3.2通过细胞核移植克隆动物-教学设计

教学设计
课程基本信息
学科 高中生物学 年级 高二 学期 秋季
课题 单克隆抗体的制备
教学目标
1. 了解单克隆抗体制备的操作流程。 2. 掌握常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学内容
教学重点： 1. 单克隆抗体制备的操作流程。
2. 常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学难点： 1. 杂交瘤细胞的筛选与克隆化。
2. 常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学过程
教学流程教学具体实施过程设计意图一、教学实施背景单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。 单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，在临床医学的应用主要表现：①作为医学诊断试剂，广泛应用在病原微生物抗原、抗体的检测；肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的检测；激素测定；细胞因子的测定等。②蛋白质的提纯。③肿瘤的靶向治疗，即将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至肿瘤细胞，直接杀伤肿瘤细胞。 教材中只呈现单克隆抗体制备的流程图，简述单抗制备的优点及应用方向。没有要求实际操作过程，学生缺少单抗制备的感性认识。通过操作视频熟悉单克隆抗体制备的原理，了解单克隆抗体制备的过程和鉴定方法。 通过了解单抗的在医学上的应用，感知生物技术对人类发展的重要意义。二、教学具体流程先将本节知识点涉及的教学难点——实验部分，进行视频同步讲解，结合视频突破教学难点，具体内容如下： 一、原理 抗原免疫的 B 淋巴细胞能够产生特异性抗体，但在体外不能进行无限增殖；而骨髓瘤细胞虽然可以在体外进行无限增殖，但不能产生特异性抗体。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，这种细胞具有两种亲本细胞的特性，既具有 B 淋巴细胞合成和分泌特异性抗体的能力，也具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性。即杂交瘤细胞可在体内外长期培养，又能不断地分泌特异性抗体。 经在 HAT 培养基中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡，而未融合的骨髓瘤细胞合成 DNA 的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤 - 鸟嘌呤 - 磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成 DNA 的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤 - 鸟嘌呤 - 磷酸核糖转移酶，因此能在 HAT 培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 二、材料与用具 1．实验动物 8～10 周龄，重约 20g，健康的 Balb/c 纯系小鼠，雌雄均可。 2．细胞 小鼠骨髓瘤细胞（Sp2/0 细胞）。 3．试剂 50% 聚乙二醇（PEG）、无菌生理盐水、2.5% 碘伏、75% 乙醇溶液、台盼蓝溶液、蒸馏水； R/MINI-1640 培养液、HT 培养基、HAT 选择培养基、小牛（或胎牛）血清、10% 二甲基亚砜（DMSO）。 4．器材 解剖刀剪、细胞计数板、试管、带刻度吸管、注射器、6cm 平皿、加样器、CO2 培养箱、细胞培养瓶、96 孔培养板、超净工作台、水平式离心机、倒置显微镜、冰箱等。 三、具体步骤 1．免疫动物： 先选用 Balb/c 小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 2．骨髓瘤细胞的制备： 在融合前 48h，用含 20% 小牛血清的 R/MINI-1640 培养液，将骨髓瘤细胞增殖培养。融合前 24h，再以同样培养液换液一次，使细胞融合当天处于对数生长期。取数瓶骨髓瘤细胞，轻轻去除瓶内原有培养液，加入冷的无血清培养液少许，用吸管将细胞吹打均匀在培养液中，离心洗涤后悬于无血清培养液中。台盼蓝染色检查活细胞数应大于 95%，置于37℃下备用。 3．免疫小鼠脾细胞的制备： 取末次免疫后第三天的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。颈椎脱臼处死小鼠，浸泡于 75% 乙醇溶液中 3～5min。无菌操作取出脾，置平皿内的 200 目钢网上，加入 10mL 的 R/MINI-1640 培养液，用注射器芯将脾细胞轻轻挤压过网，制备脾细胞悬液，用此 R/MINI-1640 培养液将脾细胞洗涤 2 次（以 1000r/min 转速离心 10min），弃上清液，用R/MINI-1640 培养液悬浮沉淀，计数活细胞数，一般每只小鼠可得 0.5×108 个脾细胞。 4．饲养细胞准备： 将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒器械从下腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。将 10mL 培养液注射至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部 1min，随后吸出注入的培养液。离心 10min（转速 1000r/min），弃上清液。先用 5mL HAT 培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加 HAT培养基，使细胞浓度为 2×108/mL，将细胞加入 96 孔细胞培养板中，每孔 0.1mL，置 CO2 培养箱备用。 5．细胞融合 （1）将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按 1∶5～1∶10 比例混合，加入 20～50mL R/MINI-1640 液，以 1000r/min 转速离心，弃上清液，将上清液尽量吸净，以免影响 PEG 的浓度。 （2）用手指轻弹离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管置 37℃水浴中。吸 1mL 37℃预温的 50%PEG 缓慢滴入离心管内，边加边轻轻摇晃，1min 内加完，37℃静置 1min。加 R/MINI-1640 液（37℃预温）1mL，1min 内加完，再加 R/MINI-1640 液 10mL，边加边轻轻摇晃 1min，然后加 R/MINI-1640 液至 50mL，使 PEG 作用终止。 （3）以 800r/min 转速离心 10min，弃全部上清液。加入少许 HAT-R/MINI-1640 选择培养液，用 1mL 吸管轻轻混匀，切记不可用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。随后将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的 HAT 培养液中，接种于 96 孔培养板（0.1mL/ 孔）。接种完毕后，将培养板放入 37℃的 CO2 培养箱中培养。每天观察细胞培养板有无细菌污染及克隆生长情况。 6．选择性培养： 接种 96 孔板 1 周后换 HAT 培养液，每次吸出培养孔旧液 1/2，换入新液，连续 2 周。 3～5d后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡，1 周左右可出现克隆，并不断增殖，当集落大于 3mm 或布满孔底 1/2 时即可取上清做抗体活性检测，同时补加新鲜 HAT 培养液。在一次较好的融合试验中，70%～80% 的孔有。所有生长克隆的孔都需要取培养上清液进行抗体活性检测。培养 3 周后即可改用普通完全培养液。 7．杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化： （1）杂交瘤阳性克隆的筛选： 常用方法有酶联免疫吸附试（ELISA）、验免疫荧光、放射免疫测定、间接血凝试验、溶血空斑试验等。首先初筛出能分泌与预定抗原起反应的 McAb 杂交瘤细胞，再进一步从中筛选出有预定特异性的杂交瘤细胞，然后选出可供实际应用具有能稳定生长和有功能特性的细胞克隆。而且应尽量多选数株细胞，以保证有足够的候选株供实际应用。 （2）克隆化技术： 克隆化的方法包括有限稀释法、软琼脂平板法、显微操作法和荧光激活细胞分选法，最常用的方法是有限稀释法。有限稀释法是将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出 1mL的细胞数。用 HT 培养液稀释，使细胞浓度为 50～60 个 /mL，于 96 孔培养板中每孔加 0.1mL（5～6 个细胞 / 孔）。接种两排，剩余细胞悬液用 HT 培养液作倍比稀释，再接种两排，如此类推，直至使每孔含 0.5～1 个细胞。培养 4～5d 后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液 200μL/ 孔。第 8～9 天时肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此重复 3～5 次，直至达 100% 阳性孔率时即可，以确保抗体由单个克隆所产生。初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加 HT。 8．单克隆抗体的大量制备： 获得稳定的杂交瘤细胞系后，即可根据需要大量生产 McAb。目前制备 McAb 主要采用动物体内诱生腹水法和体外培养法。 （1）动物体内诱生腹水法：先在小鼠腹腔注射液体石蜡或福氏不完全佐剂，一周后将杂交瘤细胞悬液注射入小鼠腹腔。接种 10～14d 后，可分次采集腹水，将收集的腹水离心去除细胞，灭活（56℃，30min），再离心，取上清液即可。 （2）体外培养法：将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，待培养液颜色改变或细胞过多开始死亡时，收集上清液，离心去掉碎片及细胞即可。 9．单克隆抗体性质的鉴定： 为了更好地利用所获得的单克隆抗体，需对单克隆抗体的性质进行鉴定，鉴定的内容包括特异性、免疫球蛋白的类及亚类、亲和力、识别结合抗原的表位及其分子量等。 制备针对某种抗原的某一抗原表位的特异性 McAb。 分析培养原理，认识细胞融合的类型与杂交瘤细胞筛选的方法，感受生物技术的奥妙与实验的乐趣。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应 B 淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏 B 淋巴细胞。 在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易存活，必须加入其他活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称为饲养细胞（feeder cell）。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤 - 鸟嘌呤 - 磷酸核糖转移酶，因此能在 HAT 培养基中存活和增殖。 杂交瘤细胞在 HAT 培养液中生长形成克隆后，其中仅少数是分泌预定特异性 McAb 的细胞。 为了防止无关克隆的过度生长，需对检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化培养。 体内诱生法操作简便、经济、抗体浓度高。但腹水中常混有小鼠的其他蛋白，因此要提纯后方可使用。 体外培养法所得抗体含量不高，且需要特殊仪器设备，故常用于实验室中。三、疑难问题解析一、注意事项与难点突破 1．免疫的动物应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物，因为免疫动物品系和骨髓瘤细胞种系越远，融合的杂交瘤细胞越易发生免疫排斥反应，越不稳定。 2．为防止细胞污染，通常用的抗生素有青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL）、四环素（50μg/mL）、庆大霉素（50μg/mL），其中青霉素和链霉素联合使用较为常用，俗称“双抗”。 3．PEG 有毒性，在细胞融合过程中作用时间不宜过长。 4．整个制备过程应严格无菌操作。对于细胞传代培养应适时注意更换培养液，防止细胞死亡，避免因此而造成的损失。