3.2基因工程的基本操作程序（共90张ppt）课件生物人教版（2019）选择性必修3
文档属性
| 名称 | 3.2基因工程的基本操作程序（共90张ppt）课件生物人教版（2019）选择性必修3 |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 41.6MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-05-06 22:32:18 | ||
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文档简介
(共90张PPT)
第3章
第2节、基因工程的基本操作程序
（含DNA片段的扩增及电泳鉴定）
基因
表达载体
本节聚焦:
1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
从社会中来
课本P76、76
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(Bt 抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫(P76)
①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？
②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
P77 [相关信息]
你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
导入
抗虫基因
（Bt抗虫蛋白基因）
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
实例：
具体的步骤是？
(含抗虫基因）
（含有并表达抗虫基因）
1、目的基因的筛选与获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
核心
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
基因工程的基本操作程序
01
第一步：目的基因的筛选与获取
获取目的基因时获取的是哪一部分的DNA片段？在解决这个问题之前，我们得先了解基因的结构是怎样的？
1.目的基因
(1)概念：
在基因工程的设计和操作中，用于 或
等的基因。
(3)实例：
与 等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要指的是 。
改变受体细胞性状
获得预期表达产物
(2)作用：
编码蛋白质的基因
生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因--Bt抗虫蛋白基因
1
一、目的基因的筛选与获取
一
第一步：目的基因的筛选与获取
注意： 所有的基因都编码蛋白质或肽链。
基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。
结构基因的功能：
具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。
转录基因的功能：
只有转录功能，没有翻译功能，能转录形成tRNA和rRNA。
调控基因的功能：
不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。
知识拓展：基因
不是
基因1 基因2 基因3
知识拓展：基因的结构
DNA片段
放大
基因通常是有遗传效应的DNA片段；
能编码特定的蛋白质
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
启动子
1. 编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。
2. 非编码区 ：
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
含有能调控遗传信息表达的DNA序列。
不转录，不编码蛋白质；
知识拓展：基因的结构
终止子
获取目的基因一般获取哪一部分的DNA片段？
基因编码区
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
终止子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
也是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
本质：
位置：
作用：
原核细胞的基因结构
知识拓展：基因的结构
启动子
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列，然后在翻译前就被剪切掉。
知识拓展：基因的结构
非编码区
非编码区
编码区
转录
剪接
外显子
内含子
前体mRNA
成熟mRNA
真核生物基因的表达
知识拓展：基因的结构
真核生物的DNA转录形成的mRNA需要在细胞核加工处理成为成熟的mRNA后才能作为下一步翻译的模板。
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
某原核细胞基因
非编码区
非编码区
编码区
不编码mRNA
不编码mRNA
(编码mRNA)
启动子
终止子
RNA聚合酶
原核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
某原核细胞基因
原核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
原核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
某真核细胞基因
非编码区
非编码区
编码区
不编码mRNA
不编码mRNA
(编码mRNA)
启动子
终止子
RNA聚合酶
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
真核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
初始mRNA
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
真核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
初始mRNA
成熟mRNA
真核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不能编码蛋白质的序列
= 非编码区
原核生物的基因：
不能编码蛋白质的序列
真核生物的基因：
= 非编码区+内含子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
知识拓展：基因的结构
目的基因的筛选和获取的方法是怎样的？
2.筛选合适的目的基因
1
一、目的基因的筛选与获取
1.较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
2.认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
3.实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解。
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
不仅掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
1
3.目的基因的获取方法
1
一、目的基因的筛选与获取
获取目的基因的方法：
①利用PCR获取和扩增目的基因
②从基因文库中获取
③人工合成
前提：
方法：
DNA合成仪
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
（常用）
重点了解什么是PCR？
人工合成目的基因
1.化学方法人工合成：
(1)需要仪器：DNA合成仪。
(2)适用目的基因类型：基因比较小，核苷酸序列又已知。
(3)不需要模板。
DNA合成仪
蛋白质的氨基酸顺序
mRAN
核苷酸序列
基因DNA的核苷酸序列
目的
基因
推测
推测
化学合成
比如：引物
2.反转录法：
基因的相对分子质量大而又不知其序列。
目的基因的mRNA
杂交双链
(RNA-DNA)
单链DNA
双链DNA
(目的基因)
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
构建基因文库来获取目的基因
1.基因文库概念：
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
2.基因文库类型：
基因组文库：含有一种生物的全部基因。
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。
基因组文库与部分基因文库的关系？
构建基因文库来获取目的基因
3.基因文库的构建：
将DNA片段与载体连接
导入受体菌中储存
(1)基因组文库的构建
提取某种生物的全部DNA
多个一定大小的DNA片段
基因表达载体
用适当的限制酶切割
基因组文库
构建基因文库来获取目的基因
3.基因文库的构建：
(2)部分基因文库（如cDNA文库）构建
提取某种生物某器官或特定发育时期的mRNA
单链互补DNA
双链DNA片段
基因表达载体
与载体连接
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
mRNA
逆转录酶
核酸酶H
RNA-DNA杂交双链
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
与载体连接
导入受体菌中储存
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
基因组文库和部分基因文库的比较
PCR是 的缩写。它是一项根据＿＿＿＿＿的原理，在 提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对 的技术。
利用PCR获取和扩增目的基因
1.PCR的概念：
中文全称
原理
操作环境
目的
PCR扩增仪
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
目的基因的核苷酸序列进行大量复制
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
离心管
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
3'
5'
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
ATP
解旋酶
（1）解旋
目的基因的筛选与获取
回顾：体内DNA复制
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
（2）合成子链
回顾：体内DNA复制
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
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A
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A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
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G
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C
G
A
G
C
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T
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
DNA聚合酶
5'
3'
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
ATP
ATP
DNA聚合酶作用下形成磷酸二酯键
子链延伸合成的方向？
只能从5′－端→3′－端延伸，细胞内有RNA引物结合到模板3′－端引发子链的延伸
回顾：体内DNA复制
（2）合成子链
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
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A
G
C
C
G
T
A
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C
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C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
3'
5'
T
T
A
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5'
3'
（3）重新螺旋形成新的DNA分子
回顾：体内DNA复制
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
什么是引物？
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
引物可以是DNA单链，
也可以为RNA单链，
细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物
细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物
用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
引物结合在模板链的3’端
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链。
子链合成需要引物？
利用PCR获取和扩增目的基因
2.DNA体外复制（PCR）的条件：
体内DNA复制 参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中
参与的组分
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
无需解旋酶，用高温(90℃以上)代替
DNA模板(含目的基因的DNA 片段)
4种脱氧核苷酸(dNTP)
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（变性）
提供相对稳定的pH环境；一般添加Mg2+，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量，无需添加ATP。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
2种引物(常为小的单链DNA，通常为20-30个核苷酸)
利用PCR获取和扩增目的基因
3.PCR的过程：
当温度超过_____以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
待扩增的DNA片段
(1)变性：
变性
90℃
变性 复性 延伸
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
不需要解旋酶
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
利用PCR获取和扩增目的基因
3.PCR的过程：
当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。
3’
5’
3’
5’
碱基互补配对
引物1
5’
3’
引物2
5’
3’
(2)复性：
50℃
两
由于DNA双链是反向平行的，所以需要两种引物
变性 复性 延伸
思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？
①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。
②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
当温度上升到____左右时，溶液中的4种_________在耐高温的_____
__________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
72℃
利用PCR获取和扩增目的基因
3.PCR的过程：
(3)延伸：
(Taq酶)
3’
5’
3’
5’
引物1
5’
3’
引物2
5’
3’
Taq酶
3’
Taq酶
3’
变性 复性 延伸
思考1：为什么温度要上升至72℃？
思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮循环的产物
利用PCR获取和扩增目的基因
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
4.PCR的结果：
5.PCR产物的鉴定：
循环n次，理论上可获得DNA 数 ，
其中含引物的DNA数 ，
含引物的DNA链数 ，
共需引物数 。
2n
2n
2n+1-2
2n+1-2
利用PCR获取和扩增目的基因
下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题：
(1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？
不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
(2)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
练习：图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
（1）图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
（2）图2是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由。
第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生 而失效。
第2组：引物Ⅰ′ 后会出现局部 而失效。
3
碱基互补配对
自身折叠
碱基互补配对
每种引物内部不能发生局部碱基互补配对
两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对
一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？
①游离的DNA进入细胞后，一般会直接被分解。
②就算没有被破坏且能进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着细胞分裂进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。
核心工作——基因表达载体构建
02
第二步：基因表达载体的构建
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因+ 复制原点
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）
1.基因表达载体的目的
2.基因表达载体的组成
思考：要各个元件有什么作用？
（1）启动子：
①本质：一段有特殊序列结构的 片段。
DNA
②功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
表达载体
启动子
目的基因
终止子
复制原点
（2）终止子：
①本质：一段有特殊序列结构的 片段。
②功能：使转录在所需要的地方停下来。
DNA
2.基因表达载体的组成
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质
位置
功能
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻的碱基
mRNA上三个相邻的碱基
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号（编码氨基酸）
翻译的结束信号（不编码氨基酸）
（3）标记基因：
①作用：
便于重组DNA分子的筛选。
②常见类型：
抗生素抗性基因、
荧光蛋白基因等。
启动子
终止子
标记基因
复制原点
目的基因
主要是指编码蛋白质的基因，能控制表达所需要的特殊性状，如Bt基因。
（5）复制原点：
DNA复制的起始位点。
注意：目的基因必须插入到 与 之间。
启动子 终止子
（4）目的基因：
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）
3.基因表达载体的构建过程
③再利用 将含目的基因的DNA片段拼接到 的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。
目的基因
限制酶切割位点
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
①首先用一定的 切割载体（质粒），使它出现一个切口。
②然后用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
限制酶
同种
相同
DNA连接酶
载体
思考·讨论
使用一种DNA限制酶进行切割（单酶切），是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割（双酶切
），防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
思考
03
第三步：将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
（常用）
三、将目的基因导入受体细胞
②在植物授粉后一定时间内，剪去
柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
（1）花粉管通道法（我国独创）
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
受体细胞：
受精卵
（2）农杆菌转化法
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
体细胞或受精卵
该方法受体细胞为 。
“转化”概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，实质是基因重组。
①农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功
表现出新性状的植株
植物组织培养
第一次导入
第二次导入
第一次拼接
第二次拼接
将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。
(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
Ti质粒
T—DNA
目的基因
构建基因表达载体
重组
Ti质粒
转入农杆菌
导入植物细胞
过程：
（2）农杆菌转化法
1.将目的基因导入植物细胞
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？
T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。
2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？
得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养
问题探讨
核心探讨
将目的基因导入受体细胞
下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
1.重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？
限制酶、DNA连接酶。
2.将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
三、将目的基因导入受体细胞
2.将目的基因导入动物细胞
（1）导入方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
原因：①体积大，易操作；
②易表现出全能性。
（3）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。
病毒侵染法
三、将目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
(1)常用方法：
(2)受体细胞：
Ca2+处理法
常选择原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛）
目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养
(3)过程：
大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态
溶于缓冲液中的重组DNA分子
转化
CaCl2(Ca2+)
三、将目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
(4)应用实例
利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（原核细胞中没有高尔基体和内质网等），需要在体外进行再加工。
转录
翻译
加工
如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？
一般不能产生原来的蛋白质
原因：
①原核生物细胞里没有相应的机制来去除内含子；
②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）
相应机制剪切内含子
转录出来的序列
真核基因：编码区（外显子+内含子）
前体mRNA
成熟mRNA
多肽链
蛋白质
将目的基因导入受体细胞的方法
总结
细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 显微注射 Ca2＋处理法(CaCl2)
受体细胞 受精卵或体细胞 受精卵 常用原核细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
思考
不一定！
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
04
第四步：目的基因的检测与鉴定
四、目的基因的检测与鉴定
1.检测与鉴定的方法
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
目的：
(1)分子水平的检测：
(2)个体生物学水平鉴定：
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA 上
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
PCR等技术
抗原-抗体杂交技术
PCR等技术
①检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质等
1.分子水平的检测
2.个体生物学水平的鉴定
类型 检测内容 方法
个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应性状 或产物是否具有功能活性
抗虫、抗病的接种实验
产品功能活性比较
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
PCR仪
电泳装置
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
微量离心管
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
探究·实践
一、实验原理
(1)PCR利用了 原理，通过调节 来控制DNA双链的 ，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。
(2)PCR扩增DNA片段还利用了
的原理。一次PCR一般要经历 次循环。
DNA的热变性
温度
解聚与结合
DNA半保留复制
30
5’-
-3’
3’-
-5’
3’-
-5’
5’-
-3’
5’-
-3’
-5’
5’-
3’-
-5’
5’-
-3’
-5’
5’-
3’-
-5’
3’-
-3’
高温
变性
延伸
复性
低温
中温
1次循环
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
二、材料用具
2.试剂:
(1)4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
PCR反应体系的配方
为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
(1)DNA片段的扩增
①移液：
用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。
（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活）
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
③反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
预变性：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
2.DNA片段电泳鉴定的原理：
(1)带电粒子：DNA分子具有___________，在一定的pH下，这些基团可以带上____________。
(2)迁移动力与方向：在____的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动，这个过程就是_____。
(3)迁移速度：PCR的产物一般通过 来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________、_____________和____等有关。
(4)检测：凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的_______下被检测出来。
可解离的基团
正电荷或负电荷
电泳
相反
电场
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
探究·实践
一、实验原理
（呈负相关）
琼脂糖凝胶电泳
一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极泳动。
(1)凝胶浓度：制成的琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。凝胶浓度越小，筛孔越大，DNA分子迁移速率就越高；凝胶浓度越大，筛孔越小，DNA分子迁移速率就越低。
影响DNA迁移速率的因素
(2)DNA分子的大小：当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。反之，迁移速率就高。因此，电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近；而较小的DNA分子迁移距离大， 离加样孔远。相同大小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。根据这一特性，可以把不同大小的DNA分子分离开来。
(3)DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。
EB可插入DNA双链碱基之间，形成EB-DNA复合物。该复合物在紫外线激发下，发射出红橙色荧光。EB-DNA复合物荧光强度与DNA含量成正相关，根据荧光强度可粗略地估计样品中DNA含量。（EB有剧毒）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
二、材料用具
2.试剂:
(2)电泳缓冲液(TAE或TBE)、
凝胶载样缓冲液(内含指示剂——溴酚蓝)、
琼脂糖
核酸染料(常用核酸染料为EB即溴化乙锭)等
电源
+
电泳槽
琼脂糖凝胶
样品孔
缓冲液
—
4.配制琼脂糖溶液
琼脂糖
电泳缓冲液
加热至融化
稍冷却
根据待分离DNA片段的大小，确定琼脂糖溶液浓度的大小。
一般配制质量分数为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。
制成琼脂糖溶液
加入核酸染料
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
5.制备琼脂糖凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
梳子
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
6.将凝胶放入电泳槽内
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
梳子
凝胶
电泳槽
凝胶
凝胶加样孔一极朝向电泳槽负极
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
三、实验步骤
7.加入电泳缓冲液
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
8.加样
扩增得到的PCR产物
凝胶载样缓冲液
混合液
注入凝胶加样孔
微量移液器
留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
内含指示剂
显示电泳的过程
课本P84-85
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
三、实验步骤
9.电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm。
待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
课本P84-85
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
10.电泳结果检测
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
标准参照物
PCR扩增产物
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。
PCR扩增产物的鉴定
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
加样孔→
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
在同一浓度的凝胶中，较小的DNA片段迁移速度比大片段快。
四、结果分析
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带（根据条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果）
一条条带
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？
3.如图所示，该片段大小约为 。
750bp
0次
12次
12次
30次
30次
Marker
课本P84-85
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
四、结果分析
课本P84-85
注意:
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
A. PCR产物的分子大小在250至500bp之间
B. 3号样品为不含目的基因的载体DNA
C. 9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D. 10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
练习
3号PCR结果包含250~500bp片段，应包含目的基因
用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到如图所示电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是（ ）
B
9号PCR结果不包含250~50bp片段，所以不是所需转基因植株
（2）特点：
①应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。
②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。
（3）核酸杂交：互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
（1）定义：是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。
【拓展】基因探针
第3章
第2节、基因工程的基本操作程序
（含DNA片段的扩增及电泳鉴定）
基因
表达载体
本节聚焦:
1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
从社会中来
课本P76、76
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(Bt 抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫(P76)
①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？
②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
P77 [相关信息]
你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
导入
抗虫基因
（Bt抗虫蛋白基因）
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
实例：
具体的步骤是？
(含抗虫基因）
（含有并表达抗虫基因）
1、目的基因的筛选与获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
核心
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
基因工程的基本操作程序
01
第一步：目的基因的筛选与获取
获取目的基因时获取的是哪一部分的DNA片段？在解决这个问题之前，我们得先了解基因的结构是怎样的？
1.目的基因
(1)概念：
在基因工程的设计和操作中，用于 或
等的基因。
(3)实例：
与 等相关的基因。
根据不同的需要，目的基因不同，主要指的是 。
改变受体细胞性状
获得预期表达产物
(2)作用：
编码蛋白质的基因
生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因--Bt抗虫蛋白基因
1
一、目的基因的筛选与获取
一
第一步：目的基因的筛选与获取
注意： 所有的基因都编码蛋白质或肽链。
基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。
结构基因的功能：
具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。
转录基因的功能：
只有转录功能，没有翻译功能，能转录形成tRNA和rRNA。
调控基因的功能：
不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。
知识拓展：基因
不是
基因1 基因2 基因3
知识拓展：基因的结构
DNA片段
放大
基因通常是有遗传效应的DNA片段；
能编码特定的蛋白质
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段
启动子
1. 编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。
2. 非编码区 ：
原核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
含有能调控遗传信息表达的DNA序列。
不转录，不编码蛋白质；
知识拓展：基因的结构
终止子
获取目的基因一般获取哪一部分的DNA片段？
基因编码区
与RNA聚合酶结合位点
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
终止子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因上游；
也是一段有特殊序列结构的DNA片段；
位于基因下游；
终止转录
本质：
位置：
作用：
原核细胞的基因结构
知识拓展：基因的结构
启动子
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
非编码区
内含子
外显子
启动子
终止子
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列，然后在翻译前就被剪切掉。
知识拓展：基因的结构
非编码区
非编码区
编码区
转录
剪接
外显子
内含子
前体mRNA
成熟mRNA
真核生物基因的表达
知识拓展：基因的结构
真核生物的DNA转录形成的mRNA需要在细胞核加工处理成为成熟的mRNA后才能作为下一步翻译的模板。
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
某原核细胞基因
非编码区
非编码区
编码区
不编码mRNA
不编码mRNA
(编码mRNA)
启动子
终止子
RNA聚合酶
原核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
某原核细胞基因
原核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
原核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
某真核细胞基因
非编码区
非编码区
编码区
不编码mRNA
不编码mRNA
(编码mRNA)
启动子
终止子
RNA聚合酶
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
真核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
初始mRNA
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
真核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
初始mRNA
成熟mRNA
真核生物基因的表达过程
知识拓展：基因的结构
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不能编码蛋白质的序列
= 非编码区
原核生物的基因：
不能编码蛋白质的序列
真核生物的基因：
= 非编码区+内含子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是 的 编码区是间隔的、 的
相同点 都由能够编码蛋白质的 和具有调控作用 的 区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
知识拓展：基因的结构
目的基因的筛选和获取的方法是怎样的？
2.筛选合适的目的基因
1
一、目的基因的筛选与获取
1.较为有效的方法之一
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
2.认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
3.实例：Bt 抗虫蛋白基因（Bt 基因）的筛选过程
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解。
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
不仅掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
1
3.目的基因的获取方法
1
一、目的基因的筛选与获取
获取目的基因的方法：
①利用PCR获取和扩增目的基因
②从基因文库中获取
③人工合成
前提：
方法：
DNA合成仪
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成
（常用）
重点了解什么是PCR？
人工合成目的基因
1.化学方法人工合成：
(1)需要仪器：DNA合成仪。
(2)适用目的基因类型：基因比较小，核苷酸序列又已知。
(3)不需要模板。
DNA合成仪
蛋白质的氨基酸顺序
mRAN
核苷酸序列
基因DNA的核苷酸序列
目的
基因
推测
推测
化学合成
比如：引物
2.反转录法：
基因的相对分子质量大而又不知其序列。
目的基因的mRNA
杂交双链
(RNA-DNA)
单链DNA
双链DNA
(目的基因)
逆转录酶
核酸酶H
DNA聚合酶
构建基因文库来获取目的基因
1.基因文库概念：
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
2.基因文库类型：
基因组文库：含有一种生物的全部基因。
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。
基因组文库与部分基因文库的关系？
构建基因文库来获取目的基因
3.基因文库的构建：
将DNA片段与载体连接
导入受体菌中储存
(1)基因组文库的构建
提取某种生物的全部DNA
多个一定大小的DNA片段
基因表达载体
用适当的限制酶切割
基因组文库
构建基因文库来获取目的基因
3.基因文库的构建：
(2)部分基因文库（如cDNA文库）构建
提取某种生物某器官或特定发育时期的mRNA
单链互补DNA
双链DNA片段
基因表达载体
与载体连接
cDNA文库
逆转录酶
DNA聚合酶
导入受体菌中储存
mRNA
逆转录酶
核酸酶H
RNA-DNA杂交双链
单链DNA
DNA聚合酶
双链DNA
与载体连接
导入受体菌中储存
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
基因组文库和部分基因文库的比较
PCR是 的缩写。它是一项根据＿＿＿＿＿的原理，在 提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对 的技术。
利用PCR获取和扩增目的基因
1.PCR的概念：
中文全称
原理
操作环境
目的
PCR扩增仪
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
目的基因的核苷酸序列进行大量复制
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
离心管
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
3'
5'
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
ATP
解旋酶
（1）解旋
目的基因的筛选与获取
回顾：体内DNA复制
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
（2）合成子链
回顾：体内DNA复制
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
DNA聚合酶
5'
3'
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
ATP
ATP
DNA聚合酶作用下形成磷酸二酯键
子链延伸合成的方向？
只能从5′－端→3′－端延伸，细胞内有RNA引物结合到模板3′－端引发子链的延伸
回顾：体内DNA复制
（2）合成子链
C
C
G
T
A
G
T
A
T
A
C
G
G
C
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
C
G
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
T
A
T
A
T
A
A
3'
5'
A
C
G
C
A
A
G
C
T
A
G
T
C
A
T
T
A
T
A
T
G
C
A
T
G
A
T
C
G
A
G
C
T
T
5'
3'
T
A
G
C
C
G
T
A
T
A
G
C
C
G
A
T
A
T
3'
5'
T
T
A
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
T
A
5'
3'
（3）重新螺旋形成新的DNA分子
回顾：体内DNA复制
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
什么是引物？
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
引物可以是DNA单链，
也可以为RNA单链，
细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物
细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物
用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
引物结合在模板链的3’端
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链。
子链合成需要引物？
利用PCR获取和扩增目的基因
2.DNA体外复制（PCR）的条件：
体内DNA复制 参与的组分 在DNA复制中的作用 PCR中
参与的组分
解旋酶
DNA母链
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
引物
无需解旋酶，用高温(90℃以上)代替
DNA模板(含目的基因的DNA 片段)
4种脱氧核苷酸(dNTP)
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
（变性）
提供相对稳定的pH环境；一般添加Mg2+，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量，无需添加ATP。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
2种引物(常为小的单链DNA，通常为20-30个核苷酸)
利用PCR获取和扩增目的基因
3.PCR的过程：
当温度超过_____以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
待扩增的DNA片段
(1)变性：
变性
90℃
变性 复性 延伸
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
不需要解旋酶
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
利用PCR获取和扩增目的基因
3.PCR的过程：
当温度下降 到左右时， 种引物通过 与两条单链DNA结合。
3’
5’
3’
5’
碱基互补配对
引物1
5’
3’
引物2
5’
3’
(2)复性：
50℃
两
由于DNA双链是反向平行的，所以需要两种引物
变性 复性 延伸
思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？
①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。
②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
当温度上升到____左右时，溶液中的4种_________在耐高温的_____
__________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
脱氧核苷酸
DNA聚合酶
72℃
利用PCR获取和扩增目的基因
3.PCR的过程：
(3)延伸：
(Taq酶)
3’
5’
3’
5’
引物1
5’
3’
引物2
5’
3’
Taq酶
3’
Taq酶
3’
变性 复性 延伸
思考1：为什么温度要上升至72℃？
思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；
第二轮循环的产物
第三轮循环的产物
利用PCR获取和扩增目的基因
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成 形式扩增（约为 ，其中n为扩增循环的次数）。
指数
2n
常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
4.PCR的结果：
5.PCR产物的鉴定：
循环n次，理论上可获得DNA 数 ，
其中含引物的DNA数 ，
含引物的DNA链数 ，
共需引物数 。
2n
2n
2n+1-2
2n+1-2
利用PCR获取和扩增目的基因
下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题：
(1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？
不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
(2)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
练习：图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：
（1）图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
（2）图2是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由。
第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生 而失效。
第2组：引物Ⅰ′ 后会出现局部 而失效。
3
碱基互补配对
自身折叠
碱基互补配对
每种引物内部不能发生局部碱基互补配对
两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对
一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？
①游离的DNA进入细胞后，一般会直接被分解。
②就算没有被破坏且能进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着细胞分裂进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。
核心工作——基因表达载体构建
02
第二步：基因表达载体的构建
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因+ 复制原点
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）
1.基因表达载体的目的
2.基因表达载体的组成
思考：要各个元件有什么作用？
（1）启动子：
①本质：一段有特殊序列结构的 片段。
DNA
②功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
表达载体
启动子
目的基因
终止子
复制原点
（2）终止子：
①本质：一段有特殊序列结构的 片段。
②功能：使转录在所需要的地方停下来。
DNA
2.基因表达载体的组成
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质
位置
功能
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较
DNA片段
DNA片段
mRNA上三个相邻的碱基
mRNA上三个相邻的碱基
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号（编码氨基酸）
翻译的结束信号（不编码氨基酸）
（3）标记基因：
①作用：
便于重组DNA分子的筛选。
②常见类型：
抗生素抗性基因、
荧光蛋白基因等。
启动子
终止子
标记基因
复制原点
目的基因
主要是指编码蛋白质的基因，能控制表达所需要的特殊性状，如Bt基因。
（5）复制原点：
DNA复制的起始位点。
注意：目的基因必须插入到 与 之间。
启动子 终止子
（4）目的基因：
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）
二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）
3.基因表达载体的构建过程
③再利用 将含目的基因的DNA片段拼接到 的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。
目的基因
限制酶切割位点
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
①首先用一定的 切割载体（质粒），使它出现一个切口。
②然后用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
限制酶
同种
相同
DNA连接酶
载体
思考·讨论
使用一种DNA限制酶进行切割（单酶切），是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割（双酶切
），防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
思考
03
第三步：将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
（常用）
三、将目的基因导入受体细胞
②在植物授粉后一定时间内，剪去
柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
（1）花粉管通道法（我国独创）
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
受体细胞：
受精卵
（2）农杆菌转化法
三、将目的基因导入受体细胞
1.将目的基因导入植物细胞
体细胞或受精卵
该方法受体细胞为 。
“转化”概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，实质是基因重组。
①农杆菌特点：
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；
b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功
表现出新性状的植株
植物组织培养
第一次导入
第二次导入
第一次拼接
第二次拼接
将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。
(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
Ti质粒
T—DNA
目的基因
构建基因表达载体
重组
Ti质粒
转入农杆菌
导入植物细胞
过程：
（2）农杆菌转化法
1.将目的基因导入植物细胞
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？
T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。
2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？
得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养
问题探讨
核心探讨
将目的基因导入受体细胞
下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
1.重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？
限制酶、DNA连接酶。
2.将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
三、将目的基因导入受体细胞
2.将目的基因导入动物细胞
（1）导入方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
原因：①体积大，易操作；
②易表现出全能性。
（3）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。
病毒侵染法
三、将目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
(1)常用方法：
(2)受体细胞：
Ca2+处理法
常选择原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛）
目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养
(3)过程：
大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态
溶于缓冲液中的重组DNA分子
转化
CaCl2(Ca2+)
三、将目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
(4)应用实例
利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（原核细胞中没有高尔基体和内质网等），需要在体外进行再加工。
转录
翻译
加工
如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？
一般不能产生原来的蛋白质
原因：
①原核生物细胞里没有相应的机制来去除内含子；
②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）
相应机制剪切内含子
转录出来的序列
真核基因：编码区（外显子+内含子）
前体mRNA
成熟mRNA
多肽链
蛋白质
将目的基因导入受体细胞的方法
总结
细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 显微注射 Ca2＋处理法(CaCl2)
受体细胞 受精卵或体细胞 受精卵 常用原核细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
思考
不一定！
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
04
第四步：目的基因的检测与鉴定
四、目的基因的检测与鉴定
1.检测与鉴定的方法
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
目的：
(1)分子水平的检测：
(2)个体生物学水平鉴定：
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA 上
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
PCR等技术
抗原-抗体杂交技术
PCR等技术
①检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质等
1.分子水平的检测
2.个体生物学水平的鉴定
类型 检测内容 方法
个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应性状 或产物是否具有功能活性
抗虫、抗病的接种实验
产品功能活性比较
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
PCR仪
电泳装置
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
微量离心管
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
探究·实践
一、实验原理
(1)PCR利用了 原理，通过调节 来控制DNA双链的 ，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。
(2)PCR扩增DNA片段还利用了
的原理。一次PCR一般要经历 次循环。
DNA的热变性
温度
解聚与结合
DNA半保留复制
30
5’-
-3’
3’-
-5’
3’-
-5’
5’-
-3’
5’-
-3’
-5’
5’-
3’-
-5’
5’-
-3’
-5’
5’-
3’-
-5’
3’-
-3’
高温
变性
延伸
复性
低温
中温
1次循环
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
二、材料用具
2.试剂:
(1)4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
PCR反应体系的配方
为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
(1)DNA片段的扩增
①移液：
用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。
（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活）
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
③反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
预变性：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
2.DNA片段电泳鉴定的原理：
(1)带电粒子：DNA分子具有___________，在一定的pH下，这些基团可以带上____________。
(2)迁移动力与方向：在____的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动，这个过程就是_____。
(3)迁移速度：PCR的产物一般通过 来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________、_____________和____等有关。
(4)检测：凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的_______下被检测出来。
可解离的基团
正电荷或负电荷
电泳
相反
电场
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
探究·实践
一、实验原理
（呈负相关）
琼脂糖凝胶电泳
一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极泳动。
(1)凝胶浓度：制成的琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。凝胶浓度越小，筛孔越大，DNA分子迁移速率就越高；凝胶浓度越大，筛孔越小，DNA分子迁移速率就越低。
影响DNA迁移速率的因素
(2)DNA分子的大小：当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。反之，迁移速率就高。因此，电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近；而较小的DNA分子迁移距离大， 离加样孔远。相同大小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。根据这一特性，可以把不同大小的DNA分子分离开来。
(3)DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。
EB可插入DNA双链碱基之间，形成EB-DNA复合物。该复合物在紫外线激发下，发射出红橙色荧光。EB-DNA复合物荧光强度与DNA含量成正相关，根据荧光强度可粗略地估计样品中DNA含量。（EB有剧毒）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
二、材料用具
2.试剂:
(2)电泳缓冲液(TAE或TBE)、
凝胶载样缓冲液(内含指示剂——溴酚蓝)、
琼脂糖
核酸染料(常用核酸染料为EB即溴化乙锭)等
电源
+
电泳槽
琼脂糖凝胶
样品孔
缓冲液
—
4.配制琼脂糖溶液
琼脂糖
电泳缓冲液
加热至融化
稍冷却
根据待分离DNA片段的大小，确定琼脂糖溶液浓度的大小。
一般配制质量分数为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。
制成琼脂糖溶液
加入核酸染料
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
5.制备琼脂糖凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
梳子
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
6.将凝胶放入电泳槽内
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
梳子
凝胶
电泳槽
凝胶
凝胶加样孔一极朝向电泳槽负极
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
三、实验步骤
7.加入电泳缓冲液
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
8.加样
扩增得到的PCR产物
凝胶载样缓冲液
混合液
注入凝胶加样孔
微量移液器
留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
内含指示剂
显示电泳的过程
课本P84-85
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
三、实验步骤
9.电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm。
待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
课本P84-85
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
10.电泳结果检测
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
标准参照物
PCR扩增产物
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。
PCR扩增产物的鉴定
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。
加样孔→
较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。
在同一浓度的凝胶中，较小的DNA片段迁移速度比大片段快。
四、结果分析
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带（根据条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果）
一条条带
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？
3.如图所示，该片段大小约为 。
750bp
0次
12次
12次
30次
30次
Marker
课本P84-85
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
四、结果分析
课本P84-85
注意:
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究·实践
三、实验步骤
A. PCR产物的分子大小在250至500bp之间
B. 3号样品为不含目的基因的载体DNA
C. 9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D. 10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
练习
3号PCR结果包含250~500bp片段，应包含目的基因
用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到如图所示电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是（ ）
B
9号PCR结果不包含250~50bp片段，所以不是所需转基因植株
（2）特点：
①应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。
②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。
（3）核酸杂交：互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
（1）定义：是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。
【拓展】基因探针