： 点学
Sma Ⅰ 只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的 切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
一、限制性内切核酸酶（限制酶)——“分子手术刀”
中轴线
在C和G 之间切开
一、限制性内切核酸酶（限制酶)——“分子手术刀”
4.Smal 限制酶的切割： 点学
平末端
平末端
一、限制性内切核酸酶（限制酶)——“分子手术刀”
G A A T T C C T T A A G
G A A T T C C T T A A G
G A A T
C T T A A
T C
G
A A T T C
T A A G
用同种限制酶切割
思考： 把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
G
C
点学
(EcoRⅠ)
T
一、限制性内切核酸酶（限制酶)——“分子手术刀”
G
C T T A A
G
C T T A A
A A T T C
G
A A T T C
G
点学
缺口怎么办？
1.作用： 将两个 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两
个核苷酸之间的磷酸二酯键。
2.种类及各自来源、作用特点： E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
二、 DNA连接酶——“分子缝合针”
自学 自主阅读课本P72第一段，思考以下问题：
可把黏性末端之间的缝
隙“缝合”起来。
两DNA片段要具有互补的黏
性末端才能拼起来。
二、 DNA连接酶——“分子缝合针”
1. E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶的作用
点学
T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端， 又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对 较低。
DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
二、 DNA连接酶——“分子缝合针”
2. T4 DNA连接酶的作用
点学
二、 DNA连接酶——“分子缝合针” 3. E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶的比较 类型 来源 功能
相同点 差别 E·coli DNA连接酶 大肠杆菌 恢复磷酸 二酯键 只能连接黏性末端 T4 DNA连接酶 T4噬菌体 能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
点学
1.载体作用？ 将外源基因送入受体细胞。
2.载体种类： 质粒、噬菌体、动植物病毒等。
3.质粒？ 一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或
原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状 双链DNA分子。
4.标记基因的作用？ 便于重组DNA分子的筛选。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
自学 自主阅读课本P72—P73第一段，思考以下问题：
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的 受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入 受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生 素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体 的受体细胞。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.载体上标记基因的标记原理
分析
目的基因稳定存在且数量可扩大
可携带多个或多种外源基因
便于重组DNA分子的筛选
避免受体细胞受到损伤
条件
稳定并能复制
有一个至多个限制酶切割位点
具有特殊的标记基因
无毒害作用
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒， 都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 这些质粒上常含有特殊的标记基因。
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
点学
2.运载体需具备的条件
资料P57
限制酶 BamH Ⅰ HindⅢ EcoRⅠ
SmaⅠ
识别序 列及切割位点
当堂检测
从表中4种酶的切割位点看，可以切出平末端的酶是 SmaⅠ 。
如表为4种限制酶的识别序列及其切割位点，请回答下列问题：
1.图1中的质粒分子可被表中限制酶 Ec oRⅠ 切割。
2.在相关酶的作用下，图1中的甲与图2中的乙 能 (填“能”
或“不能”)拼接起来。请说明理由： 二者具有相同的黏性末端。
当堂检测
如表为4种限制酶的识别序列及其切割位点，请回答下列问题：
互学
回扣：从社会中来
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番 木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科 学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基 因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺
旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作， 是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工 具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工
具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
限制性内切核酸酶： 准确切割DNA分子
DNA连接酶： 将DNA片段连接起来
载体： 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
转基因番木瓜
非转基因番木瓜
分子运输车
分子缝合针
分子手术刀
工具(共11张PPT)
目标 02 提取与鉴定。 （科学思维）
运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。
01 （生命观念）
探究DNA的物理与化学性质， 进行DNA分子的
关注基因工程的诞生和发展历程， 参与讨论基础理
论和技术发展如何催生基因工程。
03 （社会责任）
学习目标
一、实验原理：
DNA 、RNA 、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差 异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行 提取。
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液。
（3）在一定温度下， DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
DNA的粗提取与鉴定
二、材料用具
1.选材： DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、
菜花和猪肝等。
2.试剂： ①研磨液 含有NaCl 、EDTA 、SDS 、Tris和HCl
②体积分数为95%的酒精 析出DNA
③2mol/L 的NaCl溶液 溶解DNA
④二苯胺试剂 鉴定DNA，要现配现用
⑤蒸馏水
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞
中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。
DNA的粗提取与鉴定
预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
DNA的粗提取与鉴定
过滤或离心取上清液
NaCl溶液溶解DNA并鉴定
取材、研磨
三、方法步骤：
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱 中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心 管中， 1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
思考：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质。
称取30g洋葱， 切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液， 充分研磨。
研磨目的： 使细胞核充分破碎，释放较多的DNA 。
1.取材、研磨：
DNA的粗提取与鉴定
2.过滤或离心取上清液：
在上清液中加入体积相等的、 预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静
置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个 方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。或将溶液倒入塑料离 心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物
(粗提取的DNA)晾干。
⑴搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的： 避免破坏DNA。
⑵析出DNA时必须用“冷酒精”。预冷的酒精具有以下优点：
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解。 ②抑制分子运动，使DNA 易形成沉淀析出。 ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
DNA的粗提取与鉴定
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状 物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加 入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。 待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
DNA的粗提取与鉴定
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
水浴加热
对照组
实验组
四、结果分析与评价
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色， 如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原 因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.与其他同学提取DNA进行比较，看实验结果有何不同，分析产生差异原因。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查 阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方 面比较实验结果，如DNA的纯度、 DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，
看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
DNA的粗提取与鉴定
五、进一步探究
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加
质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开； 随后，加 入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其 他杂质除去，取上清液； 可重复上述操作几次，直至上清液变成 透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核 酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA 溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液 器等实验用具就可以将两者分开。
DNA的粗提取与鉴定
当实验试剂缺乏时 ，可以用家用洗洁精或洗衣粉（含有蛋白酶的表面
活性剂）代替研磨液，也能达到裂解细胞膜、让蛋白质变性的目的。
还可以在研磨过滤后的滤液中加入嫩肉粉（含有木瓜蛋白酶） 促使蛋白
质水解。
DNA的粗提取与鉴定
核心归纳
DNA粗提取与鉴定实验成功的关键
(1)破碎细胞应彻底充分。
(2)对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时 ， 所用的酒精必须经过充
分预冷后才能使用。
(3)实验过程中搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部 ，并且搅拌要轻缓 ，并
沿一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
(4)由于玻璃表面带电荷 ， DNA易被吸附于玻璃表面 ， 故实验中应尽
量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
DNA的粗提取与鉴定
