3.2基因工程的基本操作程序的学案

3.2基因工程的基本操作程序的学案
【学习目标】
1.简述PCR的原理、条件及过程。
2.简述基因表达载体的组成及构建过程。
3.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。
4.阐明目的基因的检测与鉴定的方法。
【学习重难点】
教学重点
基因工程基本操作程序的四个步骤。
2、教学难点
（1）从基因文库中获取目的基因。
（2）利用PCR技术扩增目的基因。
【预习新知】
第一步：目的基因的筛选与获取
1．目的基因
(1)概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。
2．筛选合适的目的基因
(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
(3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
(2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
(3)过程：
①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链。
②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链。
④重复循环多次。
(4)结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
第二步：基因表达载体的构建
1.操作目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够
作用。
2.基因表达载体的组成及其作用
一个基因表达载体的组成，除了 、 外，还必须有 、 等(如图所示)。
3.基因表达载体的构建过程
(1)用一定的 切割载体，使其出现一个有黏性末端(或平末端)的切口。
(2)用 种或 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)加入适量 ，使切下的目的基因片段拼接到载体的切口处。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.转化的含义:_____ 目的基因____进入受体细胞内,并且在受体细胞内__维持稳定_______和__表达___的过程。
2.转化的方法:
①导入植物细胞:花粉管通道法和____农杆菌转化法_________。
②导入动物细胞:
③导入微生物细胞:用__Ca2+__处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中
DNA分子的生理状态。
第四步：目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
(1)导入水平
①技术手段： 等技术。
②检测目的：检测受体细胞的 上是否插入了 。
(2)转录水平
①技术手段： 等技术。
②检测目的：检测目的基因是否转录出了 。
(3)翻译水平
①技术手段： 技术。
②检测目的：检测目的基因是否 。
2.个体水平的鉴定
(1)鉴定方法：例如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
(2)鉴定目的：确定目的基因是否赋予了转基因生物特定的 及程度。
【易错提示】
1．基因工程操作过程中碱基互补配对现象
基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步筛选与获取目的基因，用人工合成、PCR获取或基因文库获取，三种常用方法都涉及碱基互补配对；第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体，第四步利用分子杂交的方法检测(DNA、mRNA)，也都存在碱基互补配对现象。
2．关于不同分子水平检测的原理、场所、探针的异同
(1)原理：进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，都遵循碱基互补配对原则，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物的细胞内的mRNA；进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。
(2)场所：不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
(3)探针：在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。
【深化探究】
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已经育有转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量约40万吨，增收节支社会经济效应约450亿元。Bt基因进入受体细胞后，是否稳定存在和表达，只有通过检测与鉴定才能知道，这也是检查转基因抗虫棉是否培育成功的一步。请回答下列问题。
1.该基因工程中的目的基因和载体分别是什么
提示：从题图中可以看出:目的基因是Bt毒蛋白基因,载体是Ti质粒
2.一般情况下,为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体
提示：用同一种限制酶处理目的基因和载体,可以获得相同的黏性末端,便于构建基因表达载体。
3.该实例中,采用何种方法导入目的基因
提示：采用的方法是农杆菌转化法
4.目的基因怎样整合到染色体的DNA上
提示：由于Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上,而目的基因插入T-DNA上,所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
5.该实例中,检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种
提示：抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫
6.转基因抗虫棉抗虫的原理是什么 (生命观念:结构与功能观)
提示: Bt毒蛋白基因是从苏云金芽孢杆菌中分离出来的抗虫基因。当害虫食用含有转基因的植物时,Bt毒蛋白基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道,在消化酶的作用下,蛋白质能够降解成相对分子质量比较小的、有毒的多肽。多肽结合在肠上皮细胞的特异性受体上,会导致细胞膜穿孔,细胞肿胀裂解,最后造成害虫死亡。
【巩固训练】
（一）巩固训练
1.新型冠状病毒S蛋白的受体结构域（RBD）是介导病毒进入宿主细胞的关键结构。我国科研人员将GP67基因（指导合成一段信号肽，该信号肽引导新合成的蛋白分泌到细胞外）与RBD基因融合，构建融合基因，大量生产RBD蛋白，用于制备疫苗，流程如图所示。下列相关叙述正确的是( )
A.过程①的理论基础是生物的密码子是共用的
B.过程②中融合基因被直接注射到受精卵内
C.过程③需用PCR技术检测RBD是否成功合成
D.过程④分离获得RBD无需裂解细胞
2.为提高大豆对磷元素的吸收能力，研究人员利用农杆菌转化法将水稻的耐低磷基因OsPTF转移到大豆植株中，如图为重组Ti质粒上T-DNA的序列结构示意图。下列相关叙述不正确的是( )
A.以水稻RNA为模板通过反转录及PCR扩增可获得大量OsPTF基因
B.RNA聚合酶与启动子1识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录
C.可用含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织
D.用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切重组Ti质粒后，经电泳分离至少得到三条带
3.野生油菜（P1）具有低芥酸、抗病虫害等特性，为了改良甘蓝型油菜（P2），研究人员将两种植物的体细胞进行融合获得了杂种植物F1，然后加入一对引物进行PCR鉴定，结果如图所示。下列叙述不正确的是( )
A.用PEG可促进两个亲本的原生质体融合
B.泳道M从下到上表示长短不同的DNA片段
C.本实验中引物能与DNA上多个不同位点结合
D.F1-2最可能是有低芥酸、抗病虫害等特性的杂种油菜
4.下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是( )
A.我国科学家将Bt基因导入棉花细胞采用了农杆菌转化法
B.显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C.大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：Ca2+处理细胞
D.农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
5.利用外源基因在受体细胞中表达,可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是( )
A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
6.猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响其生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。该技术主要由Cas9蛋白与向导RNA的复合物共同完成（如图1所示），其中向导RNA可识别LamR基因中的特定序列。
(1)图1中向导RNA与LamR基因按照_____________________原则特异性结合，Cas9蛋白切割LamR基因作用的化学键为_________________________。DNA双链断裂后，再通过随机增添、删除或替换部分碱基对，从而实现对LamR基因改造。实验发现，CRISRP/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，向导RNA的序列越短脱靶率越高。试分析脱靶最可能的原因_________________________。
(2)将改造好的LamR基因进行PCR扩增，由于LamR基因两端没有限制酶识别序列，为了保证LamR基因能正确插入质粒（如图2）中，需要在两种引物的5’端分别添加__________限制酶的识别序列。至少扩增_________次即可出现两端带上限制酶识别序列的LamR基因。
(3)构建好基因表达载体后，可用______________方法将重组质粒导入到猪受精卵中。请写出从个体水平检测抗猪瘟病毒猪培育成功的方法________________。
参考答案
1.答案：D
解析：过程①是将一个基因与另一个基因拼接在一起的过程，该过程的理论基础是二者具有相同的空间结构和基本组成单位，A错误；图示是利用动物细胞培养技术获得RBD的技术流程，过程②中可将融合基因导入可在体外增殖的任意一种昆虫细胞，而不是一定注射到受精卵内，B错误；由题意可知，RBD合成后会被分泌到细胞外，过程③中检测RBD是否成功合成应进行抗原—抗体杂交，过程④分离获得RBD无需裂解细胞，从培养液中分离既可，C错误、D正确。
2.答案：BD
解析：以水稻RNA为模板通过反转录可以合成cDNA，然后再以cDNA为模板利用PCR扩增可获得大量OsPTF基因，A正确；据图分析可知，抗除草剂基因位于启动子2的后面，因此RNA聚合酶与启动子2识别并结合后，启动抗除草剂基因的转录，B错误；由于图中T-DNA的序列中含有目的基因和抗除草剂基因，故可用含除草剂的选择培养基筛选含有目的基因的大豆愈伤组织，C正确；质粒为环状DNA，因此用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切重组Ti质粒后，至少会得到OsPTF基因片段及剩余部分的片段，D错误。
3.答案：D
解析：用化学试剂PEG可促进两个亲本的原生质体融合，A项正确；泳道M从下到上表示长短不同的DNA片段，B项正确；由电泳结果可知，本实验中引物能与DNA上多个不同位点结合，C项正确；通过图片中电泳结果看出，F1-1具有P1、P2的部分遗传信息，其最可能是有低芥酸、抗病虫害等特性的杂种油菜，D项错误。
4.答案：A
解析：我国科学家将Bt基因导入棉花细胞采用了花粉管通道法，A错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最有效的方法，B正确；Ca2+处理法能使大肠杆菌细胞的生理状态发生改变，使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C正确；在自然条件下，农杆菌侵染双子叶植物和裸子植物，因此农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法，但大多数单子叶植物不适用，D正确。
5.答案：D
解析：棉花二倍体细胞中检测到细菌抗虫基因,说明目的基因已经成功导入受体细胞,但不能说明目的基因在受体细胞中已经完成表达,A错误;大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA,说明目的基因已经成功导入受体细胞并转录,但不能说明目的基因完成了表达过程,B错误;山羊乳腺细胞中检测到人生长素DNA序列,说明目的基因已经成功导入受体细胞,但不能说明目的基因在受体细胞中已经完成表达,C错误;酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白,说明目的基因已经在受体细胞中完成了表达,D正确。
6.答案：(1)碱基互补配对；磷酸二酯键；非基因编辑对象也可能含有与向导RNA配对的碱基序列，造成向导RNA选错对象与之错误结合而脱靶
(2)EcoRI、PstI；3/三
(3)显微注射；接种猪瘟病毒，不患病则培育成功