3.1重组DNA技术的基本工具的学案

3.1重组DNA技术的基本工具的学案
【学习目标】
1.说出DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
2.模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。
3.关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生基因工程。
【学习重难点】
教学重点
1.重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。
2.DNA的粗提取与鉴定。
教学难点
1.基因工程载体需要具备的条件。
2.DNA的粗提取与鉴定。
【预习新知】
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
(1)来源：主要来自原核生物。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
(3)结果：产生黏性末端或平末端。
(4)应用：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。
EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有专一性。
DNA连接酶—“分子缝合针”
1.功能:将　双链DNA片段 “缝合”起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
2.种类
项目 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用 特点 只能将具有互补　黏性末端 的DNA片段连接起来,不能连接具有　平末端 的DNA片段 既可以“缝合”双链DNA片段互补的 黏性末端 ,又可以“缝合”双链DNA片段的　平末端 ,但连接平末端的效率相对较低
基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
载体的作用：
作为 ，将目的基因导入受体细胞中
在受体细胞内对目的基因进行大量
质粒的化学本质——
作为载体必须具备的条件：
质粒DNA分子上有 限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中
携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行 ，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步
质粒上常有 ，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选
常用载体的种类及用途
种类 用途
质粒 将外源基因导入 等受体细胞
λ噬菌体的衍生物
植物病毒 将外源基因导入
动物病毒 将外源基因导入
【易错提示】
细胞膜上的载体与基因工程中的载体的两个“不同”
(1)化学本质不同
①细胞膜上的载体化学成分是蛋白质。
②基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌体、动植物病毒等。
(2)功能不同
①细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞。
②基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
【深化探究】
1．(生命观念)图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。请据图回答：
图1
图2
请说出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点；EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶作用的结果分别是什么？
提示：EcoR Ⅰ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。EcoR Ⅰ限制酶将DNA切割成黏性末端，Sma Ⅰ限制酶将DNA切割成平末端。
2．(科学思维)质粒作为目的基因的载体，其本质是什么？所有质粒都是载体吗？为什么？
提示：DNA。不是。作为载体必须具备一定的条件，条件不具备，则不能作为载体。
3．(科学思维)载体在基因工程中的作用是什么？
提示：作为运输工具，将外源(目的)基因导入受体细胞，携带外源(目的)基因在受体细胞内大量复制。
4．(科学思维)分析质粒载体结构模式图，回答下列问题：
大肠杆菌及质粒结构模式图
(1)质粒上氨苄青霉素抗性基因的作用是什么？
(2)为使外源基因插入质粒中，质粒需具备的条件是什么？
(1)提示：作为标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
(2)提示：有一个至多个限制性内切核酸酶的切割位点。
【巩固训练】
1.如图所示是5种限制酶所识别的DNA序列和酶切位点（↓表示酶切位点，切出的断面为黏性末端或平末端）。
限制酶1：—↓GATC—
限制酶2：—CATG↓—
限制酶3：—G↓GATCC—
限制酶4：—CCC↓GGG—
限制酶5：—AG↓CT—
下列有关说法错误的是( )
A.不同的限制酶可以切出相同的黏性末端
B.限制酶1可以识别并切割限制酶3所识别的DNA序列
C.限制酶3和4识别的序列都是由6个脱氧核苷酸组成的
D.DNA连接酶可连接由限制酶1和3切出的DNA片段，也可连接由限制酶1和2切出的DNA片段
2.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列有关叙述错误的是( )
A.以上DNA片段是由5种限制酶切割后产生的
B.若要把相应片段连接起来，应选用DNA连接酶
C.上述能进行连接的两个黏性片段连接后形成的DNA分子是
D.①②④属于黏性末端，③⑤属于平末端
3.下列关于几种酶作用的叙述，不正确的是( )
A. E·coli DNA连接酶既可以连接平末端，又可以连接黏性末端
B. RNA聚合酶能与基因的特定区段结合，催化遗传信息的转录
C. DNA连接酶能将两个DNA片段连接为一个DNA分子
D. 限制酶不是一种酶，而是一类酶
4.作为基因工程的运输工具——载体,必须具备的条件及理由对应错误的是( )
A.能够在宿主细胞中稳定保存并大量复制,以便提供大量的目的基因
B.具有多个限制酶切割位点,以便于目的基因的插入
C.具有某些标记基因,以便目的基因能够准确定位与其结合
D.对宿主细胞无伤害,亦不影响宿主细胞的正常生命活动
5.电泳的原理：DNA被染色后带正电荷，在电场作用下，在琼脂凝胶中从正极向负极移动，DNA相对分子质量越小，移动速度越快，一段时间后，相对分子质量不同的DNA分子就相互分离开。用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开，两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是( )
图1 图2
A.图1中限制酶A、B识别的核苷酸序列不相同
B.图1中X代表的碱基对数为4500
C.推测图1中Y是限制酶B的酶切位点
D.推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物
6.下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是( )
A.用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B.限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大
C.—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性内切核酸酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接
D.只有用相同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
7.下图1表示限制酶SpeⅠ、XbaⅠ的识别序列和切割位点，图2表示基因P（960bp）、基因Q（840bp）的限制酶SpeⅠ或XbaⅠ的酶切图谱和融合基因，图3表示几种基因经限制酶SpeⅠ或XbaⅠ处理后进行电泳（电泳条带表示特定长度的DNA片段）得到的带谱图，下列相关分析错误的是( )
A.基因P经限制酶SpeⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅰ相同
B.基因Q经限制酶XbaⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅱ相同
C.融合基因经限制酶SpeⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅲ相同
D.融合基因经限制酶XbaⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅳ相同
8.用X酶切割DNA分子后，得到黏性末端①，用Y酶切割DNA分子后，得到黏性末端②，如下图所示，以下说法不正确的是( )
A.X与Y通常是不同的限制酶
B.限制酶与DNA水解酶破坏的化学键相同
C.限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
D.具有①②的两个DNA片段可连接成重组分子，重组后还可以被X或Y切割
9.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
参考答案
1.答案：D
解析：分析可知，限制酶1和3切出的黏性末端相同，即不同的限制酶可以切出相同的黏性末端，且限制酶1可以识别并切割限制酶3所识别的DNA序列，A、B正确；分析可知，限制酶3和4识别的序列都是由6个脱氧核苷酸组成的，C正确；DNA经不同限制酶切割后，形成的黏性末端相同时，才可以通过DNA连接酶连接，由此可知DNA连接酶可连接由限制酶1和3切出的DNA片段，不可连接由限制酶1和2切出的DNA片段，D错误。
2.答案：A
解析：图中①④是由同一种限制酶切割形成的，因此以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的，A错误；DNA连接酶可将具有相同末端的DNA片段连接起来，B正确；图中①④具有相同的黏性末端，可被DNA连接酶连接形成，C正确；由图可知，①②④属于黏性末端，③⑤属于平末端，D正确。
3.答案：A
解析：A、E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端,T4DNA连接酶既可以连接平末端,又可以连接黏性末端,A错误;B、RNA聚合酶能与基因的特定区段(启动子)结合,催化遗传信息的转录,B正确;C、DNA连接酶能将两个DNA片段之间的磷酸二酯键连接起来,形成一个DNA分子,C正确;D、限制酶不是一种酶,而是一类酶,这类酶能特异性的识别DNA分子并在特定位点进行切割,D正确。故选:A。
4.答案：C
解析：A、作为运载体必须具备的条件之一是能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便提供大量的目的基因,A正确;B、作为运载体必须具备的条件之一是具有多个限制酶切点,以便于目的基因的插入,B正确;C、作为运载体必须具备的条件之一是具有某些标记基因,以便于重组后进行重组DNA分子的筛选,C错误;D、携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后,停留在细胞中进行自我复制,或整合到染色体DNA上,随着染色体DNA进行同步复制,同时运载体对宿主细胞无伤害,以使目的基因在宿主细胞中复制并稳定保存,D正确。故选C。
5.答案：C
解析：A、酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，A正确；BC、从图2的A+B酶一组结果可知，限制酶A和B切完后总共有4个片段，长度分别为500、1500、3500、4500◇而图1表示酶A和B切割时只会得到3个片段，长度应该是3500、X、2000，所以可推测Y是限制酶A或限制酶B的酶切位点，X代表的碱基对数为4500,B正确，C错误；D、根据以上结论，若图1中有两个限制酶A的酶切位点，切割完后得到三个长度的片段：3500、(4500+1500)、500,正好与图2的①结果相符，故推测图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物，D正确。故选C。
6.答案：B
解析：用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，又因DNA为双链结构，因此要断裂4个磷酸二酯键，即被水解的磷酸二酯键有4个，A错误；限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，B正确；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制性核酸内切酶切出的黏性末端不同，分别为—CATG和—CTAG，因此不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，则也能形成重组质粒，D错误。
7.答案：C
解析：根据图2所示，基因P上有限制酶SPeⅠ的一个酶切位点，基因P的总长度960bp，所以经酶切后可以得到两个小于960的片段，符合图3中的Ⅰ，A正确。根据图2所示，基因0上有限制酶XbaⅠ的一个酶切位点，基因P的总长度为840bP，所以经酶切后可以得到两个小于840的片段，符合图3中的ⅡB正确。融合基因中没有限制酶SPeⅠ和限制酶XbaⅠ的酶切位点，所以用这两种端处理都不会断开，因此处理之后只有一个片段，符合图3中的Ⅳ,C错误，D正确。
8.答案：D
解析：A、由图可知，X与Y识别的核苷酸序列不同，因此X与Y是不同的限制酶，A正确； B、限制酶与DNA水解酶破坏的化学键相同，都是磷酸二酯键，B正确；C、限制性核酸内切酶将一个DNA分子片段切成两个片段，即断裂两个磷酸二酯键，因此需消耗两个水分子，C正确；D、具有①②的两个DNA片段可连接成重组分子，核苷酸序列发生了改变。先前能识别的核苷酸序列发生了改变，所以重组后不可以被X或Y切割，D错误。故选D。
9.答案：D
解析：A、天然的质粒不能直接作为载体,基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,A错误;
B、作为基因工程的运载体,必须具备一定的条件,而自然界中的质粒不一定具备相应的条件,因此不一定都可以作为基因工程中的运载体,B错误;
C、质粒是一种独立于细菌拟核外的环状DNA分子,C错误;
D、作为载体的质粒DNA分子上应有标记基因,便于对重组DNA进行鉴定和选择,D正确。
故选D。