3.1细胞培养是动物细胞工程的基础-教学设计

教学设计
课程基本信息
学科 高中生物学 年级 高二 学期 秋季
课题 动物细胞的培养
教学目标
1. 了解动物细胞培养的操作流程。 2. 掌握常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学内容
教学重点： 1. 动物细胞培养的操作流程。
2. 常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学难点： 1. 原代培养与传代培养的区别。
2. 常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学过程
教学流程教学具体实施过程设计意图一、教学实施背景动物细胞培养技术是指从机体中取出组织或细胞，或利用已建立的细胞系，在特定的人工条件下使细胞在培养容器中生长和生产生物制品的一门技术。通常细胞培养泛指所有的体外培养，但就培养物而言，体外培养分为细胞培养、组织培养和器官培养。 但本节课涉及的生物技术，在现有的高中实验条件下很多学校无法完成，借助实验视频资料，可以化抽象为直观，让学生充分感受到科学技术的魅力，便于更好区分动物细胞培养的原代培养和传代培养。明确本节涉及的要点内容，激发学习兴趣。 二、教学具体流程先将本节知识点涉及的教学难点——实验部分，进行视频同步讲解，结合视频突破教学难点，具体内容如下： 一、教学具体流程 1.原理 细胞原代培养是直接从生物体获取组织细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。细胞原代培养为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为细胞传代培养创造条件。按照组织来源不同，我们可采用组织块法和分散细胞法进行原代培养，例如心肌细胞、皮肤细胞可采用组织块法，肝脏细胞、肾脏细胞、软质肿瘤细胞可采用分散细胞法。我们主要介绍分散细胞法。分散细胞法是采用机械法或酶消化法使细胞从组织块中解离。如脾、肝、脑、软质肿瘤等。通注射器挤压，筛网挤压过滤、反复吹打等方法使细胞彼此离散，形成单细胞悬液，进行原代细胞培养。 实验室开展的细胞培养，大多是贴壁依赖型培养细胞。贴壁细胞传代培养就是指细胞需要贴附在一定的固相表面才能生长的细胞培养。大多数动物细胞为贴壁依赖型细胞，这些细胞紧密的贴于瓶壁，大多需要通过胰蛋白酶等消化液处理细胞，才能让细胞与瓶壁分离。 2.材料与用具 细胞原代培养过程则主要包括取材、组织分离、解离组织块、分离细胞，接种至培养器瓶中，C02培养箱静置培养等步骤。用于细胞原代培的器材主要有培养瓶，培养血，离心管，解剖器材等。用于原代细胞培养的器材必须无菌，无菌包装的器材需查看保质期以及包装是否完整。非无菌包装器材需要经过灭菌处理。 常用的细胞培养用液有：培养基（RPMI1640，是常用的基础培养基，），培养基中需要添加10%的血清FBS，1%的双抗（青霉素/链霉素）、PBS、Hank’s缓冲液等。无菌包装的培养用液需要查看包装的完整性或有无破损，自己配制的培养基或PBS等均需用0.45 um的滤膜过滤除菌，这就是用于过滤的滤器，还有培养板、培养皿，离心机等。 3.培养过程 （1）原代培养 第一步，取材分离组织，先取小鼠，将小鼠拉颈椎处死，置入70%酒精浸泡杀菌，移到超级工作台中无菌环境取出小鼠（或乳鼠），放置在操作盘中，用手术器械逐层分离皮肤和肌肉组层，打开腹腔和胸腔。注意不同的解剖层次使用不同的消毒器械。最后取出心脏和肾脏，置于无菌平皿内。用Hanks液洗涤3次。 第二步，解离组织，用弯头剪分别把心脏和肾脏组织剪碎，每个组织块大约1mm3左右，用Hanks液洗涤2-3次，自然沉淀，用吸管吸去上清液。心肌组织我们采用组织块法，就是将剪碎的组织块中加入0.5-1 ML培养基，吸取组织块悬液，转入细胞培养瓶中，尽量让组织块铺展开，在37℃培养箱内放置2-3h。待组织块牢牢贴于瓶壁后，轻轻沿瓶壁补加培养基只3-5 ML，37℃ C02培养箱内静置培养。 肝脏组织采用消化法，将肝脏组织块放人培养皿中，加入1-2mL 0.25%的胰蛋白酶，消化5-7 min。加入1 mL培养基终止消化，用滤网过滤，取过滤液移入15 ML离心管中。加PBS到10 mL，混匀，1000 rpm离心5min，收集细胞。用PBS洗涤两次，弃上清，加入培养基5ml，根据细胞密度，转入细胞培养瓶中，补充培养基到5mL，37℃ C02培养箱内静置培养。 （2）传代培养 开始细胞传代培养时，我们取出细胞培养皿（瓶），首先在倒置显微镜观察细胞。查看细胞的生长状态：（细胞形态、细胞活力），查看细胞密度：（铺满瓶壁70-90%为宜）。 第二步，分离细胞：直接弃除老培养基，加入适量PBS洗涤细胞2次，弃掉PBS液，加入1-2mL 0.25%的胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察细胞，细胞会逐步从瓶壁上分离，变圆，加入有血清培养基终止消化，用移液器或（滴管）吸取培养基将细胞从瓶壁吹下细胞，获得细胞悬液。注意吹打细胞时尽量不要产生气泡。 第三步，细胞计数，取细胞悬液20uL，加入60μL台盼蓝染液，混匀，取10-15μL细胞加入细胞计数板内，在显微镜下观察，计数四角大方格中的细胞数。细胞数（ml）=（4个大格细胞数之和）x104x稀释倍数；计算细胞的存活率，细胞存活率=[4大格活细胞数/（4大格细胞总数）]x100%。因为台盼蓝只染死细胞，所以我们很容易辨识死细胞。 第四步，根据细胞计数结果，加入培养基调整细胞密度。 第五步，分瓶，取一定量的细胞悬液，加入到新的细胞培养瓶中，添加新鲜培养基3-5mL，混匀最后，细胞培养瓶放置细胞到CO2培养箱中静置培养。 比较两种培养的差异。 明确本知识点涉及的原理，从概念上区分原代培养和传代培养 明确不同培养目标，培养基和实验材料、用具的差异，通过分析资料，训练学生的思维，提高信息处理能力 通过培养流程的学习和视频的学习，简述什么是原代培养 为什么用胰酶处理？ 通过培养流程的学习和视频的学习，说出什么是传代培养 比较原代培养和传代培养的不同。提供资料训练学生的思维，提高信息处理能力三、疑难问题解析1.动物细胞传代的原因 原代培养细胞的显微观察，我们要每天用倒置显微镜观察细胞生长状态，如果有细胞污染要及时清理。图5是原代培养3天和7天细胞生长情况，一般5-6天，细胞会铺满瓶壁50%以上。原代培养期内，培养物中各种细胞成分混杂，具有明显的异质性，各细胞的遗传形状互不相同，而且细胞间相互依存性强，细胞集落形成率很低，细胞独立生存能力较差。 2.原代培养的注意事项 第一，所用动物、器械（准备至少三套）、培养基、PBS等要求严格无菌。第二，严格进行无菌操作，防止细菌、霉菌、支原体污染，避免化学物质污染。第三，从取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。第四，动物组织取材时，注意不能刺破消化道等脏器，如果消化道破裂，需要更换动物，否则容易造成污染。第五，离心是在有菌的环境进行，所以，组织细胞离心时要注意盖严，从有菌环境移入超净台时，要做表面消毒。 3.传代培养的注意事项 要预防细菌、真菌等污染，要严格按照无菌操作程序进行，细胞培养环境要严格无菌。细胞培养操作过程要细致，避免手接触瓶口。细胞培养用器材要严格与其他器材分开，避免混用，造成污染。要预防病毒污染：病毒主要来源于血清，所以血清要来源可靠。要预防支原体污染：支原体可来源于血清或新接入的细胞，一旦细胞生长特别缓慢，要检查是否有支原体污染，支原体可用荧光染色查看，可用抗生素法去除支原体。同时进行多个细胞操作时，不能共用移液管，要预防细胞之间的交叉污染。深入探讨，落实知识点的同时，理解概念，达成教学目标