(共45张PPT)
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业
化种植转基因抗虫棉。到2015年，我 国已育成转基因抗虫棉新品种100多 个，减少农药用量40万吨，增收节支 社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉
一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉与普通棉花
普通棉花(无抗虫特性)
棉花细胞(含抗虫基因)
棉花植株(有抗虫特性)
培育转基因抗虫棉的简要过程
苏云金杆菌
提取
抗虫基因
与运载体DNA拼接
导入
载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表 达，才能实现一种生物的基因在另一种生物 中的转化。
使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且遗 传给下一代，同时使目的基因能够表达和发 挥作用。
基因工程的基本操作程序
目的基因是否能够在受体细胞中维持和表达它 的遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。
有了目的基因，我们才能赋予一种生物新的 遗传特性。
目的基因的筛选与获取
目的基因的检测与鉴定
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
前提
保证
核心
关键
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
第一步：目的基因的筛选与获取
主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
1.原核细胞的基因结构
2.真核细胞的基因结构
一.目的基因：
三.基因结构：
二.实例：
组成：编码区上游与编码区下游
功能： 不能编码蛋白质， 调控遗传信息的表达
启动子： RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录出mRNA
终止子： 位于基因的尾端，相当于一盏红色信号灯， 使转录 在所需要的地方停下来
非编码区 编码区
非编码区
第一步：目的基因的筛选与获取
编码区： 编码蛋白质，连续不间断。
1.原核细胞的基因结构
别和结合位点 开始转录
非编码区：
聚合酶的识
终止转录
终止子：
启动子：
RNA
第一步：目的基因的筛选与获取
非编码序列：包括非编码区和内含子
编码区
非编码区 非编码区
2.真核细胞的基因结构
mRNA前体
成熟mRNA
1 2 3 4 5
启动子
外显子
终止子
内含子
转
加
工
录
原核细胞
真核细胞
不同点 编码区是连续的
编码区是间隔的、 不连续的
相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的 非编码区组成的
思考：编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞 基因结构一样长吗？
第一步：目的基因的筛选与获取
3.原核细胞与真核细胞的基因结构比较
四、目的基因的筛选与获取：
（一）筛选： 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（二）获取方法：
基因组文库
1.从基因文库中获取
2.人工合成 ⑵根据已知的氨基酸序列合成DNA
⑶人工合成法
3.利用PCR技术获取和扩增
第一步：目的基因的筛选与获取
⑴逆转录法
cDNA文库
1.从基因文库中获取目的基因（未知序列）
⑴基因文库概念：
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体
中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
⑵基因文库类型：
第一步：目的基因的筛选与获取
（包含一种生物的全部基因）
（包含一种生物的一部分基因）
{②部分基因文库
（cDNA文库）
①基因组文库
将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段， 然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了 一段不同的DNA片段。 这个菌群就叫做这种生物的基因组文库。
第一步：目的基因的筛选与获取
提取某种生物的全部DNA
将DNA片段
与载体连接
一定大小的DNA片段
导入受体菌中储存
①基因组文库的构建模式图
用适当的
限制酶酶切
基因组文库
用某种生物发育的某个时期的mRNA逆转 录产生的多种互补DNA (也叫cDNA)片段， 与载体连接后储存在一个受体菌群中，这 个受体菌群体叫做这种生物的cDNA文库。
第一步：目的基因的筛选与获取
核酸酶H （RNaseH） DNA聚合酶
②部分基因文库构建模式图
RNA-DNA 杂交分子
双链DNA
单链RNA
单链DNA
逆转录酶
文库类型 cDNA文库
基因组文库
文库大小 小
大
基因中启动子 无
有
基因中内含子 无
有
基因多少 某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间基因交流 可以
部分基因可以
⑷从基因文库中得到目的基因的方法
依据：目的基因的有关信息。 例如，根据基因的核苷酸序列、基因的 功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达 产物蛋白质等特性来获取目的基因。
第一步：目的基因的筛选与获取
⑶基因组文库和部分基因文库的比较
⑵根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列
推测
mRNA的核苷酸序列
推测
结构基因的核苷酸序列
化学合成
目的基因
2.人工合成目的基因
⑴逆转录法
目的基因的mRNA
反转录
单链DNA (cDNA）
合成
双链DNA
(即目的基因)
第一步：目的基因的筛选与获取
2.人工合成目的基因
⑶人工合成法 （序列已知）
①前提：基因比较小、核苷酸序列已知。
②方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因。
第一步：目的基因的筛选与获取
DNA合成仪
⑵概念：是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与
DNA复制的各种组分与反应条件， 对目的基因的核苷酸 序列进行大量复制的技术。
⑶条件 课本3-1
缓冲溶液、 DNA模板、 4种脱氧核苷酸、 耐高温的DNA聚合酶、 2种引物
第一步：目的基因的筛选与获取
3.利用PCR获取和扩增目的基因
⑴全称：
聚合酶链式反应
目的
环境
原理
缓冲溶液、 DNA模板、 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
DNA母链
5’ 3’
3’ 5’
引物
用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
实际操作时，加入的是四种 脱氧核苷三磷酸(dATP、dTTP、 dGTP 、dCTP )。
第一步：目的基因的筛选与获取
3.利用PCR获取和扩增目的基因
Mg2+
5’
3’
⑶条件
DNA母链
引物
5’
3’
DNA的一条单链具有两个末端， 一端有
一个游离的磷酸基团，这一端称为5’-端， 另一端有一个羟基（-OH），称作3’-端。
脱氧核糖上与碱基相连的的碳叫做1’-C， 与磷酸基团相连的碳叫做5’-C；
知识回顾——DNA的结构
3'
5'
5′
CH2
4′
H
3′
OH H
磷酸基团（与 5’ 相连）
T
G T
G
C T
A
C A
C
含氮碱基
磷酸
A T G C
G
A
T
5'○
3'
G
G
A
C
2′
1′
O
H
H
H
①两条链反向平行盘旋成双螺旋结构。
②脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外 侧，构成基本骨架；碱基排列在内侧。
③两条链上的碱基通过氢键连接成碱基 对，配对规律： A与T，G与C(碱基互补 配对原则)。
知识回顾——DNA的结构
DNA双螺旋结构的主要特点
立体双螺旋结构
平面结构
模板:两条母链
原料:游离的4种脱氧核苷酸
酶:DNA聚合酶
能量:ATP
原则:碱基互补配对
知识回顾——DNA的复制
解旋酶
解旋 (打开氢键)
螺旋化 双螺旋
形成子链
知识回顾——DNA的复制
1.子链DNA延伸的方向从5’到3’。
2.DNA聚合酶从引物3’端开始延伸DNA链。
3.复制不是从头开始，需要两种引物，引物结合在母链的3’端。
G C
A T C G A A T C G G T T
引物
母链 DNA
子链
DNA
DNA 聚合酶
3′
5′
5′
3′
U A
第一步：目的基因的筛选与获取
缓冲溶液
（含Mg2+)
3’ 5’
当温度上升到72℃左右时， 溶液中 的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚 合酶的作用下，根据碱基互补配对 原则合成新的DNA链
5’
5’ 3’
3’
当温度下降到50℃左右时， 两种引物通过碱基互补配对 与两条单链DNA结合
DNA模板
4种脱氧核苷酸
5’
当温度超过90℃时，
双链DNA解聚为单链
⑹PCR反应过程：
①变性
引物
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
5’ 3’
③延伸
②复性
耐高温的DNA聚合酶
3’ 5’
条件
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
3’
伸三步产生第二轮循 环的产物；
经过变性、复 性和延伸三步 产生第三轮的 产物；
第一步：目的基因的筛选与获取
上述过程可以 在PCR扩增仪 （PCR仪）中 自动完成。完 成以后，常采 用琼脂糖凝胶 电泳来鉴定
PCR的产物。
第一轮循环的产物作 为第二轮反应的模板， 经过变性、复性和延
第二轮循环的产物 第三轮循环的产物
第二轮循环的 产物作为第三 轮反应的模板，
⑹PCR反应过程：
72℃左右， 新DNA合成
3’
9 0℃以 上， D NA双 链 解 开 50℃左 右， 引物与DNA结 合
3’
5’
3’
第 一 次 循 环
5’
5’
5’
5’
5’
5’
第 二 次 循 环
高 温 变 性 、 低 温 复 性
3’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
5’
第 二 次 循 环
高 温 变 性 、 低 温 复 性
中 温 延 伸
3’
5’
第
三
次
循
环
中 温 延 伸
3 ’
5’
第 三 次 循 环
3’
5’
思考：在利用PCR获取和扩增目的基因时，至少几
轮循环才能从DNA分子中获得只含目的基因的片段？
至少3轮循环才会获得只含目的基因的片段
为何放入的是整个模板，却可以只获得目的基因
引物具有特异性
相关计算
如果循环n次，则形成 2n 个DNA分子片段。
则形成 2n+1 条脱氧核苷酸链。
第n次循环，消耗 2n 个引物
如果循环n次，则共需消耗 2n+1－2 个引物。
则共需消耗 2n－1 对引物。
如果循环n次，含引物的DNA分子片段 2n 。
含2种引物的DNA分子片段 2n－2 。
项目 体内DNA复制
PCR扩增技术
解旋方式 解旋酶催化
DNA在 高温作用 下变性解旋
场所 细胞内 （细胞核）
PCR扩增仪内
酶 解旋酶、 DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶
温度条件 细胞内温和条件
需控制温度，在 较高温度
下进行
结果 完整的DNA分子
DNA片段或目的基因
相同点 （1）模板：均需要DNA的两条单链作为 模板 ； （2）原料：均为4种 脱氧核苷酸 ； （3）酶：均需 DNA聚合 酶
体内DNA复制与PCR技术比较
①使用的两种引物的序列相同吗？
不相同，目的基因两端具有 不同的核苷酸序列
设计引物是否需要知道目
的基因的序列？
②设计引物的依据是：
已知目的基因两端的核
苷酸序列
关于引物
(1)第1组:引物Ⅰ和引物Ⅱ部分碱基发生互补配对而失效
第2组 :引物Ⅰ自身部分碱基发生互补配对而失效
(2)两种引物与模板链如何配对
引物与模板链3'端互补配对
设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物 (只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理
由。
由。
(3)两种引物的原则:
①引物自身及两种引物之间不能互补配对
②引物长度适宜
③引物GC含量要适宜，否则影响复性温度
设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物 (只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理
(4)延伸时需要加入2种引物，原因是：
DNA是反向平行的双链， DNA聚合酶只能从引物3'端
延伸，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物 (只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理
由。
依据 已知目的基因两端的核苷酸序列
②引物长度适宜
③引物GC含量要适宜，过高复性温度也要升高
.①引物自身及两种引物之间不能互补配对
设计引物
原则
笔记
一、实验原理
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的
解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 ②PCR扩增DNA片段利用了DNA半保留复制的原理；
复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也
存在DNA解开的两条单链的结合，因此一般 在PCR实验中引物的投入量远大于产物量
（但不能随意加大浓度）；
探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
③一次PCR一般要经历30次循环。
②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的
大小和构象等有 N。A分子的迁移速率与其大小呈负相关。 ④凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯 下被检测出来。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
①电泳： DNA分子具有可解离的基团，在
团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些
会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是
探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
EB即溴化乙锭）
（常用核酸染料为
④核酸染料
③1 倍胶浓载缩样的缓扩冲增液缓（冲内液含指（含示M +） 溴酚蓝）
⑤PCR反 0体μ o的l/配L的方引物Ⅱ
探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
二、材料用具
1.试剂 ①无菌水、琼脂糖
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）
模板DNA （用量为1pg-1μg）
20μmol/L的引物Ⅰ
PCR反应体系的配方
28-33μL
总体积
5-10μL
2.5μL
2.5μL
50μL
5μL
1μL
1-2U
H2O
2.用具
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
心管
量移液变器性 PC 书 微量离心 管中依次加入各组 待所 有 4 都,5加m入in后， 放入离心机里 盖严离/心管的盖 离心约10s 使反 子
管的 , 底 4℃（提, 0 应 最后一次参照 反应 下 4 参,1数m，in设 液的微量离心管 置好55℃仪, 0 环 放入 进行
离心
应液集中在离心
1.预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 2.可根据目的片段长度适当调整延伸时间。
探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
三、方法步骤
1.DNA片段的扩增
程 2℃,1min 反应。
循环程序 微 说明
延伸 分
预变性
速率5）5℃,30s
72℃,1min
R 复性
30次
/
电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压， 一般为1-5V/cm。
待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量 移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。 留一个加样孔加入指示分子大 小的标准参照物（Marker）。
配制琼脂 糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质 量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔 化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加 样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
2.DNA片段的电泳鉴定
1.接通电源时，红色为阳极、黑色为阴极， DNA样品由阴极（靠近加 样孔的一段）往阳极移动。
2.根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压， 一般为1～5V/cm。
探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的哪一极？
四、注意
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、
枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买， 缓冲液和酶应分装成小
份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰 块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时， 每吸取一种试剂后，移液
器上的枪头都必须更换。避免试剂的污染。
4.在进行操作时， 一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
1.成功扩增出DNA片段的判断依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带
（根据条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果）
2.进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？ 应该为一条条带
3.如图所示，该片段大小约为 bp
探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定
五、结果分析与评价
750
4.如果未出现条带，可能原因是什么？
模板DNA含有杂蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制剂； TaqDNA聚合酶失 活；引物出现质量问题；引物浓度不合适； Mg2+浓度过低；变性 温度过低；变性时间过短；目的序列改变；等等
5.如果出现不止一条条带，可能原因是什么？
模板DNA出现污染； TaqDNA聚合酶出现质量问题；引物特异性不 强（如与非目的序列有同源性）或引形成引物二聚体； Mg2+浓度 过高；复性时的温度过低； PCR循环次数过多；等等。(共14张PPT)
基因表达载 体的构建
目的基因的 筛选与获取
基因工程的基本操作流程
第二步
第一步
⑴启动子：
①本质：一段有特殊序列结构的DNA片段
②位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点
③功能： 是RNA聚合酶识别和结合的部位， 有了它才能驱动基因转录出mRNA
④特殊类型：诱导型启动子（诱导物存在时，可 以激活或抑制目的基因的表达）。
构建基因表达载体常用的启动子一般可以分为组成型启动子和 诱导型启动子。
组成型启动子：在生物体的所有组织中都有活性的启动子。
诱导型启动子：能被诱导表达的启动子。
目的基因 限制酶切
割位点
终止子
基因表
达载体
复制原点
标记基因
第二步：基因表达载体的构建（核心）
限制酶切 割位点
启动子
①作用： 便于重组DNA分子的筛选 目的基因插入位点不是随意的：
②常见类型： 抗生素抗性基因、 达白载基体因需要启动子与终止子的
终止子之间的部位，若目的基因插入
⑸复制原点：使质粒完成自主复制启动子部位，启动子将失去原功能。
⑵终止子：
①本质： 一段有特殊序列结构的DNA片段
②位置： 位于基因的下游
③功能： 使转录在所需要的地方停下来
⑶标记基因：
目的基因 限制酶切
割位点
终止子
基因表
达载体
复制原点
标记基因
第二步：基因表达载体的构建（核心）
⑷目的基因： 如Bt基因。 ，
调控 所以目的基因应插入启动子和
限制酶切 割位点
启动子
启动子 终止子 起始密码子
终止密码子
本质 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个 相邻的碱基
mRNA上三个 相邻的碱基
位置 基因的上游 基因的下游 mRNA首端
mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别 和结合的部位， 驱动基因转录 出mRNA 使转录在所 需要的地方 停下来 翻译的起始 信号（编码 氨基酸）
翻译的结束 信号（不编 码氨基酸）
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
重组DNA分子
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
连接酶
限制酶
第二步：基因表达载体的构建（核心）
限制酶切割位点
启动子 终止子
复制 原点
标记
基因
同种限制酶或 能产生相同末
端的限制酶
3.基因表达载体的构建过程
限制酶
质粒
同种限制酶或能 含有目的基
产生相同末端的 因的DNA片段 限制酶切割
第二步：基因表达载体的构建（核心）
基因表达载体≠载体： 基因表达载体与载体 相比增加了目的基因。
带有相同黏性末 端（或平末端）
的目的基因片段
带有黏性末 端（或平末 端） 的切口
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
载体(质粒）
1.切割载体和切割含有目的基因的DNA片段的限制酶应符合什么
条件？为什么？
应为同种限制酶或能产生相同末端的限制酶。
产生相同的黏性末端或平末端，以便通过DNA连接酶连接。
2.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连
接酶处理后，可能有几种产物（只考虑两两连接）？
三种：载体-载体、目的基因-目的基因、载体-目的基因
3.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连
接酶处理后， 一定会形成重组DNA分子吗？
不一定，载体和目的基因都可能出现自身环化或自身连接。
第二步：基因表达载体的构建（核心）
4.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理
后，形成的“载体-目的基因”产物一定符合要求吗？
不一定，目的基因可能反向连接到质粒上。
5.如何避免上述问题？
实际应用中往往选择两种不同的限制酶对目的基因和载体分 别切割（防止自身环化和反向连接），用标记基因对重组DNA进 行筛选。
6.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这
么做，效果会怎样？
这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。
第二步：基因表达载体的构建（核心）
4.基因表达载体构建时有关限制酶的选择
选择限制酶时要考虑目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上
的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的 种类。
思考：构建下图所示基因表达载体时限制酶如何选择？
第二步：基因表达载体的构建（核心）
(1)根据目的基因两端的限制酶切位点确定限制酶的种类
①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。
②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切
割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质 粒上也有这两种酶的酶切位点)。
第二步：基因表达载体的构建（核心）
4.基因表达载体构建时有关限制酶的选择
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶与切割目的基因的限制酶一般相同，以确保具有相同的黏性
末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶应不能切割质
粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，用于重组DNA的鉴定和 选择。如图乙中质粒不能使用限制酶Sma Ⅰ切割，因为会破坏标记基因。
第二步：基因表达载体的构建（核心）
4.基因表达载体构建时有关限制酶的选择
（1）基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取 ( )
（2）基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子
（ X ）
（3）标记基因不一定是抗生素抗性基因 ( √ )
（4）当诱导物存在时，诱导型启动子可以激活或抑制 目的基因的表达 ( )
判断常考语句，澄清易混易错
1 ．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，
错误的是 ( B )
A． 二者子链的延伸方向相同，均为5′端→ 3′端
B． 二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C ．体内DNA复制需要能量， PCR反应也需要能量
D． 二者遵循的碱基互补配对原则相同
选择
A ．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外
源DNA
B ．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C ．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免 自身环化和反向连接
D ．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基 中生长
2． 图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，
AmpR表示氨苄青霉素抗性基因， neo表示新霉素抗性基因。 下列叙述错误的是 ( D )(共15张PPT)
基因工程的基本操作程序
基因表达载 体的构建
目的基因的 检测与鉴定
目的基因的 筛选与获取
将目的基因导 入受体细胞
将目的基因导 入受体细胞
基因表达载 体的构建
目的基因的 筛选与获取
基因工程的基本操作流程
第三步
第二步
第一步
{
——显微注射法
——Ca2＋处理法
花粉管通道法
将目的基因导入 植物细胞
将目的基因导入 动物细胞
将目的基因导入 微生物细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
此处的“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义 相同，实质都是基因重组。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表
农杆菌转化法
基因枪法
达的过程。
一、转化：
二、方法
目的基因 ①用微量注射器将含目的基 因的DNA溶液直接注入子 房中。 ②在植物受粉后的一定时间 内，剪去柱头，将DNA溶 液滴加在花柱切面上，使目 的基因借助花粉管通道进入 胚囊。
目的基因
（一）将目的基因导入植物细胞——花粉管通道法
（1）花粉管通道法（我国科学家独创） 适用生物：开花植物
第三步：将目的基因导入受体细胞
基因工程
内含Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒
上的T-DNA转移到被侵染的细胞， 并且将其整
合到该细胞的染色体DNA上。
一种在土壤中生活的微生物， 能在自然条件下侵染
双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没 有侵染能力。
2.农杆菌特点：
第三步：将目的基因导入受体细胞
（一）将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法
1.农杆菌及 侵染的植物：
受体细胞
可转移的DNA
Ti质粒
T-DNA
（一）将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法
3.农杆菌转化的过程：
第三步：将目的基因导入受体细胞
转入 农杆菌 侵染
胞
物
细
植
体
达
载
表
Ti质粒
目的基因
插入 植物细
胞染色
构建
表达
新性状
DNA
该过程经过 两 次拼接、 两 次导入？
①第一次拼接
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
②第二次拼接
插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞
染色体的DNA上（非人工操作）
③第一次导入
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
④第二次导入
含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）
（一）将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法
3.农杆菌转化的方法：
根据受体植物不同，具体转化方法有所区别
⑴将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛 选转化细胞，并再生成植株；
⑵将花序浸没在含农杆菌的溶液中，培养植株并获得种子， 再进行筛选、鉴定。
随转化方法的突破， 用农杆菌侵染水稻 、玉米等单子叶植物
也取得成功。
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞：受精卵
受体细胞：体细胞
外植体
（一）将目的基因导入植物细胞——基因枪法
1.定义：基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，
将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。常用的金属颗粒有钨粉粒子和 金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4μm。
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.适用对象： 单子叶植物
基因枪法意图
受精卵
（二）将目的基因导入动物细胞
1.常用方法： 显微注射法
2.导入对象： 受精卵 ①体积大，易操作②营养物质丰富③全能性高
3.转化方法 将含有目的基因的表达载体提纯
显微注射
第三步：将目的基因导入受体细胞
获得具有新性状的生物
胚胎早期培养
胚胎移植
显微注射法示意图 普通鼠与生长速度加快的转基因鼠
将目的基因导入动物细胞时，常使用显微注射法。1982年，科学家将含有生长
激素基因的重组DNA片段，通过显微操作仪注射到受精卵内还未融合的雄性细胞核中， 体外培养一段时间后再将胚胎移植到雌性小鼠子宫内，获得了成功转入目的基因的 体型大、生长快的"超级小鼠"。
第三步：将目的基因导入受体细胞
（二）将目的基因导入动物细胞
（三）将目的基因导入微生物细胞
1.受体细胞： 常用原核生物作为受体细胞
2.常用菌： 大肠杆菌
3.优点： 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少
4.转化方法 Ca2＋处理法
第三步：将目的基因导入受体细胞
增加细胞壁通透性
Ca2+处理大肠
杆菌
（细胞处于一种能吸收周围 环境中DNA分子的生理状态）
将重组表达载体 DNA分子溶于缓 冲液中与感受态
感受态 细胞
感受态细胞 吸收DNA
在一定温
度下促进
细胞混合
当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：
1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？
真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内
含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA
序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白。
2.以上情况如何解决？
使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。
3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？
原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋 白质进行正确的加工。
4.以上情况如何解决？
人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。
第三步：将目的基因导入受体细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
实例:利用转基因大肠杆菌生产
V
①转基因植物用 体细胞或受精卵 ；
②转基因动物用 受精卵 (一般不能用体细胞)；
原因是：受精卵有发育的全。能性
③微生物作为受体细胞的优点
是单细胞，繁殖快；遗传物质相对较少，易于培养操作。
④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等则受体细胞为 真核细胞，
原因是 分泌蛋白等需内质网、高尔基体等的加工；
⑤一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，
原因是 无核，无器，不能合成蛋白质 。
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞的选择(共13张PPT)
基因工程的基本操作程序
基因表达载 体的构建
目的基因的 检测与鉴定
目的基因的 筛选与获取
将目的基因导 入受体细胞
目的基因的 检测与鉴定
将目的基因导 入受体细胞
基因表达载 体的构建
目的基因的 筛选与获取
基因工程的基本操作流程
第四步
第三步
第二步
第一步
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
第四步：目的基因的检测与鉴定
基因工程
3
r①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
通过抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等，以确定转基因 生物是否具有抗性以及抗性的程度。
第四步：目的基因的检测与鉴定
是检查转基因生物是否培育成功的一步
分子水平
个体水平
一、检测
二、鉴定
⑵过程：
将转基因生物的基因组DNA提取出来；在含目的基因的 DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针；使探 针与转基因生物的基因组DNA杂交，若显示出杂交带，表明 目的基因已插入染色体DNA中。
一、检测（都在体外进行） ——分子水平
1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
第四步：目的基因的检测与鉴定
这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键
探针：用放射性同位素或荧光分子等标记的含有目的基因的单链DNA片段。
⑶依据：观察是否出现杂交带
（DNA分子杂交技术）
PCR等技术
⑴技术：
第四步：目的基因的检测与鉴定
①.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
DNA半保留复制
碱基互补配对
方法： PCR检测
原理：
第四步：目的基因的检测与鉴定
①.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法： DNA分子杂交技术
⑴技术：
⑵过程：
从转基因生物中提取的是mRNA，同样用标记的目的基
因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的 基因转录出了mRNA。
第四步：目的基因的检测与鉴定
一、检测（都在体外进行） ——分子水平
2.检测目的基因是否转录出mRNA
这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步
⑶依据：观察是否出现杂交带
（分子杂交技术）
PCR等技术
第四步：目的基因的检测与鉴定
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
1.RT-PCR（逆转录PCR）
2.RNA分子杂交
分子杂交
目的基因表达的 蛋白质的抗体
目的基因表 达的蛋白质
抗原———-—抗体杂交
⑵过程：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—
抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。
⑴技术：
⑶依据：观察是否出现杂交带
第四步：目的基因的检测与鉴定
一、检测（都在体外进行） ——分子水平
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗除草剂植物 喷洒除草剂
植物是否正常生长
获取目的基因产 提取细胞产物与天然产
细胞产物功能活性
物的转基因生物 品进行功能活性比较
是否正常
转基因生物 检测方法
观察指标
抗虫植物 害虫吞食
害虫存活情况
用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目
的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入 了抗虫基因并得到表达。
二、鉴定——个体水平
个体水平的鉴定实际上是检测目的基因是否表达出所控制的 性状，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。
第四步：目的基因的检测与鉴定
实例：鉴定转基因抗虫棉是否培育成功
没有抗虫基 虫没有死
因的棉植株 接种 没有表达
的棉植株 虫被杀死
目的基因表达
第四步：目的基因的检测与鉴定
有抗虫基因 棉铃虫
二.个体水平的检测
非转基因
转Bt基因
1.目的基因的筛选和获取 -前提
u 利用PCR获取和扩增
u 化学方法人工合成
2.构建基因表达载体 -核心
u 目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞 -关键
u 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)
感受态细胞转化法(微生物);
载体进入受体细胞稳定表达，才能
实现一种生物的基因在另一种生物 、中的转化。
4.目的基因的检测与鉴定 -保证
u 分子检测：是否插入、转录、翻译
有了目的基因，我们才能赋予一种 生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并可进行遗传、表达和发挥作用。
才能确定目的基因是否真正在受体 细胞中稳定遗传和正确表达。
u 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
小结
