生物人教版（2019）选择性必修3 1.2微生物的培养技术及应用（共80张ppt1个视频）

(共80张PPT)
1.2 微生物的培养技术及应用
第1章发酵工程
天然菌种
菌种差异
杂菌情况不明
发酵过程的控制缺乏标准等
发酵食品的品质不一
为了缩短发酵时间，确保品质稳定，工业上大规模生产时，通常会先通过微生物培养技术获得单一菌种，再将它们接种到物料中进行发酵。
天然菌种
菌种差异
杂菌情况不明
发酵过程的控制缺乏标准等
发酵食品的品质不一
一
培养基的配制
培养基:
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
什么是微生物？
对营养物质有什么不同需求？
营养基质的具体成分有哪些？
…….
一
培养基的配制
微生物：
难以用肉眼观察的微小生物的统称。
概念：
类型：
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
病毒：
SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；
噬菌体等DNA病毒
原生生物：
草履虫、变形虫等
真菌：
酵母菌、毛霉等；
放线菌：
链霉菌等
细菌：
大肠杆菌、乳酸菌等；
微生物的基本培养技术
菌 落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
单菌落：
一般是单个微生物繁殖形成的纯培养物。
A：支原体的菌落
B：酵母菌的菌落
C：细菌的菌落
D：细菌和霉菌混杂的菌落
E：放线菌的菌落
F：霉菌的菌落
微生物的基本培养技术
微生物的类群
是难以用肉眼观察的微小生物的统称，
包括细菌、真菌、病毒和一些原生生物等。
本章提及的微生物主要是用于发酵的细菌和真菌。
菌 落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
单菌落：一般是单个微生物繁殖形成的纯培养物。
微生物的基本培养技术
一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。
这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。菌落特征是鉴定菌种的重要依据。
形态
突起
(侧面观)
边缘
(部分)
标点状
圆形
丝状
不规则状
假根状
纺锤状
扁平
隆起
凸透镜状
垫状
脐突状
完整
波状
裂片状
啮蚀状
丝状
卷曲状
思考1:肺炎双球菌的S型菌和R型菌的菌落特征有什么区别？
思考2:有鞭毛的细菌和无鞭毛的细菌其菌落边缘有何不同？
微生物的纯培养
无菌技术
培养基的配制
一方面要为人们需要的微生物提供 ；另一方面要确保 ，并将需要的 。
实验室培养微生物有什么要求呢？
合适的营养和环境条件
其他微生物无法混入
微生物分离出来
任务1：请同学们自主阅读教材P9-11，完成以下问题：
一、培养基的配制
（一）培养基的配制：
1.培养基的概念？作用？
2.培养基的类型？实验室最常用的培养基？
3.培养基的营养构成？如何满足不同微生物的特殊需求？
（P9）
给微生物提供碳元素的物质
自养生物：CO2
异养生物：含碳的有机物
给微生物提供氮元素的物质
固氮微生物：空气中的N2
非固氮微生物：NH4+ 、 NO3- 、尿素、含N有机物
水
无机盐
碳源：
氮源：
1、培养基的营养构成:
（1）基本成分：
碳源、氮源、水、无机盐
微生物的基本培养技术
(2)还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及对氧气的要求。
（如维生素、氨基酸和碱基等）
例，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加______，培养霉菌时需将培养基的pH调至____性，
培养细菌时需将pH调至_____________，培养厌氧微生物时则需要提供_______的条件。
维生素
酸
中性或微碱性
无氧
水是微生物生长和代谢必不可少的营养物质。
是细胞的组成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂等
应用最广泛普通的细菌基础培养基
1.根据培养基的物理性质，该培养基属于哪类培养基？
2.为什么培养基需要氮源 （P10旁栏思考）
3.培养任何微生物，是否必须有有机碳源和有机氮源？
培养基的营养构成
组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 、 磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 和维生素等
琼脂 20g ；
NaCl 5g ；
H2O 定容至1000ml 。
表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成
是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
固体培养基
例：自养型微生物可利用无机碳源（如空气中的CO2）；
固氮微生物可利用无机氮源（如空气中的N2）。
不一定
碳源、氮源、水、无机盐
碳源、氮源
碳源、氮源
凝固剂
无机盐
水
1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成 组分 含量 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、氮源、磷酸盐和维生素等
蛋白胨 10g 碳源、氮源和维生素等
NaCl 5g 无机盐
水 定容至1000mL 水
一
培养基的配制
1、培养基概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2、培养基作用：
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
一
培养基的配制
3.培养基分类：
①物理状态
液体培养基
半固体培养基
固体培养基
实验室常用的培养基凝固剂为琼脂，这是一种从海藻中提取的多糖类物质，一般不能被微生物所利用。
没有添加凝固剂的培养基
常用于大规模快速繁殖某种微生物。
半固体培养基加入琼脂量量为0.3%～0.7%
固体培养基加入琼脂量量为1.5%～2.0%
半固体培养基可用于观察微生物的运动和分类鉴定等
固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等。
一
培养基的配制
3.培养基分类：
②成分来源
天然培养基
合成体培养基
天然培养基含有蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉等化学组成不确定的成分，如培养常见细菌的牛肉膏蛋白胨培养基。
合成培养基是由化学成分完全确定的物质配制而成的培养基。
一
培养基的配制
3.培养基分类：
③基本用途
选择培养基
鉴别培养基
选择培养基有利于目的微生物生长，使其成为优势菌，从而抑制杂菌生长，如仅以纤维素为碳源的培养基可用来筛选土壤中产纤维素分解酶的微生物。
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学试剂配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。如大肠杆菌在伊红美蓝培养基上的菌落呈现金属光泽的紫黑色。
通用培养基
通用培养基营养物质齐全，可以满足多种微生物的营养需求。
一
培养基的配制
选择培养基
①基础培养基+抗生素→分离酵母菌等真菌
②基础培养基+高浓度盐水→选择培养金黄色葡萄球菌
③无碳源培养基→选择培养自养微生物
④无氮源培养基→选择培养固氮微生物
⑤以尿素为唯一氮源→选择培养分解尿素的细菌
一
培养基的配制
大肠杆菌的代谢产物（有机酸）能与伊红美蓝结合，从而形成深紫色、并带有金属光泽的菌落。
伊红美蓝培养基
鉴别培养基：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学试剂配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。
一
培养基的配制
鉴别培养基：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学试剂配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。
刚果红 + 纤维素 → 红色复合物
纤维素分解菌周围出现透明圈
纤维素分解菌 → 纤维素酶 → 纤维二糖 + 葡萄糖（不能与刚果红形成红色复合物）
培养基的配制
配制培养基的基本原则
1.营养物质应满足微生物的需要
根据菌种的不同需求配制培养基。
2.营养物质的浓度及配比应恰当
营养物质浓度太低，不能满足微生物生长的需要；
营养物质浓度太高，会抑制微生物的生长；
还应考虑避免培养基中各成分之间的相互作用。
3.物理、化学条件适宜
最适pH:细菌7.0~8.0，放线菌7.5~8.5，酵母菌3.8~6.0，霉菌4.0~5.8。
4.考虑培养目的
培养菌体/积累菌体代谢物；实验室培养/大规模发酵。
微生物接种操作时为什么要“全副武装”和在专门的设备内进行？
确保无杂菌污染
目录
CONTENTS
无菌技术
2/
培养基的配制
1/
微生物的纯培养
3/
二
无菌技术
1.消毒：
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括
消毒和灭菌。
是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
2.灭菌：
是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
二
无菌技术
2.灭菌：
是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
芽孢
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。
芽孢壁很厚，含水量低，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子
细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
二
无菌技术
1.消毒：
是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
2.灭菌：
是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒
将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
活动：阅读教材P11，说出消毒和灭菌的主要方法。
二
无菌技术
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物
强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种环、接种针、涂布器、试管口、瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基、无菌水
高压蒸汽灭菌锅内,
100 kPa,温度121 ℃
接种室、接种箱，超净工作台
二
无菌技术
1.消毒：
是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
①物理方法：
煮沸消毒：
在100 ℃煮沸5 6 min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
巴氏消毒：
对于一些不耐高温的液体，如牛奶，则可使用巴氏消毒法，即在62 65 ℃消毒30 min或80 90 ℃处理30 s 1 min，可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分。（啤酒啤酒、人乳及婴儿合成食物等）
紫外线消毒：
接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，以杀死物体表面或空气中的微生物。
二
无菌技术
1.消毒：
①物理方法：
②化学方法：
如采用碘酒、体积分数为70%的酒精、双氧水等化学药剂，对实验室的空间、操作台表面、实验人员的工作服与手等进行消毒。
③生物方法：
生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。例如，有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
二
无菌技术
2.灭菌：
是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
①湿热灭菌：
利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。
高压蒸汽灭菌：
（效果最好）
实验室常用高压蒸汽灭菌锅，在压力100kPa、温度121 ℃条件下，维持15-30min
原理：
对象：
优点：
高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性
操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。
培养基等
高压蒸汽灭菌法（排气-升压-保压-降压）
二
无菌技术
2.灭菌：
①湿热灭菌：
②干热灭菌：
干热灭菌箱内，在160-170 ℃的热空气中维持下2-3h达到灭菌目的
原理：
使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等
对象：
耐高温，需保持干燥的物品
玻璃器皿 （如试管、培养皿、吸管、注射器）
金属器具 （如针头、 镊子、剪刀等）
干热灭菌箱
在干热状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强,必须长时间受高温的作用才能达到灭菌的目的。因此，干热空气灭菌法采用的温度一般比湿热灭菌法_____。
高
二
无菌技术
2.灭菌：
①湿热灭菌：
②干热灭菌：
③灼烧灭菌：
将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见下图）。
二
无菌技术
2.灭菌：
①湿热灭菌：
②干热灭菌：
③灼烧灭菌：
将微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（见下图）。
此外，在接种过程中，试管口、瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。
二
无菌技术
做好消毒和灭菌工作后，要注意避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。为了避免周围环境中微生物的污染，接下来的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
课堂检测
无菌技术
思考1:培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？
分析：干热灭菌箱内的高温会导致培养基的_________丧失，而高压蒸汽锅内的_________较大，不会导致培养基的_________散失 。
思考2:如何制备一瓶无菌水？
分析：对一瓶有菌水进行___________________处理。
思考3:某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是？
分析：_____________________。
思考4:某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥形瓶的瓶壁，最可能的原因是？
分析：___________________________________________，就提前打开了高压蒸汽锅。
思考5：用紫外线可以给接种室消毒，其原理是紫外线能___________________。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等_________，可以加强消毒效果。
水分
湿度
水分
高压蒸汽灭菌
未将锅内冷空气排尽
高压蒸汽锅的压力表读数还未降至零
损伤细菌的DNA
消毒液
三
微生物的纯培养
接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物群体称为培养物；
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物；
获得纯培养物的过程就是纯培养。
相关概念：
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
方法步骤:
01
02
03
04
配制培养基
灭菌
倒平板
接种和分离
培养
05
酵母菌的纯培养
实验原理：
菌落：
分散的微生物(单一个体)在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
特征:
具有一定的形状、大小、光泽度、颜色、透明度等（鉴定菌种的重要依据）。
纯培养方法:
平板划线法和稀释涂布平板法。
采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的纯培养物。
平板划线法
稀释涂布平板法
方法步骤：
1.制备培养基
称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
配制培养基：
三
微生物的纯培养
灭菌:
将配制好的培养基转移到锥形瓶 中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度121℃的条件下，灭菌15-30min。
将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。
三
微生物的纯培养
三
微生物的纯培养
方法步骤：
倒平板
待培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。具体操作步骤如下。
1.拔出锥形瓶的棉塞。
2.将瓶口迅速通过火焰。
3.用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10 20 mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。
4.等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高；将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
不要完全打开，以免杂菌污染培养基
1.制备培养基
三
微生物的纯培养
1.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
最好不要用这个平板培养微生物。
防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
2.怎么确定所倒平板未被杂菌污染或灭菌彻底？
思考：
2、接种和分离酵母菌
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
方法步骤
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
平板划线法
稀释涂布平板法
2.接种和分离酵母菌
通过 在固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种逐步 到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
接种环
连续划线
稀释分散
微生物群
分散或稀释
单个细菌
单个菌落
连续划线
生长繁殖
平板划线法：
三
微生物的纯培养
平板划线法：
灼烧接种环
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红。
冷却
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 。
③试管口通过火焰。
蘸取菌液
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞。
【思考1】实验前灼烧接种环的目的是什么？
杀死接种环上原有微生物。避免接种环上可能存在的微生物污染。
【思考2】在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再蘸取一环菌液？
避免接种环温度太高，杀死菌种。
平板划线法：
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞。
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
灼烧接种环
冷却
蘸取菌液
第1区划线
灼烧接种环
冷却
第2区划线
灼烧接种环
冷却
1
2
3
4
5
平板划线法：
灼烧接种环
冷却
蘸取菌液
第1区划线
灼烧接种环
冷却
第2区划线
灼烧接种环
冷却
1
2
3
4
5
划线后，线条末端酵母菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个酵母菌繁殖而来的菌落。
【思考3】在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞。
【思考4】为什么每次划线之前都要灼烧接种环？
平板划线法：
灼烧接种环
冷却
蘸取菌液
第1区划线
灼烧接种环
冷却
第2区划线
灼烧接种环
冷却
1
2
3
4
5
【思考5】在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
需要。杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
不能。最后一次划线通常已经将微生物稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了微生物的数目，得不到纯化的效果。
【思考6】最后一次划线与第一次划线能否相连？为什么？
注意：划线时不能划破培养基表面，否则会影响培养、分离的效果，难以达到分离单菌落的目的。
2、接种和分离酵母菌
稀释涂布平板法:将菌液进行一系列梯度稀释,然后将不同的稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基表面,进行培养。
方法步骤
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
2、接种和分离酵母菌
稀释涂布平板法:将菌液进行一系列梯度稀释,然后将不同的稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基表面,进行培养。
方法步骤
配制培养基→（调pH →分装） →灭菌→倒平板→接种和分离→培养
微生物的基本培养技术
酵母菌的纯培养
探究-实践
课堂检测
接种和分离
平板划线
连续划线
稀释分散
灼烧
冷却
末端
一
划破
稀释涂布平板
梯度稀释
稀释度
涂布
灭菌
酒精灯火焰旁
70%酒精
冷却
分布均匀
3.培养酵母菌
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱中培养24-28h。
【思考6】为什么还需要将一个未接种的平板倒置一起培养？
未接种的平板作为对照组。可用来确定培养基灭菌是否彻底。
三
微生物的纯培养
平板 菌落生长情况 菌落数 形态 颜色 大小
接种
未接种
设计观察记录表，记录培养结果
布置作业
四
结果分析与评价：
1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
在未接种的培养基表面应该没有菌落生长。如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
3.你是如何记录实验结果的？
可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等。
2.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
如果观察到单菌落，培养基上生长的菌落颜色、形状、大小等基本一致，说明接种成功。若培养基出现了其他菌落，说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，可能是菌种不纯、培养基灭菌不彻底或实验过程中被杂菌污染。
三
微生物的纯培养
酵母菌的纯培养
2.接种和分离酵母菌
课堂小结
1.制备培养基
3.培养酵母菌
①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水）
②灭菌
③倒平板（在酒精灯火焰附近操作）
培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅）
培养皿：干热灭菌（干热灭菌箱）
用接种环在固体培养基上用平板划线法接种
平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
评估论点的可信程度
思维训练
水果“酵素”是什么？
其制作原理是什么？
其中可能含有哪些成分？
其是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？
其中的所有成分都有益于人体健康吗？
“酵素”就是“酶”的另一种说法。
其制作是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。
其中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分。
不存在它独有的、特殊的营养物质。
其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。
二 、微生物的选择培养和计数
1.2 微生物的培养技术及应用
微生物的选择培养和计数
课题背景
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。
稀释涂布平板法呈现的杂菌群
那么我们又如何达成这一目标呢？
科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。
微生物的选择培养和计数
美国黄石国家公园的一个热泉
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。
为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？
②原理:实验室微生物的筛选时，可人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。
因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
①在寻找目的菌株时,要根据它相对应的生存环境的要求,到相应的环境中去寻找.
筛选菌株的思路：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。
①基础培养基+青霉素→分离酵母菌等真菌
②基础培养基+高浓度食盐→分离金黄色葡萄球菌
③无碳源培养基→分离自养微生物
④无氮源培养基→分离固氮微生物
⑤以尿素为唯一氮源→分离分解尿素的细菌
⑥以石油为唯一碳源→分离能消除石油污染
微生物的选择培养和计数
选择培养基:
将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
微生物的选择培养和计数
思考:那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
思考-讨论
选择培养基配方的设计
尿素的立体结构
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。
讨论：
1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？
2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。
培养基只是添加尿素作唯一氮源，其他营养成分基本相同。
微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
稀释涂布平板法:将菌液进行一系列梯度稀释,然后将不同的稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基表面,进行培养。
1、概念：
2、用途：
a.用于微生物的纯培养;b.用于选择筛选微生物;
c.用于统计样品中活菌的数目.
当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品中的一个活菌;通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约有多少活菌.
3、原理：
微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
4ⅹ107
4ⅹ105
4ⅹ104
4ⅹ103
4ⅹ107
（2）计算公式：
___g土中的菌株数 =（C÷V）× M
C：代表______________________
V：代表_____________ M______________
1
某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
涂布平板时所用的稀释液体积
稀释倍数
思考:甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
（80+90+100）/3
0.1
× 105 =9 ×107个
微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定
稀释涂布平板法
注意事项
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。
②为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。
(目的:减少偶然误差)
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
(原因:当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落.)
④分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作
有误，需重新实验。
微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定
显微镜直接计数：
这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量
每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
缺点：
不能区分死菌与活菌
不适于对运动细菌的计数
微生物的选择培养和计数
微生物的数量测定
细菌计数板
菌落数
微生物的选择培养和计数
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
稀释涂布平板法
2）土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
1）制备培养基：
制备以尿素为唯一氮源的选择培养基
3）样品梯度稀释：
在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。
分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。
取6支试管，分别加入9ml无菌水。
各梯度分别涂布3个平板
1个不涂布作空白对照
4）接种:取样涂布平板
放入37℃恒温箱中培养1～2d
5）培养与观察
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
微生物的选择培养和计数
稀释涂布平板法
实验的具体操作：
中性
潮湿
唯一氮源
104、105和106
放线菌
102、103和104
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
微生物的选择培养和计数
稀释涂布平板法
实验的具体操作：
时间
温度
菌落数目稳定
培养时间不足
平均值
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
微生物的选择培养和计数
操作提示：
1、无菌操作：
①取土样的用具在使用前都需要灭菌。②应在__________________旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在酒精灯火焰旁操作。
2、做好标记：
本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好_________。
①培养皿的标记：注明__________、______________以及平板上培养样品的_____________等。
②试管的标记：将已经进行过稀释操作的试管，按稀释度递增的顺序，依次放在试管架的另一行。
3、制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。
酒精灯的火焰
标记
培养基种类
培养日期
稀释度
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
微生物的选择培养和计数
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
在以尿素为唯一氮源的培养基中，只有能分解尿素的细菌才能利用尿素这种氮源来生长繁殖，并长出菌落。尿素分解菌产生的脲酶能将尿素分解成CO2和NH3，NH3溶于水会电离出NH4+和OH-，使培养基的pH升高。
在该培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果菌落周围变红，说明该细菌能够分解尿素。
实验结果：
微生物的选择培养和计数
土壤中分解尿素中的细菌的分离与计数
实验结果分析与评价：
无菌落生长
有菌落生长
大于
30-300
微生物的数量测定
选择培养基的作用
微生物选择培养获取纯培养物的方法-稀释涂布平板法
微
生
物
的
选
择
培
养
和
计
数
选择培养基
微生物的选择培养
科学实例
筛选原则
选择培养基的概念及举例
稀释涂布平板法的操作过程
间接计数法 — 稀释涂布平板法
直接计数 —计数板计数法
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
培养基的制备
实验设计
（1）土壤取样
（2）样品的稀释
（3）稀释涂布平板法接种
（4）微生物的培养与观察
实验设计
小结
练习与应用
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌，判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油，修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
2. 用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
√
√
D
练习与应用
3.回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时,培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是　　　　(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。硝化细菌在没有碳源的培养基上　　　　(填“能够”或“不能”)生长,原因是________________________________________。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板　　　　(填“倒置”或“正置”)。
(3)单个细菌在平板上会形成菌落,研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物,原因是　　　　　　　　　　　　　　。
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过　　　处理,这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
蛋白胨
不同细菌生长繁殖所需的pH不同
能够
硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
倒置
在一定的培养条件下,不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
灭菌
练习与应用
4. 地球上的植物每年产生的纤维素超过70 亿吨，其中40%～ 60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈（如下图所示）。请回答下列问题。
（2）有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
可行，这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
（1）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
微生物的选择培养和计数
到社会中去
1、空气中微生物总数的检测？
2、水中细菌总数的检测？
3、牛奶中细菌的分离与计数？
4、土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数？