生物人教版（2019）选择性必修3第3章基因工程章末复习（共62张ppt）
文档属性
| 名称 | 生物人教版（2019）选择性必修3第3章基因工程章末复习（共62张ppt） |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 6.7MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-04-03 14:19:03 | ||
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文档简介
(共62张PPT)
单元复习
第3章 基因工程
内容网络
课标要求
生命观念:
1. 探究DNA的物理与化学性质，进行DNA分子的提取与鉴定。
2. 结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。
3. 针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
4. 基于基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业应用的实例，说明基因工程给社会带来的巨大进步。
5. 尝试通过蛋白质工程技术，根据人类需要的蛋白质结构，设计改造某一蛋白质的设计流程。
1. 运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。
2. 运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。
3. 说明基因的碱基排列顺序—蛋白质的结构—蛋白质功能的关系。
1. 探究DNA的物理与化学性质，进行DNA分子的提取与鉴定。
2.联系当地生产、生活中的具体实例，思考用基因工程的方法解决实际问题,基于基因工程在各方面发展的前景，理性看待基因工程的安全性。
3. 尝试运用逆向思维分析和解决问题。
科学思维、科学探究:
社会责任:
考点
CONTENTS
01 DNA的粗提取及鉴定
02 DNA重组技术
03 基因工程的基本操作程序
04 基因工程的应用
05 蛋白质工程的原理和应用
PART
01
DNA的粗提取及鉴定
考点一：DNA的粗提取及鉴定
原理一
原理二
原理三
思路 ：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
一、实验原理：
二、实验材料及用具：
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
1.选材：
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
2.试剂：
试剂
研磨液
体积分数为95%的酒精
二苯胺
2mol/L 的NaCl溶液
蒸馏水
溶解并提取DNA
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
考点一：DNA的粗提取及鉴定
三、实验步骤：
1.破碎细胞——
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ， 研磨。
洋葱
研磨液
充分
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。
2.去除杂质——
在漏斗中垫上 过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
纱布
上清液
上清液
不可以用滤纸代替纱布。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
3.DNA的粗提取——
在上清液中加入体积相等的 溶液，静置2~3min，溶液中出现的
就是粗提取的DNA 。
预冷的酒精
白色丝状物
酒精作用：使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
预冷的酒精的优点
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
考点一：DNA的粗提取及鉴定
3.DNA的粗提取——
用玻璃棒沿 搅拌，卷起 ，并用滤纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心，取 晾干。
一个方向
沉淀物
丝状物
为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？
避免破坏DNA
4.DNA的鉴定——
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
二苯胺
2mol/L的NaCl
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
考点一：DNA的粗提取及鉴定
例1．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
D
考点一：DNA的粗提取及鉴定
6．“DNA粗提取与鉴定”实验需要对材料进行选择、处理。为了提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，下列对实验材料的选择和处理，正确的是（ ）
A．以猪成熟红细胞为实验材料时，可在滤液中加入适量的木瓜蛋白酶
B．以菜花为实验材料时，在研磨过程中可加入适量的纤维素酶
C．以植物叶片为实验材料时，一般使用体积分数为50%的预冷酒精提取DNA
D．以香蕉为实验材料时，将研磨液在4℃的冰箱中放置几分钟后，取沉淀物进行离心
B
PART
02
DNA重组技术
考点二：重组DNA技术（限制性内切核酸酶——“分子手术刀”）
主要是原核生物
来源
种类
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶
特点
（1）识别双链DNA分子特定核苷酸序列
（2）断开磷酸二酯键
识别序列长度
一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
专一性
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
结果
形成黏性末端或平末端
考点二：重组DNA技术（限制性内切核酸酶——“分子手术刀”）
限制酶的命名
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
限制酶的选择技巧
图甲 图乙
根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ；
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)
根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端；
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制
考点二：重组DNA技术（DNA连接酶——“分子缝合针”）
种类
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用 差别 只连接____________ 缝合___________和____________
E.coli
DNA连接酶
T4
DNA连接酶
黏性末端
黏性末端
平末端
（效率较低）
都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
考点二：重组DNA技术（限制性内切核酸酶——“分子手术刀”）
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键
考点二：重组DNA技术（限制性内切核酸酶——“分子手术刀”）
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
考点二：重组DNA技术（基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”）
载体的 作用
载体 的必 要条件
载体 的种
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
②具一个或多个限制酶切点，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。
③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。
④必须是安全的 ，对受体细胞无害。
①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
①细菌的质粒：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
考点二：重组DNA技术（基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”）
01
在基因工程中真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的
简言之一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子
经过人工改造
特殊的标记基因 复制原点 启动子 终止子 目的基因插入位点
质粒的组成要素
质粒
02
质粒
考点二：重组DNA技术
例3.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ）
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b
A
考点二：重组DNA技术
例4.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
C
考点二：重组DNA技术
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源 ：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
PART
03
基因工程的基本操作程序
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
（一）目的基因：
主要指的是编码蛋白质的基因
概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
实例：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
（二）筛选合适目的基因：
筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
DNA半保留复制
原理
体外
操作环境
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
目的
可在短时间内大量扩增目的基因
优点
聚合酶链式反应
全称
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR
参与的组分 在PCR中的作用
前提条件
高温
模板DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
一定的缓冲溶液(Mg2＋)
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
主要是DNA单链或RNA,使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
已知基因的核苷酸序列
提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活
(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
(2)引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能）
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
5.PCR的结果
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
6.产物进行鉴定
PCR过程可以在 中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物
琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增仪
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
PCR技术与DNA复制过程比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
例5.下列有关PCR技术的叙述,错误的是 ( )
A.每一次循环后目的基因的数量可以增加一倍
B.PCR反应过程中需要3个不同的温度范围
C.PCR反应过程中加入的酶的显著特性是耐高温
D.模板DNA和引物能在每一次扩增中重复使用
D
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
例6.在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针,可应用PCR技术进行扩增,应选择的引物种类是( )
A.引物1与引物2 B.引物3与引物4
C.引物2与引物3 D.引物1与引物4
C
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
例7．如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，有关说法不正确的是
（ ）
A．a→b过程中一般用4种脱氧核苷酸为原料，并加入两种引物
B．b→c为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是受精卵
C．a→b过程利用了DNA半保留复制的原理，需要使用RNA聚合酶
D．b→d为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法
C
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
考点三：基因工程的基本操作技术（②基因表达载体的构建）
（一）目的：
①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代;
（二）组成：
质粒
①启动子
基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA
②终止子：
限制酶切割位点
基因的尾端，能终止mRNA的转录
③标记基因
作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
④复制原点
⑤目的基因
②使目的基因能够表达和发挥作用。
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
考点三：基因工程的基本操作技术（②基因表达载体的构建）
首先，用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；
01
（三）构建过程：
质粒
限制酶
限制酶切割位点
限制酶
限制酶切割位点
获取目的基因
目的基因
然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
02
DNA
连接酶
重组
DNA分子
利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。
03
考点三：基因工程的基本操作技术（②基因表达载体的构建）
单酶切
用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
a、b、c、d四个黏性末端相同
缺点一：
在DNA连接酶的作用下，质粒被重新环化。
DNA连接酶
连接
DNA连接酶
连接
在DNA连接酶的作用下，目的基因被环化。
缺点二：
反向连接
重组DNA
a
d
c
a
缺点三：
在DNA连接酶的作用下，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。
双酶切
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段。
限制酶a切割
a
b
DNA连接酶
连接
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
a
b
考点三：基因工程的基本操作技术（②基因表达载体的构建）
A.NdeⅠ和BamHⅠ
B.NdeⅠ和XbaⅠ
C.XbaⅠ和BamHⅠ
D.EcoRⅠ和KpnⅠ
例8.如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列，为使该基因与该质粒构建重组质粒，切割目的基因和质粒时应该选择哪两种酶( )
A
考点三：基因工程的基本操作技术（②基因表达载体的构建）
例9.如图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点，下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述，错误的是（ ）
A.若通过PCR技术提取该目的基因应
该选用引物甲和引物丙
B.图1中的质粒用BclⅠ切割后，含有
2个游离的磷酸基团
C.构建基因表达载体时为了防止目的
基因和质粒的自身环化，可以选用BamHⅠ和HindⅢ剪切
D.在导入目的基因的受体细胞中，四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因不能同时表达
C
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
适用生物：开花植物
（2）农杆菌转化法
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到该细胞染色体的DNA上。
②原理：
1.将目的基因导入植物细胞
考点三：基因工程的基本操作技术（③将目的基因导入受体细胞）
2.将目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
①体积大，易操作。②易表现出全能性。
（3) 过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
考点三：基因工程的基本操作技术（③将目的基因导入受体细胞）
3.将目的基因导入微生物细胞
Ca2+处理法
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
Ca2+处理目的
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
受体细胞
（1）原核细胞（常选择大肠杆菌）
（2）优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
考点三：基因工程的基本操作技术（③将目的基因导入受体细胞）
考点三：基因工程的基本操作技术（③将目的基因导入受体细胞）
种类项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
考点三：基因工程的基本操作技术（③将目的基因导入受体细胞）
A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ 是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
例10.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是( )
B
考点三：基因工程的基本操作技术（④目的基因的检测与鉴定）
目的：
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
——“抗原—抗体杂交技术”
2.个体生物学水平鉴定
1.分子水平检测
抗性检测：
功能活性比较：
PCR技术或分
子杂交技术
抗虫、抗病接种实验；
基因工程产品与天然产品的功能活性比较
——检测是否具有抗性以及抗性强度等
如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠
考点三：基因工程的基本操作技术（④目的基因的检测与鉴定）
例11.人血白蛋白在临床上被广泛应用。我国科学家通过生物工程技术在水稻胚乳中提取到人血白蛋白，其流程如下图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．PCR扩增时需要DNA模板、引物、耐高温的RNA聚合酶等条件
B．过程①需用农杆菌转化法将人血白蛋白基因直接导入水稻胚乳细胞中
C．过程①需将目的基因与胚乳中特异性表达基因的启动子等调控元件重组
D．过程②改变生长素和细胞分裂素的浓度及比例不影响细胞的脱分化过程
C
考点三：基因工程的基本操作技术（④目的基因的检测与鉴定）
例12.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组
B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶
C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞
D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜
C
考点三：基因工程的基本操作技术（⑤ DNA片段的扩增及电泳鉴定）
一、实验原理
（一）DNA体外扩增的原理：
①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
变性
90 C
延伸
72 C
退火
50 C
电泳鉴定原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
（二）DNA片段电泳鉴定原理：
考点三：基因工程的基本操作技术（⑤ DNA片段的扩增及电泳鉴定）
二、实验步骤
（一）DNA片段扩增的具体过程：
移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
扩增：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
（二）PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程：
制备凝胶
电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
进行电泳
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察鉴定
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
①融化：
②倒模:
③凝固:
①加液：
②加样：
③电泳：
考点三：基因工程的基本操作技术（⑤ DNA片段的扩增及电泳鉴定）
例13.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
考点三：基因工程的基本操作技术（⑤ DNA片段的扩增及电泳鉴定）
A.该 DNA 最可能是线状 DNA 分子
B.两种限制酶在该 DNA 上各有两个酶切位点
C.限制酶 R1与 R2的切点最短相距约 200 bp
D.限制酶 R1与 R2的切点最长相距约 800 bp
例14.在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和 R2)处理某 DNA，进行凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，正确的是( )
C
PART
04
基因工程的应用
考点四：基因工程的应用
考点四：基因工程的应用
考点四：基因工程的应用
考点四：基因工程的应用
例15．下列有关基因工程应用的说法，错误的是（ ）
A．将外源生长激素基因导入动物体内可提高动物生长速率
B．将必需氨基酸含量多的蛋白质基因导入农作物，提高农产品的品质
C．利用基因工程技术，得到的乳腺生物反应器可以解决很多重要的药品的生产问题
D．用转基因动物作为器官移植的供体时，由于导入的是调节因子，而不是目的基因，因此无法抑制抗原的合成
D
例16 ．科学研究发现的新技术，要变成实际应用，需要很多的实验才能应用到实际中。早在2006年，两个研究小组几乎同时发现，将四个特定基因导入处于高度分化的体细胞(如成纤维细胞等)中，可诱导其形成具有胚胎干细胞样分化潜能的诱导性多能干细胞。虽然至今这项技术还在深入研究，但这项先进技术的潜在应用前景是（ ）
考点四：基因工程的应用
D
A．突破干细胞定向分化的障碍
B．改造和优化人类基因组结构
C．克隆具有优良品质的动物个体
D．解决异体组织/器官排斥难题
考点四：基因工程的应用
B
例17．如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“基因工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ在质粒上的识别位点如乙图所示。以下说法错误的是（ ）
A．PCR第一轮循环的产物可作为第二轮反应的模板
B．若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物2和3扩增目的基因
C．过程①中应使用限制酶BamHⅠ切割质粒
D．对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理，以防其污染环境
PART
05
蛋白质工程的原理和应用
考点五：蛋白质工程的原理和应用
（一）蛋白质工程概念：
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
基础
操作方法及对象
结果
目的
蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。
考点五：蛋白质工程的原理和应用
目标
实质
结果
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
通过改造或合成基因，来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质。
生产出自然界没有的蛋白质。
（二）蛋白质工程原理：
设计思路
①预期的蛋白质功能
②设计预期的蛋白质结构
③推测应有的氨基酸序列
④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因
⑤获得所需蛋白质
预期功能
生物功能
设计
推测
改造或合成
行使
折叠
目的基因
转录
mRNA
翻译
多肽链
蛋白质
(三维结构)
思
路
逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反
考点五：蛋白质工程的原理和应用
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象
操作起点
操作水平
操作流程
结果
实质
联系 基因
基因
DNA分子水平
DNA分子水平
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
可生产自然界没有的蛋白质
生产自然界已有的蛋白质
通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；
②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。
预期蛋白质功能
目的基因
考点五：蛋白质工程的原理和应用
例18．近年来，人工智能(AI)算法在蛋白质工程领域的应用已经被开发，下列关于AI算法在蛋白质工程领域应用的设想中，实现难度最大的是（ ）
A．根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构
B．根据蛋白质的空间结构推测其氨基酸序列
C．按照设定的氨基酸序列推测mRNA的碱基序列
D．按照设定的mRNA的碱基序列设计新基因
A
考点五：蛋白质工程的原理和应用
考点五：蛋白质工程的原理和应用
例19．已知生物体内有一种转运蛋白Y，由300个氨基酸组成。如果将Y中157位的L异亮氨酸变成亮氨酸，261位的酪氨酸变成丝氨酸，改变后的蛋白质Y1不但保留了原有Y的功能，且具备了催化活性。下列说法正确的是（ ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．可以通过对Y蛋白基因进行修饰或人工合成获得Y1蛋白基因
C．蛋白质工程操作过程中，不需要酶和载体作为工具
D．细胞内合成Y1蛋白与Y蛋白的过程中，遗传信息的流向是相反的
B
考点五：蛋白质工程的原理和应用
例20．T4溶菌酶（AO）在温度较高时易失去活性。研究人员通过蛋白质工程对T4溶菌酶第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键，获得了热稳定性高的T4溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（ ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．蛋白质工程与中心法则的流程方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质
C．检测A1活性时可先将A1与底物混合，再置于高温环境中
D．AO和A1空间结构的差异是二者热稳定性不同的直接原因
D
本课学习结束
单元复习
第3章 基因工程
内容网络
课标要求
生命观念:
1. 探究DNA的物理与化学性质，进行DNA分子的提取与鉴定。
2. 结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。
3. 针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
4. 基于基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业应用的实例，说明基因工程给社会带来的巨大进步。
5. 尝试通过蛋白质工程技术，根据人类需要的蛋白质结构，设计改造某一蛋白质的设计流程。
1. 运用结构与功能观说明基因工程的各种工具的特点。
2. 运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。
3. 说明基因的碱基排列顺序—蛋白质的结构—蛋白质功能的关系。
1. 探究DNA的物理与化学性质，进行DNA分子的提取与鉴定。
2.联系当地生产、生活中的具体实例，思考用基因工程的方法解决实际问题,基于基因工程在各方面发展的前景，理性看待基因工程的安全性。
3. 尝试运用逆向思维分析和解决问题。
科学思维、科学探究:
社会责任:
考点
CONTENTS
01 DNA的粗提取及鉴定
02 DNA重组技术
03 基因工程的基本操作程序
04 基因工程的应用
05 蛋白质工程的原理和应用
PART
01
DNA的粗提取及鉴定
考点一：DNA的粗提取及鉴定
原理一
原理二
原理三
思路 ：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
一、实验原理：
二、实验材料及用具：
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
1.选材：
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
2.试剂：
试剂
研磨液
体积分数为95%的酒精
二苯胺
2mol/L 的NaCl溶液
蒸馏水
溶解并提取DNA
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
研磨液成分 作用
SDS 使蛋白质变性
EDTA 抑制DNA酶
Tris-HCl缓冲液 稳定DNA
考点一：DNA的粗提取及鉴定
三、实验步骤：
1.破碎细胞——
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ， 研磨。
洋葱
研磨液
充分
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。
2.去除杂质——
在漏斗中垫上 过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
纱布
上清液
上清液
不可以用滤纸代替纱布。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
3.DNA的粗提取——
在上清液中加入体积相等的 溶液，静置2~3min，溶液中出现的
就是粗提取的DNA 。
预冷的酒精
白色丝状物
酒精作用：使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
预冷的酒精的优点
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
考点一：DNA的粗提取及鉴定
3.DNA的粗提取——
用玻璃棒沿 搅拌，卷起 ，并用滤纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心，取 晾干。
一个方向
沉淀物
丝状物
为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？
避免破坏DNA
4.DNA的鉴定——
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
二苯胺
2mol/L的NaCl
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
考点一：DNA的粗提取及鉴定
例1．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
D
考点一：DNA的粗提取及鉴定
6．“DNA粗提取与鉴定”实验需要对材料进行选择、处理。为了提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，下列对实验材料的选择和处理，正确的是（ ）
A．以猪成熟红细胞为实验材料时，可在滤液中加入适量的木瓜蛋白酶
B．以菜花为实验材料时，在研磨过程中可加入适量的纤维素酶
C．以植物叶片为实验材料时，一般使用体积分数为50%的预冷酒精提取DNA
D．以香蕉为实验材料时，将研磨液在4℃的冰箱中放置几分钟后，取沉淀物进行离心
B
PART
02
DNA重组技术
考点二：重组DNA技术（限制性内切核酸酶——“分子手术刀”）
主要是原核生物
来源
种类
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶
特点
（1）识别双链DNA分子特定核苷酸序列
（2）断开磷酸二酯键
识别序列长度
一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
专一性
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
结果
形成黏性末端或平末端
考点二：重组DNA技术（限制性内切核酸酶——“分子手术刀”）
限制酶的命名
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
限制酶的选择技巧
图甲 图乙
根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ；
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)
根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端；
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制
考点二：重组DNA技术（DNA连接酶——“分子缝合针”）
种类
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用 差别 只连接____________ 缝合___________和____________
E.coli
DNA连接酶
T4
DNA连接酶
黏性末端
黏性末端
平末端
（效率较低）
都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
考点二：重组DNA技术（限制性内切核酸酶——“分子手术刀”）
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键
考点二：重组DNA技术（限制性内切核酸酶——“分子手术刀”）
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
考点二：重组DNA技术（基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”）
载体的 作用
载体 的必 要条件
载体 的种
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
②具一个或多个限制酶切点，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。
③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。
④必须是安全的 ，对受体细胞无害。
①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
①细菌的质粒：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
考点二：重组DNA技术（基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”）
01
在基因工程中真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的
简言之一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子
经过人工改造
特殊的标记基因 复制原点 启动子 终止子 目的基因插入位点
质粒的组成要素
质粒
02
质粒
考点二：重组DNA技术
例3.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ）
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b
A
考点二：重组DNA技术
例4.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
C
考点二：重组DNA技术
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源 ：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
PART
03
基因工程的基本操作程序
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
（一）目的基因：
主要指的是编码蛋白质的基因
概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
实例：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
（二）筛选合适目的基因：
筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
DNA半保留复制
原理
体外
操作环境
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
目的
可在短时间内大量扩增目的基因
优点
聚合酶链式反应
全称
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR
参与的组分 在PCR中的作用
前提条件
高温
模板DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
引物
一定的缓冲溶液(Mg2＋)
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
主要是DNA单链或RNA,使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
已知基因的核苷酸序列
提供合适的酸碱度和离子，DNA聚合酶需要Mg2＋激活
(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
(2)引物为DNA聚合酶提供了游离的3′端，使DNA聚合酶从3′端延伸子链。（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能）
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
5.PCR的结果
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
6.产物进行鉴定
PCR过程可以在 中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物
琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增仪
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
PCR技术与DNA复制过程比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
例5.下列有关PCR技术的叙述,错误的是 ( )
A.每一次循环后目的基因的数量可以增加一倍
B.PCR反应过程中需要3个不同的温度范围
C.PCR反应过程中加入的酶的显著特性是耐高温
D.模板DNA和引物能在每一次扩增中重复使用
D
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
例6.在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针,可应用PCR技术进行扩增,应选择的引物种类是( )
A.引物1与引物2 B.引物3与引物4
C.引物2与引物3 D.引物1与引物4
C
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
例7．如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，有关说法不正确的是
（ ）
A．a→b过程中一般用4种脱氧核苷酸为原料，并加入两种引物
B．b→c为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是受精卵
C．a→b过程利用了DNA半保留复制的原理，需要使用RNA聚合酶
D．b→d为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法
C
考点三：基因工程的基本操作技术（①目的基因的筛选与获取）
考点三：基因工程的基本操作技术（②基因表达载体的构建）
（一）目的：
①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代;
（二）组成：
质粒
①启动子
基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA
②终止子：
限制酶切割位点
基因的尾端，能终止mRNA的转录
③标记基因
作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
④复制原点
⑤目的基因
②使目的基因能够表达和发挥作用。
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
考点三：基因工程的基本操作技术（②基因表达载体的构建）
首先，用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；
01
（三）构建过程：
质粒
限制酶
限制酶切割位点
限制酶
限制酶切割位点
获取目的基因
目的基因
然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
02
DNA
连接酶
重组
DNA分子
利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。
03
考点三：基因工程的基本操作技术（②基因表达载体的构建）
单酶切
用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
a、b、c、d四个黏性末端相同
缺点一：
在DNA连接酶的作用下，质粒被重新环化。
DNA连接酶
连接
DNA连接酶
连接
在DNA连接酶的作用下，目的基因被环化。
缺点二：
反向连接
重组DNA
a
d
c
a
缺点三：
在DNA连接酶的作用下，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。
双酶切
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段。
限制酶a切割
a
b
DNA连接酶
连接
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
a
b
考点三：基因工程的基本操作技术（②基因表达载体的构建）
A.NdeⅠ和BamHⅠ
B.NdeⅠ和XbaⅠ
C.XbaⅠ和BamHⅠ
D.EcoRⅠ和KpnⅠ
例8.如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列，为使该基因与该质粒构建重组质粒，切割目的基因和质粒时应该选择哪两种酶( )
A
考点三：基因工程的基本操作技术（②基因表达载体的构建）
例9.如图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点，下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述，错误的是（ ）
A.若通过PCR技术提取该目的基因应
该选用引物甲和引物丙
B.图1中的质粒用BclⅠ切割后，含有
2个游离的磷酸基团
C.构建基因表达载体时为了防止目的
基因和质粒的自身环化，可以选用BamHⅠ和HindⅢ剪切
D.在导入目的基因的受体细胞中，四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因不能同时表达
C
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
适用生物：开花植物
（2）农杆菌转化法
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到该细胞染色体的DNA上。
②原理：
1.将目的基因导入植物细胞
考点三：基因工程的基本操作技术（③将目的基因导入受体细胞）
2.将目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
①体积大，易操作。②易表现出全能性。
（3) 过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
考点三：基因工程的基本操作技术（③将目的基因导入受体细胞）
3.将目的基因导入微生物细胞
Ca2+处理法
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
Ca2+处理细胞
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
Ca2+处理目的
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
受体细胞
（1）原核细胞（常选择大肠杆菌）
（2）优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
考点三：基因工程的基本操作技术（③将目的基因导入受体细胞）
考点三：基因工程的基本操作技术（③将目的基因导入受体细胞）
种类项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法； 花粉管通道法 显微注射法 Ca2＋处理法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
考点三：基因工程的基本操作技术（③将目的基因导入受体细胞）
A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ 是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
例10.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是( )
B
考点三：基因工程的基本操作技术（④目的基因的检测与鉴定）
目的：
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
——“抗原—抗体杂交技术”
2.个体生物学水平鉴定
1.分子水平检测
抗性检测：
功能活性比较：
PCR技术或分
子杂交技术
抗虫、抗病接种实验；
基因工程产品与天然产品的功能活性比较
——检测是否具有抗性以及抗性强度等
如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠
考点三：基因工程的基本操作技术（④目的基因的检测与鉴定）
例11.人血白蛋白在临床上被广泛应用。我国科学家通过生物工程技术在水稻胚乳中提取到人血白蛋白，其流程如下图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．PCR扩增时需要DNA模板、引物、耐高温的RNA聚合酶等条件
B．过程①需用农杆菌转化法将人血白蛋白基因直接导入水稻胚乳细胞中
C．过程①需将目的基因与胚乳中特异性表达基因的启动子等调控元件重组
D．过程②改变生长素和细胞分裂素的浓度及比例不影响细胞的脱分化过程
C
考点三：基因工程的基本操作技术（④目的基因的检测与鉴定）
例12.科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组
B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶
C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞
D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜
C
考点三：基因工程的基本操作技术（⑤ DNA片段的扩增及电泳鉴定）
一、实验原理
（一）DNA体外扩增的原理：
①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
变性
90 C
延伸
72 C
退火
50 C
电泳鉴定原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
（二）DNA片段电泳鉴定原理：
考点三：基因工程的基本操作技术（⑤ DNA片段的扩增及电泳鉴定）
二、实验步骤
（一）DNA片段扩增的具体过程：
移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
扩增：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
（二）PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程：
制备凝胶
电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
进行电泳
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察鉴定
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
①融化：
②倒模:
③凝固:
①加液：
②加样：
③电泳：
考点三：基因工程的基本操作技术（⑤ DNA片段的扩增及电泳鉴定）
例13.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
考点三：基因工程的基本操作技术（⑤ DNA片段的扩增及电泳鉴定）
A.该 DNA 最可能是线状 DNA 分子
B.两种限制酶在该 DNA 上各有两个酶切位点
C.限制酶 R1与 R2的切点最短相距约 200 bp
D.限制酶 R1与 R2的切点最长相距约 800 bp
例14.在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和 R2)处理某 DNA，进行凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，正确的是( )
C
PART
04
基因工程的应用
考点四：基因工程的应用
考点四：基因工程的应用
考点四：基因工程的应用
考点四：基因工程的应用
例15．下列有关基因工程应用的说法，错误的是（ ）
A．将外源生长激素基因导入动物体内可提高动物生长速率
B．将必需氨基酸含量多的蛋白质基因导入农作物，提高农产品的品质
C．利用基因工程技术，得到的乳腺生物反应器可以解决很多重要的药品的生产问题
D．用转基因动物作为器官移植的供体时，由于导入的是调节因子，而不是目的基因，因此无法抑制抗原的合成
D
例16 ．科学研究发现的新技术，要变成实际应用，需要很多的实验才能应用到实际中。早在2006年，两个研究小组几乎同时发现，将四个特定基因导入处于高度分化的体细胞(如成纤维细胞等)中，可诱导其形成具有胚胎干细胞样分化潜能的诱导性多能干细胞。虽然至今这项技术还在深入研究，但这项先进技术的潜在应用前景是（ ）
考点四：基因工程的应用
D
A．突破干细胞定向分化的障碍
B．改造和优化人类基因组结构
C．克隆具有优良品质的动物个体
D．解决异体组织/器官排斥难题
考点四：基因工程的应用
B
例17．如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“基因工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ在质粒上的识别位点如乙图所示。以下说法错误的是（ ）
A．PCR第一轮循环的产物可作为第二轮反应的模板
B．若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物2和3扩增目的基因
C．过程①中应使用限制酶BamHⅠ切割质粒
D．对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理，以防其污染环境
PART
05
蛋白质工程的原理和应用
考点五：蛋白质工程的原理和应用
（一）蛋白质工程概念：
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
基础
操作方法及对象
结果
目的
蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。
考点五：蛋白质工程的原理和应用
目标
实质
结果
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
通过改造或合成基因，来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质。
生产出自然界没有的蛋白质。
（二）蛋白质工程原理：
设计思路
①预期的蛋白质功能
②设计预期的蛋白质结构
③推测应有的氨基酸序列
④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因
⑤获得所需蛋白质
预期功能
生物功能
设计
推测
改造或合成
行使
折叠
目的基因
转录
mRNA
翻译
多肽链
蛋白质
(三维结构)
思
路
逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反
考点五：蛋白质工程的原理和应用
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象
操作起点
操作水平
操作流程
结果
实质
联系 基因
基因
DNA分子水平
DNA分子水平
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
可生产自然界没有的蛋白质
生产自然界已有的蛋白质
通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；
②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。
预期蛋白质功能
目的基因
考点五：蛋白质工程的原理和应用
例18．近年来，人工智能(AI)算法在蛋白质工程领域的应用已经被开发，下列关于AI算法在蛋白质工程领域应用的设想中，实现难度最大的是（ ）
A．根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构
B．根据蛋白质的空间结构推测其氨基酸序列
C．按照设定的氨基酸序列推测mRNA的碱基序列
D．按照设定的mRNA的碱基序列设计新基因
A
考点五：蛋白质工程的原理和应用
考点五：蛋白质工程的原理和应用
例19．已知生物体内有一种转运蛋白Y，由300个氨基酸组成。如果将Y中157位的L异亮氨酸变成亮氨酸，261位的酪氨酸变成丝氨酸，改变后的蛋白质Y1不但保留了原有Y的功能，且具备了催化活性。下列说法正确的是（ ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．可以通过对Y蛋白基因进行修饰或人工合成获得Y1蛋白基因
C．蛋白质工程操作过程中，不需要酶和载体作为工具
D．细胞内合成Y1蛋白与Y蛋白的过程中，遗传信息的流向是相反的
B
考点五：蛋白质工程的原理和应用
例20．T4溶菌酶（AO）在温度较高时易失去活性。研究人员通过蛋白质工程对T4溶菌酶第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键，获得了热稳定性高的T4溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（ ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．蛋白质工程与中心法则的流程方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质
C．检测A1活性时可先将A1与底物混合，再置于高温环境中
D．AO和A1空间结构的差异是二者热稳定性不同的直接原因
D
本课学习结束