教学设计
课程基本信息
学科 高中生物学 年级 高二 学期 秋季
课题 PCR技术
教学目标
熟悉PCR技术的原理和操作流程。 2. 了解引物设计方法和PCR技术的应用。
教学内容
教学重点： 1. PCR技术操作流程。
2. 琼脂糖凝胶电泳的操作流程。
教学难点： 1. PCR技术与体内DNA复制的异同点。
2. PCR技术的应用。
教学过程
教学流程教学具体实施过程设计意图一、教学实施背景1.背景： 大肠杆菌DH5ɑ菌株很容易获取，很多实验室均有保存。其细胞中的β-actin基因是一种高效稳定表达的基因，研究的已经非常清楚，非常容易被检测出来； 2.问题情境： 引物怎么设计？遵循什么原则？ 通过查阅已报道的文献获取扩增大肠杆菌DH5ɑ菌株β-actin基因的引物或利用primer 5.0软件自行设计β-actin基因的引物改用易获得的大肠杆菌DH5ɑ菌株作为实验材料，扩增高效稳定表达的β-actin基因作为检测基因能够更高效的完成实验； 培养学生查阅文献资料的习惯、提高熟练应用相关软件的能力，有利于理解PCR扩增中引物设计需要遵循的原则及引物质量的重要性。二、教学具体流程先将本节知识点涉及的教学难点——实验部分，进行视频同步讲解，结合视频突破教学难点，具体内容如下： 一、材料与用具： 大肠杆菌DH5ɑ菌株、Taq DNA聚合酶、PCR反应体系（TaKaRa公司）、公司合成的β-actin引物F/R等 实验用具： PCR仪、微量移液器、离心机等 实验原理： PCR 全过程包括三个基本步骤,即双链 DNA 模板加热变性成单链(变性);在低温下引物与单链DNA互补配对(退火);在适宜温度下 Taq DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板,利用4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)催化引物引导的 DNA 合成(延伸)。这三个基本步骤构成的循环重复进行,可使特异性 DNA 扩增达到数百万倍。 二、具体步骤： 使用微量移液器将表1所示的PCR体系各成分加入200uL已灭菌的微量离心管中，用微量移液器反复吹吸使反应液混合均匀。以 3000r/min的转速离心30s，使反应液集中于微量离心管的底部。如图1所示，将微量离心管放入PCR仪中进行扩增，设置反应条件见图2所示。 表1 PCR反应体系 成分体积10x扩增缓冲液5uLdNTP2uL引物F4uL引物R4uLTaq DNA聚合酶1uL无菌水32uL大肠杆菌悬液2uL总体积50uL
图1 PCR仪 图2 PCR循环参数 三、疑难问题解析一、注意事项和难点突破： PCR所用的微量离心管以及吸液枪头一定是已经灭菌的，而且每次吸取一种液体都要更换枪头，避免用手接触枪头 使用微量移液器时，操作一定得规范，否侧误差较大。 二、疑难问题： 体内DNA复制和PCR技术的异同有哪些？ PCR的常见应用有哪些？ 清楚一些注意事项有利于提高实验的成功率，以及有助于帮助学生分析实验异常结果； 通过比较可以加强学生对PCR与体内DNA复制的理解； 在理解并熟练操作PCR技术的基础上，能够提高其实践运用的能力教学设计
课程基本信息
学科 高中生物学 年级 高二 学期 秋季
课题 转基因大肠杆菌的培养
教学目标
1. 了解以大肠杆菌为受体细胞的基因工程操作流程。 2. 掌握常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学内容
教学重点： 1. 基因工程操作流程。
2. 常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学难点： 1. 目的基因的检测方法。
2. 常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学过程
以制备具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌为情境，通过视频进行直观化教学，并辅以探究性问题及练习等方法，阐明基因工程的基本操作程序。 教学流程教学具体实施过程设计意图一、导入抗生素是常见的药品，使用过量抗生素易导致出现拉肚子的现象，可以通过转基因手段获得具有Amp抗性的大肠杆菌，这一过程可通过热激法实现。通过创设实验情境，以问题探究的形式进行转基因大肠杆菌培养的相关教学二、实验突破先将本节知识点涉及的教学难点——实验部分，进行视频同步讲解，结合视频突破教学难点，具体内容如下： 二.表达载体导入受体细胞 感受态细胞在0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，而转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物，并粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，可促使细胞迅速收缩，吸收DNA复合物，完成转化。 视频展示并同步讲解 1、实验前将水浴锅温度调至42℃，并提前加热到预设温度。 2、冰上融化感受态DH5a,，加1ug/ul的质粒1ul于10ul感受态中，冰上放置30min。 3、42℃水浴锅中热休克90s，迅速转移至冰上2min-5min。 4、在无菌工作台内向各管含质粒的感受态中加入200ulLB培养液（无抗性），然后转移到培养管中，37℃条件下，低速培养1h。 5、将200ul悬液倒入相应抗性的LB固体培养基上，把涂布棒在酒精灯上过火灭菌然后把悬液涂布均匀，倒置于37℃恒温孵箱中培养12-16小时，次日观察菌落生长情况。 三.目的基因及表达产物的检测 提出问题：获得菌落后如何进行扩大培养？ 挑取菌落，分别将其加入到含Amp的LB液体培养基中进行震荡培养。 挑取的菌落是否一定转入质粒？ 不一定，可能是由于突变获得了Amp抗性。 如何进行鉴定？ ①核酸分子杂交 ②依据质粒序列，对菌液或菌落进行PCR 先进行相关实验材料及实验原理的介绍，再以真实实验视频为载体进行直观化教学,在实验过程中进行相关操作的讲解；同时，对于基因工程中的难点与易错点—目的基因的检测，让学生进行了思考探究，帮助学生巩固落实基因工程的基本操作流程。三、拓展延伸一、目的基因检测和表达产物检测的区别 二、菌落PCR时引物的选取问题 三、电泳时条带判断问题 选取的三个问题为本节微课的难点，同时也是学生难以理解的易错考点，通过问题的形式进行再次辨析，让学生能切实解决重难点。教学设计
课程基本信息
学科 高中生物学 年级 高二 学期 秋季
课题 微生物蓝白斑实验
教学目标
1. 了解以大肠杆菌为受体细胞的基因工程操作流程 2. 掌握常见实验器材的使用方法和使用规范
教学内容
教学重点： 1. 大肠杆菌蓝白斑实验操作流程
2. 蓝白斑产生的原理分析
教学难点： 1. 蓝白斑产生的原理分析
2. 常见实验器材的使用方法和使用规范
教学过程
蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法，以大肠杆菌为受体细胞，通过视频进行直观化教学，并辅以探究性问题及练习等方法，阐明基因工程的基本操作程序。 教学流程教学具体实施过程设计意图一、导入野生型埃希氏大肠菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。通过观察菌落颜色判断实验效果。通过创设实验情境，以问题探究的形式进行转基因大肠杆菌培养的相关教学二、实验突破先将本节知识点涉及的教学难点——实验部分，进行视频同步讲解，结合视频突破教学难点，具体内容如下： 一.构建重组质粒 目的基因和质粒通过限制性核酸内切酶和T4链接酶构建成重组质粒 二.转化大肠杆菌 视频展示并同步讲解 1、将 ITPG 和 X-Gal 配制为溶液，除菌后冷冻保存，备用。 2、制备 LB 液体培养基、LB 固体培养基、含氨苄青霉素（标记为 Amp+）的 LB 固体培养基，备用。 3、重组质粒的制备： 4、将质粒转化至大肠杆菌： 5、制备含 ITPG、X-Gal 的培养基（ 现用现制）： 取适量 ITPG、X-Gal 溶液均匀涂布于含有氨苄青霉素的 LB 固体培养基表面，晾干。 6、涂板：取 100 μL 步骤 4 获得的转化细菌分别涂布于添加 IPTG、X-Gal 的培养基表面，37℃恒温培养箱倒置培养 12 h。 7、观察： 实验组和对照组经转化后的大肠杆菌菌落呈现出不同的颜色， 分别统计实验组、对照组中的蓝斑和白斑数目。 三.大肠杆菌培养及蓝白斑的观察 在实验过程中可能会出现三种可能性：（1）没有蓝斑，（2）没有白斑，（3）无菌落生长。 让学生分析出现上述结果的原因及改进建议。 先通过蓝白斑筛选实验， 培养基的配制、灭菌、无菌操作、DNA 的连接、 菌落的计数等不再是孤立的实验步骤，而是服务于一个大的实验目的“ 通过外源基因的导入，使大肠杆菌发生转化， 最终产生白色的菌落”。 在“ 蓝白斑筛选” 科技实践活动中， 知识学习更加系统化、能力提升更加全面化。三、拓展延伸一、基因工程操作的流程如何？ 二、如何进行大肠杆菌扩大培养？ 三、菌落的观察指标有哪些？ 四、大肠杆菌表达体系的优点 对出现的可能三种实验结果进行分析和讨论，能提高学生的思辨能力，让学生感悟科学探究精神和构建生命观念。教学设计
课程基本信息
学科 高中生物学 年级 高二 学期 秋季
课题 蛋白质的电泳
教学目标
熟悉SDS-PAGE凝胶电泳的原理和操作流程。 熟悉细菌总蛋白质的提取和定量。
教学内容
教学重点： 1. SDS-PAGE凝胶电泳的原理。
2. SDS-PAGE凝胶电泳的操作流程。
教学难点： 1. 细菌总蛋白的提取与定量。
2. 比较琼脂糖核酸凝胶电泳与蛋白质凝胶电泳的异同点。
教学过程
教学流程教学具体实施过程设计意图一、教学实施背景一、背景 大肠杆菌DH5ɑ菌株的β-actin基因表达的蛋白质非常稳定且高表达，利用SDS-PAGE凝胶电泳很容易检测出来，成功率高。 问题情境 1.SDS-PAGE凝胶电泳的实验原理是什么？ 2.为什么分离蛋白质常用SDS-PAGE凝胶电泳而常不用琼脂糖凝胶？稳定高表达的蛋白质学生更容易检测； 熟知实验原理是实验的前提也是实验结果分析的依据；让学生区分分离蛋白质与分离核酸的不同二、教学具体流程先将本节知识点涉及的教学难点——实验部分，进行视频同步讲解，结合视频突破教学难点，具体内容如下： 一、材料及试剂： 大肠杆菌DH5ɑ菌株、细胞裂解液、PBST缓冲液、0.5M Tris-HCl(pH6.8)、3M Tris-HCl(pH8.8)、 10%SDS、10%APS、 TEMED等 实验用具： 垂直板电泳槽及配套的玻璃板、封胶条、梳子、恒压恒流电泳仪、脱色摇床、全自动发光成像仪、微量移液器、离心机、PVDF膜等 二、原理： SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合，把大多数蛋白质拆成亚单位，并带上阴离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异，所以 SDS-PAGE消除了电荷效应，只有分子筛效应，故蛋白质电泳迁移率主要取决于相对分子质量，迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系，在电场下，按相对分子质量大小在凝胶上排列。 三、具体步骤： （一）样品制备 1.测定大肠杆菌DH5ɑ菌液的OD600值（用水作为对照），当OD值达到0.6-0.8左右时，收集细胞至1.5ml离心管，1200 rpm旋转离心5min； 2.弃上清，每管加入1ml预冷的1xPBS磷酸缓冲液，充分混匀，4℃ 1200 rpm离心5min； 3.加入300ul（需要根据细胞量的多少）细胞裂解液（RIPA+PI），漩涡震荡混匀，冰上裂解30min； 4.4℃，12000 rpm，离心10min，小心吸取上清液到新的1.5ml的EP离心管中； 5.根据BCA蛋白浓度测定试剂盒测定所提取的总蛋白浓度； 6.取部分体积的蛋白液中加入与其体积相同的2×SDS蛋白上样缓冲液（含5%的巯基乙醇），混合均匀，100℃水浴10min，立即冰浴5min； 7.瞬时离心收集，于-20℃保存备用。 （二）蛋白浓度测定 1.根据所检测样品数量，按BCA试剂A与试剂B体积比50:1配置BCA工作液，确保充分混匀； 2.完全稀释蛋白质标准品(5mg/ml BSA)：取10ul蛋白质标准品，用1xPBS稀释至100ul，使其终浓度为0.5mg/ml； 3.将0.5mg/ml的标准品按0，1，2，4，8，12，16，20ul体积加到96孔板的标准品孔中，然后加入1xPBS补齐至每孔20ul； 4.分别在96孔板的待测样品孔中加入1ul待测蛋白样品，再加入19ul的1xPBS补齐至20ul； 5.在各孔中加入200ul BCA工作液，37℃静置30min； 6.测定A595nm光吸收值，以OD值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标，制作蛋白标准曲线； 7.根据标准曲线，计算待测样品的蛋白质含量。 （三）SDS-PAGE（蛋白质凝胶电泳） 制胶：1.检查好制胶装置的密封性后，配制15% SDS-聚丙烯酰胺分离胶（总体积10ml）：依次向小烧杯中加入3.71ml双蒸水、5ml 30%聚丙烯酰胺、1.3ml 3M Tris-HCl(pH8.8)、100ul 10%SDS、120ul 10%APS、12ul TEMED，用5ml的移液枪立刻混匀（但不要产生气泡），然后用移液枪迅速灌胶至指定界面，加入双蒸水进行液封； 2.接着配制5%SDS-聚丙烯酰胺浓缩胶（总体积6ml）：依次加入3.4ml双蒸水、1ml 30%聚丙烯酰胺、1.5ml 0.5M Tris-HCl(pH6.8)、60ul 10%SD放到4℃冰箱保存； 3.30~60min后，当分离胶与双蒸水的交界处出现一条明显可见的分界线时，倒掉双蒸水，并且用吸水纸吸干，将步骤2配制的浓缩胶中依次加入80ul TEMED 和8ul 10%AP，立即混匀后，加到分离胶上并且快速插上梳子； 4.45min后，取出凝胶板置于蛋白电泳槽中，加入1x蛋白电泳缓冲液； 加样：轻轻将梳子拔出，用注射器吹打每个孔，以便去除碎胶，然后每孔加入20ug蛋白样品以及蛋白Marker； 电泳：先60V恒压电泳至分离胶界面，然后电压调至80V，当溴酚蓝距离胶底1-2cm时，关闭电源。 转膜：1.按照检测样品的数量剪取1张合适大小的PVDF膜和2张滤纸，大小均要大于电泳凝胶，并且在PVDF膜的左下角处做好标记； 2.将PVDF膜放入甲醇中浸泡大约1min，然后浸泡于转移缓冲液中，同时将滤纸也浸泡于转移缓冲液中大约5min； 3.打开转膜仪的盖子，从转膜仪的正极到负极依次叠放滤纸、PVDF膜、蛋白凝胶和滤纸，叠放的过程中需要用玻璃棒轻轻的赶走气泡； 4.恒压10V，转膜120min； 抗体孵育：1.PVDF膜封闭：转膜结束后，取出转印膜，用ddH20洗3次，将PVDF膜浸泡于含5%脱脂奶粉的封闭液中，4℃封闭12-16小时； 2.将膜取出，用PBST缓冲液洗涤1次；将PVDF膜放在抗体孵育盒中，向膜上滴加足量的抗体（以免抗体挥发影响实验结果），4℃孵育12-16小时； 3.孵育结束后，从抗体孵育盒中取出PVDF膜，在水平脱色摇床上用PBST缓冲液洗涤3次，每次间隔大约10min； 4.按照一抗孵育的方法孵育二抗，33℃孵育2小时； 5.如步骤3； 曝光：准备好适量的ECL发光剂，将洗好后的膜平铺到全自动发光成像仪上，在膜上均匀滴加发光剂，进行检测 三、疑难问题解析注意事项与难点突破： 1.样品上样量不能太多 2.电泳的电压和时间需要控制合理； 疑难问题： 1.琼脂糖核酸凝胶电泳与蛋白质凝胶电泳的异同点？ 2.蛋白质凝胶电泳有哪些应用？ 1.让学生理解实验的正确操作是实验能否成功的必要条件，在熟知实验原理的基础上，要注意实验操作的细节； 2.正确区分两种凝胶电泳的异同点有利于帮助学生更好的理解分离核酸与分离蛋白质的区别；教学设计
课程基本信息
学科 高中生物学 年级 高二 学期 秋季
课题 农杆菌转化法
教学目标
1. 理解农杆菌转化法的基本实验原理和实验操作的基本流程。 2. 掌握常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学内容
教学重点： 1. 农杆菌转化法操作流程。
2. 常见实验器材的使用方法和使用规范。
教学难点： 1. 农杆菌转化法的实验原理。
2. 农杆菌转化法中的具体筛选方法。
教学过程
以植物冠瘿病为情境，通过视频进行直观化教学，并辅以探究性问题，阐明农杆菌转化法的基本操作程序。 教学流程教学具体实施过程设计意图一、导入农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，通过其Ti质粒上T-DNA 编码的酶合成植物激素生长素和细胞分裂素，使植物细胞能够过度生长，从而形成通常由根癌农杆菌感染引起的冠瘿瘤。通过创设实验情境，以问题探究的形式进行转基因大肠杆菌培养的相关教学二、实验突破先将本节知识点涉及的教学难点——实验部分，进行视频同步讲解，结合视频突破教学难点，具体内容如下： 一、Ti质粒介绍 原始Ti质粒大体可分为两个区域：T-DNA区段：有支配肿瘤化及维持肿瘤状态和产生冠瘿碱的基因。 T－DNA以外的区域：存在着对质粒的传递性、冠瘿碱的透过和分解等（在细菌中表达的性状）的基因。 提出问题：①如何利用Ti质粒实现转基因？ ②使用原始Ti质粒进行转基因是否可行？有何种问题存在？ 目前多使用人工改造的质粒，其上含有经改造的T-DNA区段，当其被转化进农杆菌体内后，可通过同源重组的方式将其本身的T-DNA区段替换到原始Ti质粒上。 二、浸花法转化拟南芥 视频展示并同步讲解 1.1重组质粒导入农杆菌 1.2浸花法转化拟南芥 （1）选取植株健壮，生长约5周的拟南芥植株 （2）准备农杆菌液。通常先用1 ml 含抗生素的LB培养基培养已经转化了目的表达载体的农杆菌液，然后再吸取150 μl培养过夜的菌液加入到150 ml 新鲜的液体LB培养基中28 °C环境下震荡培养24 h。 （3）4,000 x g，20 min离心菌液，然后将菌重悬于120 ml渗透液 (10%蔗糖 + 400 μl/L Silwet-77，蘸花前充分混匀，OD600=0.8-1.0) 中。与此同时，剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花。 （4）将植株的地上部分浸入菌液中1 min，轻微震荡。 （5）用保鲜膜将侵染过的植株罩起来以保持湿度，暗培养1 d，然后置于正常培养条件，2~3 d后可去掉保鲜膜，转化后1周左右方可浇水，并定期继续侵染几次。 （6）继续培养至植物成熟，收种子放在干燥环境中1周左右，即可筛选转化子。 Ti质粒的特点是这一节微课中的重难点，同时也是考试中的易考点、易错点。平时上课过程中对该内容并不会深入讲解，在本节微课中，低于Ti质粒的整体结构，做出了明确的讲解，并以问题为索，引导学生理解思考如何通过Ti质粒实现转基因；此后通过视频的形式，展现农杆菌转化植物的基本过程，促进学生理解农杆菌转化法这一常见的植物转基因手段。三、拓展延伸1.为什么不使用天然的Ti质粒？ ①含有导致植物患冠瘿病的基因②没有方便目的基因插入的集中的酶切位点③缺少标记基因 2.练苗时的环境变化 ①成功率高，效果好②机理研究清楚，方法成熟，应用广泛③遗传稳定性好④操作比较容易，需要的仪器设备简单，易于推广选取的两个问题为本节微课的难点，同时也是学生难以理解的易错考点，通过问题的形式进行再次辨析，让学生能切实解决重难点。
