第3章基因工程综合复习训练（含解析）2023——2024学年高生物人教版（2019）选择性必修必修3生物技术与工程
文档属性
| 名称 | 第3章基因工程综合复习训练（含解析）2023——2024学年高生物人教版（2019）选择性必修必修3生物技术与工程 |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 4.8MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-05-18 14:47:26 | ||
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文档简介
第3章 基因工程 综合复习训练
学校:___________姓名：___________班级：___________考号：___________
一、单选题
1．下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述中，正确的是（ ）
A．将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于沉淀物中
B．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液即可变为蓝色
C．对1个双链DNA分子进行PCR扩增，第n次循环共需要引物2n个
D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察
2．S6蛋白参与调控细胞周期，在癌细胞中表达量明显升高。为研究S6过表达的影响，将S6-GFP融合基因（GFP为绿色荧光蛋白基因）转入细胞，筛选出S6过表达细胞。在S6过表达细胞中，检测到CDH1蛋白水平明显降低。在S6基因敲除细胞中，CDH1蛋白第135位赖氨酸乙酰化水平升高。下列叙述错误的是（ ）
A．人体细胞分裂过程中，中心粒倍增与纺锤体形成的时期不同
B．在构建S6过表达细胞系时，可根据绿色荧光的强弱来挑选细胞进行培养
C．S6蛋白与CDH1蛋白结合，可能使CDH1蛋白第135位赖氨酸乙酰化水平升高
D．S6基因可能是一种原癌基因，CDH1基因可能是一种抑癌基因
3．关于“DNA的粗提取与鉴定”（实验Ⅰ）和“绿叶中色素的提取和分离”（实验Ⅱ）的相关叙述错误的是（ ）
A．两个实验都使用酒精溶解物质
B．两个实验都需要将实验材料进行充分研磨
C．实验Ⅰ粗提取的DNA呈现蓝色，实验Ⅱ提取的色素滤液呈现绿色
D．实验IDNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，实验Ⅱ各种色素在层析液中的溶解度不同
4．下列有关基因工程说法中，错误的是（ ）
A．基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿定向地改造生物，培育出新品种
B．质粒常作为基因工程的载体，是存在于细菌和酵母菌等生物细胞中的一种细胞器
C．细菌细胞内的基因可在植物细胞内表达是因为所有生物共用一套密码子
D．对于基因工程或分子生物学实验室向外排放转基因细菌等必须严加管制
5．为增加玉米的抗旱性，科研人员构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，并采用农杆菌转化法将其转入玉米幼胚组织细胞中，用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交检测后，经进一步鉴定，筛选出抗旱的转基因玉米。下列叙述错误的是（ ）
A．提取该微生物mRNA逆转录为cDNA，通过PCR可获得大量抗旱基因E
B．目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制
C．将重组质粒置于经Ca2+处理的农杆菌悬液中，可获得转化的农杆菌
D．抗原—抗体杂交检测呈阳性的植株还要通过抗旱实验进行筛选
6．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B．可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA
C．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色
D．提取的DNA可溶解在2molL的NaCl溶液中
7．研究发现，由链霉菌产生的聚酮化合物（一类精氨酸衍生物）可介导土壤环境中细菌和真菌的相互作用，具有潜在的应用价值。菌体内贮藏的脂质降解后能为聚酮化合物的合成提供大量前体物质。野生型链霉菌株聚酮化合物的产量有限，难以满足工业化生产的需求。下列叙述正确的是（ ）
A．聚酮化合物的组成元素中一定有C、H、O、N，可能含有S
B．链霉菌产生聚酮化合物时需要内质网和高尔基体的加工分类
C．减少葡萄糖供给并抑制脂质降解有助于链霉菌产生聚酮化合物
D．可利用基因工程技术改良野生型链霉菌以获得高产的新物种
8．现如今随着技术的不断发展，人们发明了多种PCR技术的衍生版本，如重叠延伸PCR、等位基因特异PCR、热不对称性PCR、荧光定量PCR、锅柄式PCR等。这些新技术在不同层面对传统PCR技术进行了较完善合理的改进。下列有关PCR的叙述正确的是（ ）
A．已知重叠延伸PCR可将两个或多个DNA片段连接起来，因此可用于较长DNA分子的人工合成
B．已知等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异，因此可用于病毒的检测与分析
C．已知热不对称性PCR可通过调节退火温度产生多种产物，因此操作时对温度的要求低于常规PCR
D．已知荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号，因此可用于亲子鉴定
9．为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。报告基因只有在真核细胞中表达，其产物才能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是（ ）
A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上
B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落
C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株
D．为提高基因表达载体进入农杆菌的效率，需要用Ca2+处理细胞
10．基因工程中使用特定的限制性内切核酸酶切割目的基因和质粒，便于重组质粒构建和筛选。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。已知BclⅠ的识别序列和切点是-T↓GATCA-，BglⅡ的识别序列和切点是-A↓GATCT-，MboI的识别序列和切点是-↓GATC-。下列分析错误的是（ ）
A．三种限制酶切割后获得的黏性末端相同
B．用限制酶切割右图DNA分子获得目的基因时，被水解的磷酸二酯键有4个
C．用BclI和BglⅡ切割质粒和目的基因时，形成的重组质粒的碱基排列顺序一定相同
D．若用MboI切割质粒，用BclI和BglⅡ切割目的基因，形成的重组质粒可被MboI再次切开
11．发酵工程在医药上的应用非常广泛，其中青霉素的发现和产业化生产进一步推动了发酵工程在医药领域的应用和发展。下图是生产青霉素的发酵工程流程，据图分析下列说法错误的是（ ）
A．图示生产青霉素的过程中，对菌种进行分离纯化采用了稀释涂布平板法
B．青霉素的发酵生产多采用深层通气液体发酵技术来提高产量
C．选育出高产青霉素的菌种是本发酵工程的中心环节
D．主发酵罐中发酵液的pH应调至酸性
12．中国科学家发展了一种可工作于活细胞环境的框架核酸状态智能机（如图），可以在活细胞中实现人为添加的时序信号调控的CRISPR（基因编辑）系统的分级运输、基因组定位与基因编辑功能。下列说法正确的是（ ）
A．核仁蛋白不能分布到细胞膜上，参与细胞的识别作用
B．有限状态机与向导RNA结合后，进入细胞的过程不需要消耗能量
C．cas9（核酸编辑酶：一种蛋白质）/向导RNA复合物能通过核孔进入细胞核
D．向导RNA能够通过碱基互补配对定位到特定的基因位置并切断磷酸二酯键
13．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（ ）
A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链
B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关
C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接
D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接
14．研究人员对野生型(高秆)油菜的研究中偶然发现了一株矮秆突变体 ds-3，将 ds-3与野生型亲本杂交，F1为野生型，F1自交F2中高秆：矮秆=3∶1(相关基因用A、a表示)。为确定矮秆突变基因的位置，研究者根据油菜染色体上某些特定的已知 DNA 序列(如M/m、N/n) 设计了多对引物，提取上述F 群体中矮秆植株的DNA进行PCR，产物电泳后的部分结果如图2。下列有关叙述正确的是（ ）
A．由扩增结果可推知突变基因在3号染色体上
B．F1基因型为AaMmNn, F2中 AAMmNn的比例为1/16
C．单株丙出现Nn扩增结果的原因可能是7号染色体的非姐妹染色单体发生互换
D．PCR 技术基于DNA复制原理，因此只能扩增而不能获取目的基因
15．抗原检测阴性但临床仍然高度怀疑新冠病毒感染的患者，医生会建议做核酸检测。该检测实际采用的技术是RT-PCR，病毒刺突蛋白编码序列如下图所示，科研人员为该PCR分别设计了引物A （5＇-CCCTGTATGGGGTTCTAA-3＇，PCR中与b链结合）和引物B （5＇-ACGACT①TTA②CTGGTGCAG-3＇），已知引物A中ATG对应起始密码子，引物B中TTA对应终止密码子，标记基因可以插入刺突蛋白编码序列的首端或末端。下列叙述错误的是（ ）
A．图中a链的方向是自左向右为5＇→3＇
B．转录过程中b链作为模板连
C．若标记基因需要插入引物B的①或②位置中，则应选择②位置
D．获取新冠病毒的遗传物质后直接进行PCR扩增以节省出报告时间
16．利用基因工程技术培育出油脂高产的四尾栅藻，是获取生物柴油的新途径。科学家欲从紫苏中提取DGAT1基因（催化油脂合成的关键酶基因），导入到四尾栅藻细胞，获得转基因油脂高产的四尾栅藻，质粒pCAMBIA与PCR扩增出的DGAT1酶切位点如图所示。现有BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ三种限制酶，它们识别并切割的碱基序列分别为BamHI：5'—G↓GATCC—3'，BglⅡ：5'—A↓GATCT—3'，EcoR I：5'—G↓AATTC—3'。已知启动子往往具有物种特异性，质粒pCAMBIA中EcoRI酶切位点与BamHⅠ酶切位点间的最短距离为600bp。用BglⅡ酶切割DGAT1，BamHⅠ酶切割质粒，下列叙述正确的是（ ）
A．过程②进行PCR时，需要在两种引物的3'端添加限制酶Bgl Ⅱ的识别序列
B．在载体pCAMBIA 质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择紫苏的启动子
C．重组质粒若只考虑两两连接，可得到4种大小不同的连接产物
D．用EcoR I酶对不同的重组质粒进行酶切鉴定，正确连接的重组质粒酶切产物长度为2400bp和800bp
二、多选题
17．Cre-loxP系统能实现特定基因的敲除（如图1）。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列（loxP1和loxP2）串在一起，构建表达载体T（如图2）。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个loxP1之间或两个IoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法正确的是（ ）
A．Cre酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键
B．若小鼠细胞含一个表达载体T（不含Cre酶），其肌肉组织细胞呈红色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T（含Cre酶），其脑组织细胞可能呈红色或黄色或蓝色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T（含Cre酶），其脑组织细胞可能随机出现两种颜色叠加
18．干扰素是由淋巴细胞产生的一种细胞因子， 在临床上常用于治疗病毒感染性疾病，科研人员通过构建基因工程菌来生产干扰素。下图为构建工程菌的流程图，图中质粒A．上m、n分别是启动子和终止子，目的基因的b链为模板链。下列叙述错误的是（ ）
A．①过程需要逆转录酶，RNA可从淋巴细胞中获得
B．②过程需在b链5＇端加接NcoI的识别序列
C．③过程目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制
D．质粒A的复制和表达过程都遵循中心法则和碱基互补配对原则
19．东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对 Cd的富集能力，从而有 效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述错误的是（ ）
A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得
B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带
C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列
D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞
20．科研人员构建了可表达H-M3融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图所示，其中M3为水母体内的绿色荧光蛋白基因。下列有关叙述错误的是（ ）
A．构建重组质粒必须使用T4DNA连接酶
B．导入受体细胞的“融合基因”需要两个启动子和两个终止子
C．构建H-M3融合基因的目的是有利于检测H基因能否表达以及表达量
D．为确定H基因定向连接到质粒中，可选择引物组合有8种
三、非选择题
21．研究发现，大豆GmNF-YA19基因在不同非生物胁迫中均有响应。为研究该基因的功能，科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因，构建GmNF-YA19基因表达载体并转化烟草，实验过程如下图1、2所示。回答下列问题：
(1)在利用PCR扩增GmNF-YA19基因时，其原理是 ，延伸子链时需加入 酶，需要设计 种特异性引物，引物的作用是 。
(2)根据图中信息，最好选用 两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，其原因是 。
(3)基因表达载体导入烟草常用 法。有研究表明，GmNF-YA19基因对干旱胁迫的应答最显著，科研人员对GmNF-YA19转基因烟草（OE1、OE2和OE3）的抗旱性进行鉴定。对干旱处理后的WT（野生型）烟草和GmNF-YA19转基因烟草叶片的电解质渗透率及丙二醛（二者反应叶片损伤程度）、可溶性糖和脯氨酸（二者是细胞中渗透压调节物质1含量进行检测，结果如下图3所示。
由结果分析，GmNF-YA19基因调节的机理可能是干旱胁迫下， 。
22．肌肉生长抑制素MSTN是骨骼肌生长发育负调控因子，MSTN在肌肉组织中特异性表达，其活性的丧失或降低会引起动物肌肉的过度发育，表现为肌纤维直径变大或肌纤维数增加，口感良好。因此，通过基因敲除获得具有育种能力的MSTN基因突变牛十分必要。
限制酶 KpnI MfeI HindIII EcoRI BamHI
识别序列及切割位点
图2
(1)科研人员利用打靶载体敲除牛MSTN基因（以下简称M基因），载体构建及M基因敲除过程如图1所示。为构建能够敲除M基因的打靶载体，需先设计引物，通过PCR技术扩增M基因。在引物上添加PstI限制酶识别序列，限制酶识别序列添加至引物的 （填“5'端”或“3'端”），据图1应选择的引物是 （从a、b、c、d中选择），将得到的PCR产物酶切后连入打靶空载体，鉴定正确后进行后续实验。
(2)为将抗生素抗性基因neo（抵抗抗生素新霉素）从原载体中切下，随后插入M基因中。据上图1及表中限制酶信息，应选择限制酶 分别对M基因和neo基因进行酶切，并用 连接，完成打靶载体构建。
(3)将构建好的打靶载体通过 法导入牛受体细胞中。据图1，受体细胞基因组中的M基因通过交换被替换为打靶载体上插入neo基因的M基因片段。交换后的打靶载体以及未成功交换的打靶载体（线形DNA片段）很不稳定，在相关酶的作用下随即降解。
(4)载体可整合到受体细胞基因组DNA的其他部位，引发K基因表达，使细胞在加入物质Q的培养基上无法存活。在选择培养基中除有细胞培养的必需成分外，还需要加入物质Q和 ，可筛选出成功敲除M基因的受体细胞，其原因是 。
23．猴痘是由猴痘病毒引起的一种人畜共患病。研究发现其F3L蛋白可抑制宿主天然免疫。科研人员通过转基因技术，利用大肠杆菌表达F3L蛋白，进行猴痘病毒相关研究。
注：kanr为抗卡那霉素抗性基因；EcoRI、XhoI为酶切位点
回答下列问题：
(1)PCR扩增F3L基因时，反应体系中添加的引物作用是 。
(2)将PCR扩增得到的含F3L基因的DNA片段与质粒都经双酶切，再用 将两者连接，构建F3L基因表达载体。研究表明蛋白表达诱导物质（IPTG）能促使F3L基因在大肠杆菌中表达，推测其影响部位是图1中 （填字母）。
(3)大肠杆菌用 处理，然后将基因表达载体导入其中，为筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，还需使用含有 的固体培养基。
(4)重组大肠杆菌在0.6mM IPTG浓度下培养，探究不同的温度、培养时间的优化方案。将其提取的蛋白质进行电泳，结果如图2，已知F3L蛋白相对分子质量为24.6ku，请用方框在图2-乙中标出其所在位置 ，从图中可推测出培养重组菌的最适条件为 。
注：M为已知相对分子质量标准；ku为蛋白质相对分子质量
24．异丁醇具有燃值高、能量密度高等优点，其开发和利用对优化我国能源结构和保护环境有非常重要的战略意义。基于酿酒酵母的发酵途径（图甲）和图乙的质粒，研究者构建了一种表达载体pUC18，用于过表达ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因，以实现异丁醇的大规模生产。已知氨苄青霉素能抑制细菌细胞壁的形成。据此回答下列问题：
(1)图乙质粒上有多个限制酶切位点，作用是 。研究人员先用pUC18转化经 处理（处理方法）的大肠杆菌，以便筛选、鉴定扩增重组质粒。重组质粒上有 ，所以能在大肠杆菌中扩增。
(2)将环状载体pUC18导入酿酒酵母时，一般会将其进行酶切得到线性化载体，随后再将其导入受体细胞。根据所学的知识推测酶切得到线性化载体的目的是 。
(3)提取成功构建的表达载体并导入不能合成组氨酸的酿酒酵母菌株，将菌株接种在培养基中以获得单菌落，培养基中必须要添加的物质有 （用下列字母填写：a．组氨酸、b．氨苄青霉素、c琼脂）。
(4)异丁醇的大量积累会伤害细胞，研究人员给该工程菌导入一个经改造的光敏蛋白基因，使工程菌对特定的蓝光敏感。进行不同的光照处理，使其在异丁酵产生阶段和生长繁殖阶段进行切换，结果如下图丙所示。
注：5 / 10/ 20h pulse分别代表在黑暗条件下每隔5、10、20h发出15s和65s的蓝光脉冲30min
①对照组的酵母菌需要导入 。
②以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行发酵时，若想进一步提高其异丁醇产量，综合图甲和图乙信息，分别写出进一步优化菌株和工艺的措施 。
25．眼球中的小梁网由小梁网细胞构成，小梁网细胞凋亡可能引发青光眼，最终损伤视神经。线粒体是小梁网细胞凋亡的调控中心，部分机理如图（1）所示。其中APAF1为细胞凋亡激活因子；Bcl-2与Bax是调控线粒体凋亡的相关蛋白，两者结合后会使线粒体外膜通透性改变，导致线粒体内膜上的电子传递蛋白细胞色素c外流。检测发现，小李患JOAG型青光眼，该病由位于1号染色体的MYOC基因突变所致。MYOC基因编码链上部分碱基序列以及小李家庭成员MYOC基因扩增、酶切后的电泳结果如图（2）所示。
(1)研究发现，JOAG型青光眼是由MYOC基因的编码链第733位碱基“T”替换为“G”所致。突变后，MYOC蛋白第245位氨基酸由 变为 。若想利用PCR扩增MYOC突变基因开展研究，设计其引物的部分序列是 。（通用遗传密码：GAG为谷氨酸；CUC为亮氨酸；GGU为甘氨酸；UGU为半胱氨酸；ACA为苏氨酸；CCA为脯氨酸）
(2)据图（2）判断，小李家系JOAG型青光眼的遗传方式是 ，其父母再生育二胎为患病男孩的概率是 。
(3)调查发现，小李还患有红绿色盲（由OPN1LW基因突变所致）。一般情况下，小李体内OPN1LW突变基因与MYOC突变基因进行重组的过程发生在 。（编号选填）
① 精细胞 ②小梁网细胞③ 精原细胞 ④ 初级精母细胞
(4)研究还发现，TGF-β蛋白过量也会影响小梁网的功能，从而引发青光眼。据已学知识推测，TGF-β蛋白过量的原因可能是______。（单选）
A．TGF-β基因启动子区域甲基化程度下降
B．TGF-β基因启动子区域与其他蛋白质结合
C．TGF-β基因的mRNA上终止密码子结构改变
D．体内部分RNA片段与TGF-β基因转录的产物结合
(5)结合题干及已学知识推测，为缓解青光眼所引发的症状，下列方案合理的有______。（多选）
A．移植正常的神经干细胞修复或再生视神经
B．阻断Bax与Bcl-2结合降低小梁网细胞凋亡
C．基因治疗修正MYOC突变基因并注入眼球组织
D．诱导多能干细胞产生小梁网细胞并注入眼球组织
试卷第1页，共3页
试卷第1页，共3页
参考答案：
1．C
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中，A错误；
B、将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，在沸水浴的条件下，溶液可变为蓝色，B错误；
C、PCR 技术大量扩增目的基因时，第n 1次生成2n 1个DNA分子，第n次复制形成2n个DNA，所以需要的引物数目为（2n 2n 1）×2=2n，C正确；
D、DNA分子在凝胶载样缓冲液中带正电荷或负电荷，可用于电泳；凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，在波长为300nm的紫外灯下可以被检测出来，D错误。
故选C。
2．C
【分析】1、根据题意分析：在过表达S6的细胞中，检测到CDH1水平明显降低，在S6基因敲除细胞中，CDH1第135位赖氨酸乙酰化水平升高，推测S6蛋白与CDH1蛋白结合，可能使CDH1蛋白第135位赖氨酸乙酰化水平降低。
2、一般来说，原癌基因表达的蛋白质是细胞正常的生长和增殖所必需的，这类基因一旦突变或过量表达而导致相应蛋白质活性过强，就可能引起细胞癌变。相反，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞凋亡，这类基因一旦突变而导致相应蛋白质活性减弱或失去活性，也可能引起细胞癌变。
【详解】A、人体细胞分裂过程中，中心粒在间期倍增，进入分裂期后，在前期两组中心粒之间的星射线形成了纺锤体，A正确；
B、将S6-GFP融合基因转入细胞后，可根据绿色荧光的强弱来挑选细胞进行培养，B正确；
C、在S6过表达细胞中，检测到CDH1蛋白水平明显降低，在S6基因敲除细胞中，CDH1蛋白第135位赖氨酸乙酰化水平升高，推测S6蛋白与CDH1蛋白结合，可能使CDH1蛋白第135位赖氨酸乙酰化水平降低，C错误；
D、在癌细胞中，S6蛋白表达量明显升高，而CDH1蛋白水平明显降低，故S6基因可能是一种原癌基因，CDH1基因可能是一种抑癌基因，D正确。
故选C。
3．C
【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理：
①DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的，当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出；
②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液，·利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA；
③DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
【详解】A、实验Ⅰ中利用酒精溶解蛋白质的特征，实验Ⅱ中利用色素能溶解到无水乙醇中的特性，A正确；
B、实验Ⅰ中将切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，实验Ⅱ充分研磨的目的是使色素溶解到酒精中，B正确；
C、实验Ⅰ粗提取的DNA呈现白色丝状，实验Ⅱ提取的色素滤液呈现绿色，C错误；
D、实验I中DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，据此可将DNA析出，而实验Ⅱ各种色素在层析液中的溶解度不同，因而在滤纸条上扩散的速度不同，因此能分离色素，D正确。
故选C。
4．B
【分析】基因工程的原理是基因重组，需要的工具有限制酶、DNA连接酶和运载体。
【详解】A、基因工程可以定向改造生物的性状，培育新品种，A正确；
B、质粒是存在于细菌和酵母菌等生物细胞中的一种环状DNA分子，不是细胞器，B错误；
C、所有生物共用一套密码子是细菌细胞内的基因可在植物细胞内表达的原因，C正确；
D、对于基因工程或分子生物学实验室向外排放转基因细菌等必须严加管制，避免污染环境，D正确。
故选B。
5．B
【分析】1、将目的基因导入受体细胞时根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
2、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因常用DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA，常用分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、提取该微生物mRNA，在反转录酶的催化作用下，反转录为cDNA，再通过PCR可获得大量目的基因（抗旱基因E），A正确；
B、启动子和终止子分别负责启动和终止基因的转录过程，它们在基因表达调控中发挥着至关重要的作用，目的基因复制与复制原点有关，B错误；
C、农杆菌经钙离子处理后，成为感受态，使其易于吸收周围的DNA分子，所以将重组质粒置于经Ca2+处理的农杆菌悬液中，可获得转化的农杆菌，C正确；
D、用E蛋白的抗体进行抗原-抗体杂交，可在分子水平检测转基因玉米的抗旱性状，之后还需要个体水平的检测，即抗旱实验进行筛选，D正确。
故选B。
6．B
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、粗提取的DNA中可能含有蛋白质、脂质、糖类等，A正确；
B、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离，B错误；
C、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，C正确；
D、在DNA粗提取时，用2mol/L的NaCl溶液可以溶解DNA，D正确。
故选B。
7．A
【分析】原核细胞和真核细胞最主要的区别是原核细胞没有核膜包被的成形的细胞核，同时原核细胞也没有线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体等复杂的细胞器，具有拟核，拟核中没有染色体的存在，但是一般具有细胞壁、细胞膜、细胞质、核糖体。
【详解】A、聚酮化合物是一类精氨酸衍生物，其组成元素中一定有C、H、O、N，可能有S，A正确；
B、链霉菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，且聚酮化合物不是分泌蛋白，不需要高尔基体和内质网加工分类，B错误；
C、葡萄糖能为链霉菌的代谢活动提供能量，脂质的降解能为聚酮化合物的合成提供前体物质，故减少葡萄糖供给并抑制脂质降解不利于链霉菌产生聚酮化合物，C错误；
D、利用基因工程技术改良野生型链霉菌并不能得到一个新物种，D错误。
故选A。
8．A
【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
【详解】A、重叠延伸PCR可将多个短DNA连接成一个长DNA，可以帮助将人工合成的短DNA合成为目标长DNA，A正确；
B、等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异，可用于亲子鉴定以及遗传病的筛查，无法检测是否存在某种病毒，B错误；
C、热不对称性PCR需对温度进行精细控制，对温度的要求高于常规PCR，C错误；
D、荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号，可用于某些病毒的检测，无法判断两份DNA间的细微差别，因此无法用于亲子鉴定，D错误。
故选A。
9．B
【分析】农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。
【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因（基因G）插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因（基因G）整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，A正确；
B、农杆菌属于原核生物，含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，故不会出现农杆菌的蓝色菌落，B错误；
C、根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确；
D、用Ca2+处理细胞，使大肠杆菌处于感受态，易于吸收周围环境中的DNA分子，能提高基因表达载体进入农杆菌的效率，D正确。
故选B。
10．C
【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。
【详解】A、三种限制酶切割后获得的黏性末端相同，均为-GATC-，A正确；
B、用限制酶切割右图DNA分子获得目的基因时，两个限制酶共切割了4个位点，则断裂了4个磷酸二酯键，B正确；
C、切割质粒和切割目的基因用均用BclⅠ和BglⅡ，由题干可知，两种酶切割后产生的黏性末端相同，形成的重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，C错误；
D、切割质粒用MboⅠ，产生黏性末端且识别序列为-GATC-，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，产生黏性末端（-GATC-），形成的重组质粒中原来的BclⅠ和BglⅡ的切割位点的序列发生改变，不能再被这两种酶切割，但不影响MboⅠ的作用（能识别-GATC-），D正确。
故选C。
11．C
【分析】发酵工程以其生产条件温和、原料来源丰富且价格低廉、产物专一、废弃物对环境的污染小和容易处理等特点，在食品工业、医药工业和农牧业等许多领域得到了广泛的应用，形成了规模庞大的发酵工业。
【详解】A、对菌种分离纯化方法有平板划线法和稀释涂布平板法；据图可知在生产青霉素的过程中对菌种进行分离纯化采用了稀释涂布平板法，A正确；
B、青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；
C、在发酵罐内发酵是本发酵工程的中心环节，C错误；
D、青霉菌属于真菌，真菌培养时适宜在中性偏酸环境中生长；故培养青霉菌时一般将pH调至酸性，D正确。
故选C。
12．C
【分析】细胞核的结构：（1）核膜：核膜是双层膜，外膜上附有许多核糖体，常与内质网相连；其上有核孔，是核质之间频繁进行物质交换和信息交流的通道；（2）核仁：与某种RNA的合成以及核糖体的形成有关；（3）染色质：细胞核中能被碱性染料染成深色的物质，其主要成分是DNA和蛋白质。
【详解】AB、据图可知，有限状态机与向导RNA结合后，与分布在细胞膜上的核仁蛋白接触，进而进入细胞内，进入细胞的过程是胞吞，胞吞需要消耗能量，AB错误；
C、核孔是大分子物质进出细胞核的通道，cas9（核酸编辑酶：一种蛋白质）/向导RNA复合物能通过核孔进入细胞核，C正确；
D、向导RNA能够通过碱基互补配对定位到特定的基因位置，但不能切割磷酸二酯键，D错误。
故选C。
13．C
【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按 碱基互补配对的原则结合，再调 温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、退火是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；
B、电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；
C、由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C错误；
D、选取引物甲乙，扩增出400bp长度片断时，可以说明目的基因反接，若正接，不能扩增出100bp的片段，D正确。
故选C。
14．C
【分析】基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中，随配子独立遗传给后代，同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合。
【详解】A、由图示结果可知，提取F2群体中矮秆植株的DNA进行 PCR，MM、Mm、mm序列均出现在矮秆序列中，说明矮秆基因与M/m序列自由组合，因此突变基因不在3号染色体上，子二代矮秆几乎都只含有N序列，说明矮秆基因与N序列连锁，故可将突变基因定位在7号染色体上，A错误；
B、根据题意可知，将ds-3与野生型亲本杂交，F1为野生型，F1自交F2中高秆∶矮秆=3∶1，说明矮秆为隐性性状，根据图示可知，突变型只含M和N序列，野生型只含m和n序列，故两亲本基因型可写为aaMMNN，AAmmnn，F1基因型为AaMmNn，由于a和N连锁，F2中不会出现AANn，B错误；
C、由图可知，F2矮秆植株中均含有DNA序列N，很少有n，说明矮秆基因和N位于同一条染色体上，而个别 Nn的出现可能是由于7号染色体的非姐妹染色单体发生互换，也可能是N发生了基因突变，形成了an的配子，an的配子与aN的配子结合形成了aaNn的个体，C正确；
D、PCR技术基于DNA复制原理，能用于DNA扩增也能通过PCR技术获取目的基因，D错误。
故选C。
15．D
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】A、PCR过程中，引物结合在模板链3＇端，故a链的方向是自左向右为5＇→3＇，A正确；
B、从启动子的方向可知，转录方向是自左向右，b链的方向是3＇→5＇，所以b链做模板链，B正确；
C、引物B中TTA对应终止密码子，标记基因可以插入刺突蛋白编码序列的首端或末端，所以标记基因需要插入引物B的②位置，C正确；
D、新冠病毒是RNA病毒，需要先逆转录为DNA后再进行扩增，D错误。
故选D。
16．D
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、基因的检测与鉴定。
【详解】A、过程②是通过PCR技术实现的，由②的扩增产物两端的酶切序列为BglⅡ可知，进行PCR时，需要在两种引物的5'端添加限制酶BglⅡ的识别序列，A错误；
B、要达到让紫苏DGATI基因在四尾栅藻细胞中表达的目的，应该添加四尾栅藻的启动子，B错误；
C、若只考虑DNA片段的两两连接，构建重组质粒时可得到3种大小不同的连接产物，即目的基因自连、质粒自连以及目的基因和质粒相互连接的用产物，C错误；
D、利用EcoRI限制酶切割重组质粒进行鉴定。已知质粒pCAMBLA中EcoRⅠ的酶切位点与BamHI的酶切位点间的最短距离为600bp，根据质粒pCAMBIA和DGATI基因的长度可知，若利用EcoRI限制酶切割重组质粒进行鉴定，正确连接的重组质粒酶切产物应为2400bp和800bp，A组重组质粒为所需质粒，D正确。
故选D。
17．ACD
【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
【详解】A、DNA单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA由两条单链螺旋缠绕形成，Cre酶切下一个待敲除基因的过程中，需要切断基因前后两端，因此需要破坏四个磷酸二酯键，A正确；
B、据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B错误；
C、1oxP1、1oxP2位置如图2黑白三角符号所示，两个loxP1和两个loxP2之 间的基因最多会被Cre酶敲除一次，将含Cre酶的病毒注入小鼠体内，Cre酶表达情况不同，识别的loxP不同，则有可能未敲除荧光蛋白基因，此时为红色(同不含Cre酶时)，也有可能敲除两个loxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色，也有可能敲除两个1oxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色，因而不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，C正确；
D、小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能出现两种颜色，D正确。
故选ACD。
18．BC
【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】A、①过程为逆转录，该过程需要逆转录酶，干扰素由淋巴细胞产生，因此可从淋巴细胞中获得控制干扰素合成的mRNA，A正确；
B、b链是模板链，转录只能从模板链的3′端开始，结合图中质粒上启动子和终止子的方向分析可知，应在a链5′端加接NcoI的识别序列，b链5′端加接BamHI的识别序列，才能保证目的基因正向插入质粒，B错误；
C、③过程目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行转录，C错误；
D、质粒A的复制过程有A-T、T-A、C-G、G-C的碱基配对方式，表达过程有A-T、U-A、C-G、G-C的碱基配对方式，都遵循中心法则和碱基互补配对原则，D正确。
故选BC。
19．ABD
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、由于引物接在了目的基因的两侧，因此经过两轮PCR后，可获得与HMA3基因等长的DNA单链，故若要获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；
B、 用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；
C、构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；
D、质粒上含有潮霉素抗性基因，用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或含空质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误 。
故选ABD。
20．ABD
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接黏性末端，另外T4DNA连接酶还可以连接平末端，构建重组质粒可使用T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶，A错误；
B、导入受体细胞内的“融合基因”需要一个启动子和一个终止子，保证转录的正常进行，B错误；
C、构建H-M3融合基因的目的是有利于检测H基因能否表达及表达量，若发现有绿色荧光则说明可正常表达，绿光越深，说明表达量越高，C正确；
D、为确定H基因定向连接到质粒中，引物组合应分别结合于H基因及左侧或右侧碱基序列，即F3-R1、F2-R1、F1-R2、F1-R3，可选择引物组合有4种，D错误。
故选ABD。
21．(1) DNA半保留复制 耐高温的DNA聚合酶 2/两 使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
(2) PvuⅡ和EcoRⅠ 保证目的基因和质粒正向连接，避免发生自身环化
(3) 农杆菌转化法 GmNF-YA19基因的表达产物促进了可溶性糖和脯氨酸的产生，同时抑制了丙二醛的产生
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA半保留复制，引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，因此延伸子链时需加入耐高温的DNA聚合酶，在利用PCR扩增GmNF-YA19基因时，由于基因结构为双螺旋结构，且在进行复制时，两条单链均可作为模板进行复制，因此，需要设计2种特异性引物，在PCR扩增过程中，引物的作用是与模板链在特定位置发生碱基互补配对，而后使DNA聚合酶从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸。
（2）根据图中信息，在质粒的启动子和终止子中间含有的限制酶为PvuⅡ、KpnⅠ和EcoRⅠ三种限制酶切割位点，由于KpnⅠ在质粒中不只一个识别位点，因此最好选用PvuⅡ和EcoRⅠ进行切割，且在目的基因的两端也存在着两种酶的识别位点，即选用PvuⅡ和EcoRⅠ两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，这样可以保证目的基因和质粒正向连接，避免发生自身环化。
（3）将目的基因表达载体导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，这里将基因表达载体导入烟草常用农杆菌转化法。实验中对干旱处理后的WT（野生型）烟草和GmNF-YA19转基因烟草叶片的电解质渗透率及丙二醛（二者反应叶片损伤程度）、可溶性糖和脯氨酸（二者是细胞中渗透压调节物质）含量进行检测，根据实验结果可知，转基因烟草在干旱胁迫下，电解质渗透率及丙二醛的含量均较野生型低，且随着干旱时间延长，叶片损伤程度加大，但均低于野生型，同时，可溶性糖和脯氨酸的含量表现为在转基因烟草均高于对照组，且随着盐胁迫时间的延长，这两种物质的含量继续上升，据此可推测，GmNF-YA19基因对干旱胁迫的调节机理可能是干旱胁迫下，GmNF-YA19基因的表达产物促进了可溶性糖和脯氨酸的产生，同时抑制了丙二醛的产生，进而降低了叶片的损伤程度，提高了植物细胞渗透压的调节能力。
22．(1) 5'端 a和d
(2) EcoRI和MfeI DNA连接酶
(3)显微注射
(4) 新霉素 成功敲除M基因的受体细胞基因组DNA含有neo基因，无K基因表达，使其具有新霉素抗性，且可在含物质Q的培养基上存活
【分析】1、引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
2、选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：
①不能破坏目的基因
②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）
③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。
3、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）利用PCR技术扩增DNA分子时，子链的延伸方向是从引物的5'端到3'端，因此在引物上添加PstI限制酶识别序列，限制酶识别序列应添加至引物的5'端，否则引物失效。就图中给定的a、b、c、d四种引物而言，想要将基因M完整的扩增出来，应当选用引物a和d。
（2）由图可知，M基因内部有HindⅢ、EcoRI和BamHI的识别位点，因此切割M基因必须在这三种限制酶之间选择；neo基因两侧具有MfeI和KpnI的识别序列，切割neo基因只能在这两种限制酶之间选择，根据表中各种限制酶识别序列可知，只有MfeI与EcoRI切割得到的黏性末端相同，都为AATT—3'，因此可用EcoRI切割M基因，用MfeI切割neo基因，得到相同黏性末端之后再用DNA连接酶将其连接，即可将neo基因插入M基因中，完成打靶载体构建。
（3）将目的基因导入受体细胞时，若受体细胞是动物细胞，常采用显微注射法。
（4）打靶载体也可能整合到受体细胞基因组DNA的其他部位，引发K基因表达，使细胞在加入物质Q的培养基上无法存活。在选择培养基中除有动物细胞培养的必需成分外，还需加入新霉素和物质Q，可筛选出成功敲除M基因的受体细胞，其原因是敲除M基因的受体细胞基因组DNA含有neo基因，无K基因表达，使其具有新霉素抗性，且可在含物质Q的培养基上可存活。
23．(1)使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
(2) DNA连接酶（T4DNA连接酶、Ecoli DNA连接酶） P
(3) Ca2+（CaCl2） 卡那霉素
(4) 12h、42℃
【分析】1、PCR技术是对体内DNA复制过程的模仿，也需要模板、原料、酶和引物等。待扩增的DNA分子是模板，原料是4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基。
2、基因工程的基本操作步骤包括获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA 分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，反应体系中添加的引物作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
（2）构建基因表达载体时，要先用限制酶切割含F3L基因的DNA片段及起载体作用的质粒，使它们有可以相互连接的相同末端，然后再用DNA连接酶（或T4DNA连接酶、Ecoli DNA连接酶）把两者连接起来。据图可知，在基因表达载体中，F3L基因由P侧顺时针向T侧表达。依题意，蛋白表达诱导物质（IPTG）能促使F3L基因在大肠杆菌中表达，因此推测，其影响部位是图1中P。
（3）用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。依题意，基因表达载体中含有抗卡那霉素抗性基因，为筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，还需使用含有卡那霉素的固体培养基养基。
（4）依题意，F3L蛋白相对分子质量为24.6ku，则其在电泳图谱中的位置如图示： 。据图2甲图可知，12h培养时长对应的电泳条带最明显，推测培养重组菌的最适时长为 12h。据图2乙图可知，42℃的培养温度对应的电泳条带最明显，推测培养重组菌的最适温度为42℃。
24．(1) 便于插入多种外源基因 Ca2+处理 原核生物的复制原点
(2)线性化载体能整合到酿酒酵母染色体DNA，从而能更稳定存在并发挥功能
(3)bc
(4) 不含光敏蛋白基因的空载体 敲除该工程菌的ADHs和ALDs基因，在黑暗条件下每隔10h发出15s和65s的蓝光脉冲30min
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）图中质粒作为载体将ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因送入受体细胞中，所以质粒DNA分子上多个限制酶切位点，其作用是供外源DNA片段（基因）插入；受体细胞不同，目的基因导入的方法也不一样，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，本题中是将ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因导入大肠杆菌，因此先用CaCl2(Ca2＋)溶液处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率；将重组质粒导入大肠杆菌，由于重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。
（2）环状DNA分子首尾相接，而与环状载体相比，线性化较体能更稳定地存在并发挥功能，所以线性化载体整合到酿酒酵母染色体DNA上，能更稳定存在并发挥功能。
（3）载体中含有组氨酸合成酶基因，则成功转化的受体细胞能够自行合成组氨酸，载体中含有氨苄青霉素抗性基因，将菌株接种在不含组氨酸、含氨苄青霉素的培养基中，可以筛选出成功转化的酿酒酵母，该过程称为微生物的选择培养。选择培养使用的培养基为固体培养基，因此需要加入琼脂。
（4）①对照组为没有经过自变量处理的组，因此对照组的酵母菌需要导入不含光敏蛋白基因的空载体。②分析甲图可知E酶和F酶可催化丙酮酸转化为乙醇和乙酸，从而降低异丁醇的产量，所以可以敲除该工程菌的ADHs和ALDs基因，提高异丁醇产量，分析丙图可知在黑暗条件下每隔10h发出15s和65s的蓝光脉冲30min的一组异丁醇产量最高，所以可以在黑暗条件下每隔10h发出15s和65s的蓝光脉冲30min，来提高异丁醇产量。
25．(1) 半胱氨酸 甘氨酸 5'-TACTCCAAGA┄CCTACACCT┄GTTCTACACT-3'
(2) 伴X染色体隐性遗传 1/4
(3)④
(4)C
(5)ABCD
【分析】MYOC对视神经的影响: MYOC是通过影响小梁网的功能而对青光眼的发病产生影响， MYOC可能在巩膜筛板对视神经轴突的功能及存活产生影响,进而在青光眼的发病过程中产生作用。MYOC有可能通过改变视神经的结构、代谢以及营养支持而增加视神经对青光眼损害的易感性,从而导致青光眼的视神经损害。
【详解】（1）MYOC基因的编码链第733位碱基“T”替换为“G”所致。突变后，MYOC蛋白第245位氨基酸由半胱氨酸变为甘氨酸；若想利用PCR扩增MYOC突变基因开展研究，设计其引物的部分序列是5'-TACTCCAAGA┄CCTACACCT┄GTTCTACACT-3'。
（2）由电泳图可以看出，小李与其母亲的症状和碱基序列完全相同，而且小李的父亲与健康人完全相同，均是正常的，所以小李家系JOAG型青光眼的遗传方式是伴X染色体隐性遗传，假设控制该性状的基因为A/a，则其父亲为XAY、母亲为XAXa，其父母再生育二胎为患病男孩（XaY）的概率是1/4。
（3）一般情况下，小李体内OPN1LW突变基因与MYOC突变基因均位于X染色体上，进行重组的过程只能是减数第一次分裂四分体时期非姐妹染色单体的交叉互换，发生在④（初级精母细胞）。
（4）由题意可知，，TGF-β蛋白过量也会影响小梁网的功能，从而引发青光眼。基因的甲基化有可能不是导致其蛋白表达异常的主要原因，TGF-β蛋白过量的原因可能是TGF-β基因的mRNA上终止密码子结构改变，ABD错误、C正确。故选C。
（5）为缓解青光眼所引发的症状，可以采用的方案有移植正常的神经干细胞修复或再生视神经、阻断Bax与Bcl-2结合降低小梁网细胞凋亡、基因治疗修正MYOC突变基因并注入眼球组织、诱导多能干细胞产生小梁网细胞并注入眼球组织，ABCD正确。
故选ABCD。
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学校:___________姓名：___________班级：___________考号：___________
一、单选题
1．下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述中，正确的是（ ）
A．将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于沉淀物中
B．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液即可变为蓝色
C．对1个双链DNA分子进行PCR扩增，第n次循环共需要引物2n个
D．凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察
2．S6蛋白参与调控细胞周期，在癌细胞中表达量明显升高。为研究S6过表达的影响，将S6-GFP融合基因（GFP为绿色荧光蛋白基因）转入细胞，筛选出S6过表达细胞。在S6过表达细胞中，检测到CDH1蛋白水平明显降低。在S6基因敲除细胞中，CDH1蛋白第135位赖氨酸乙酰化水平升高。下列叙述错误的是（ ）
A．人体细胞分裂过程中，中心粒倍增与纺锤体形成的时期不同
B．在构建S6过表达细胞系时，可根据绿色荧光的强弱来挑选细胞进行培养
C．S6蛋白与CDH1蛋白结合，可能使CDH1蛋白第135位赖氨酸乙酰化水平升高
D．S6基因可能是一种原癌基因，CDH1基因可能是一种抑癌基因
3．关于“DNA的粗提取与鉴定”（实验Ⅰ）和“绿叶中色素的提取和分离”（实验Ⅱ）的相关叙述错误的是（ ）
A．两个实验都使用酒精溶解物质
B．两个实验都需要将实验材料进行充分研磨
C．实验Ⅰ粗提取的DNA呈现蓝色，实验Ⅱ提取的色素滤液呈现绿色
D．实验IDNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，实验Ⅱ各种色素在层析液中的溶解度不同
4．下列有关基因工程说法中，错误的是（ ）
A．基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿定向地改造生物，培育出新品种
B．质粒常作为基因工程的载体，是存在于细菌和酵母菌等生物细胞中的一种细胞器
C．细菌细胞内的基因可在植物细胞内表达是因为所有生物共用一套密码子
D．对于基因工程或分子生物学实验室向外排放转基因细菌等必须严加管制
5．为增加玉米的抗旱性，科研人员构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，并采用农杆菌转化法将其转入玉米幼胚组织细胞中，用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交检测后，经进一步鉴定，筛选出抗旱的转基因玉米。下列叙述错误的是（ ）
A．提取该微生物mRNA逆转录为cDNA，通过PCR可获得大量抗旱基因E
B．目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制
C．将重组质粒置于经Ca2+处理的农杆菌悬液中，可获得转化的农杆菌
D．抗原—抗体杂交检测呈阳性的植株还要通过抗旱实验进行筛选
6．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B．可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA
C．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色
D．提取的DNA可溶解在2molL的NaCl溶液中
7．研究发现，由链霉菌产生的聚酮化合物（一类精氨酸衍生物）可介导土壤环境中细菌和真菌的相互作用，具有潜在的应用价值。菌体内贮藏的脂质降解后能为聚酮化合物的合成提供大量前体物质。野生型链霉菌株聚酮化合物的产量有限，难以满足工业化生产的需求。下列叙述正确的是（ ）
A．聚酮化合物的组成元素中一定有C、H、O、N，可能含有S
B．链霉菌产生聚酮化合物时需要内质网和高尔基体的加工分类
C．减少葡萄糖供给并抑制脂质降解有助于链霉菌产生聚酮化合物
D．可利用基因工程技术改良野生型链霉菌以获得高产的新物种
8．现如今随着技术的不断发展，人们发明了多种PCR技术的衍生版本，如重叠延伸PCR、等位基因特异PCR、热不对称性PCR、荧光定量PCR、锅柄式PCR等。这些新技术在不同层面对传统PCR技术进行了较完善合理的改进。下列有关PCR的叙述正确的是（ ）
A．已知重叠延伸PCR可将两个或多个DNA片段连接起来，因此可用于较长DNA分子的人工合成
B．已知等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异，因此可用于病毒的检测与分析
C．已知热不对称性PCR可通过调节退火温度产生多种产物，因此操作时对温度的要求低于常规PCR
D．已知荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号，因此可用于亲子鉴定
9．为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。报告基因只有在真核细胞中表达，其产物才能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是（ ）
A．T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上
B．利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落
C．利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株
D．为提高基因表达载体进入农杆菌的效率，需要用Ca2+处理细胞
10．基因工程中使用特定的限制性内切核酸酶切割目的基因和质粒，便于重组质粒构建和筛选。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。已知BclⅠ的识别序列和切点是-T↓GATCA-，BglⅡ的识别序列和切点是-A↓GATCT-，MboI的识别序列和切点是-↓GATC-。下列分析错误的是（ ）
A．三种限制酶切割后获得的黏性末端相同
B．用限制酶切割右图DNA分子获得目的基因时，被水解的磷酸二酯键有4个
C．用BclI和BglⅡ切割质粒和目的基因时，形成的重组质粒的碱基排列顺序一定相同
D．若用MboI切割质粒，用BclI和BglⅡ切割目的基因，形成的重组质粒可被MboI再次切开
11．发酵工程在医药上的应用非常广泛，其中青霉素的发现和产业化生产进一步推动了发酵工程在医药领域的应用和发展。下图是生产青霉素的发酵工程流程，据图分析下列说法错误的是（ ）
A．图示生产青霉素的过程中，对菌种进行分离纯化采用了稀释涂布平板法
B．青霉素的发酵生产多采用深层通气液体发酵技术来提高产量
C．选育出高产青霉素的菌种是本发酵工程的中心环节
D．主发酵罐中发酵液的pH应调至酸性
12．中国科学家发展了一种可工作于活细胞环境的框架核酸状态智能机（如图），可以在活细胞中实现人为添加的时序信号调控的CRISPR（基因编辑）系统的分级运输、基因组定位与基因编辑功能。下列说法正确的是（ ）
A．核仁蛋白不能分布到细胞膜上，参与细胞的识别作用
B．有限状态机与向导RNA结合后，进入细胞的过程不需要消耗能量
C．cas9（核酸编辑酶：一种蛋白质）/向导RNA复合物能通过核孔进入细胞核
D．向导RNA能够通过碱基互补配对定位到特定的基因位置并切断磷酸二酯键
13．目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（ ）
A．PCR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链
B．电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关
C．选取引物甲、丙，扩增出450bp长度片段时，可以说明目的基因正接
D．选取引物甲、乙，扩增出400bp长度片段时，可以说明目的基因反接
14．研究人员对野生型(高秆)油菜的研究中偶然发现了一株矮秆突变体 ds-3，将 ds-3与野生型亲本杂交，F1为野生型，F1自交F2中高秆：矮秆=3∶1(相关基因用A、a表示)。为确定矮秆突变基因的位置，研究者根据油菜染色体上某些特定的已知 DNA 序列(如M/m、N/n) 设计了多对引物，提取上述F 群体中矮秆植株的DNA进行PCR，产物电泳后的部分结果如图2。下列有关叙述正确的是（ ）
A．由扩增结果可推知突变基因在3号染色体上
B．F1基因型为AaMmNn, F2中 AAMmNn的比例为1/16
C．单株丙出现Nn扩增结果的原因可能是7号染色体的非姐妹染色单体发生互换
D．PCR 技术基于DNA复制原理，因此只能扩增而不能获取目的基因
15．抗原检测阴性但临床仍然高度怀疑新冠病毒感染的患者，医生会建议做核酸检测。该检测实际采用的技术是RT-PCR，病毒刺突蛋白编码序列如下图所示，科研人员为该PCR分别设计了引物A （5＇-CCCTGTATGGGGTTCTAA-3＇，PCR中与b链结合）和引物B （5＇-ACGACT①TTA②CTGGTGCAG-3＇），已知引物A中ATG对应起始密码子，引物B中TTA对应终止密码子，标记基因可以插入刺突蛋白编码序列的首端或末端。下列叙述错误的是（ ）
A．图中a链的方向是自左向右为5＇→3＇
B．转录过程中b链作为模板连
C．若标记基因需要插入引物B的①或②位置中，则应选择②位置
D．获取新冠病毒的遗传物质后直接进行PCR扩增以节省出报告时间
16．利用基因工程技术培育出油脂高产的四尾栅藻，是获取生物柴油的新途径。科学家欲从紫苏中提取DGAT1基因（催化油脂合成的关键酶基因），导入到四尾栅藻细胞，获得转基因油脂高产的四尾栅藻，质粒pCAMBIA与PCR扩增出的DGAT1酶切位点如图所示。现有BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ三种限制酶，它们识别并切割的碱基序列分别为BamHI：5'—G↓GATCC—3'，BglⅡ：5'—A↓GATCT—3'，EcoR I：5'—G↓AATTC—3'。已知启动子往往具有物种特异性，质粒pCAMBIA中EcoRI酶切位点与BamHⅠ酶切位点间的最短距离为600bp。用BglⅡ酶切割DGAT1，BamHⅠ酶切割质粒，下列叙述正确的是（ ）
A．过程②进行PCR时，需要在两种引物的3'端添加限制酶Bgl Ⅱ的识别序列
B．在载体pCAMBIA 质粒中插入紫苏DGAT1基因，其上游启动子应选择紫苏的启动子
C．重组质粒若只考虑两两连接，可得到4种大小不同的连接产物
D．用EcoR I酶对不同的重组质粒进行酶切鉴定，正确连接的重组质粒酶切产物长度为2400bp和800bp
二、多选题
17．Cre-loxP系统能实现特定基因的敲除（如图1）。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列（loxP1和loxP2）串在一起，构建表达载体T（如图2）。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个loxP1之间或两个IoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法正确的是（ ）
A．Cre酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键
B．若小鼠细胞含一个表达载体T（不含Cre酶），其肌肉组织细胞呈红色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T（含Cre酶），其脑组织细胞可能呈红色或黄色或蓝色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T（含Cre酶），其脑组织细胞可能随机出现两种颜色叠加
18．干扰素是由淋巴细胞产生的一种细胞因子， 在临床上常用于治疗病毒感染性疾病，科研人员通过构建基因工程菌来生产干扰素。下图为构建工程菌的流程图，图中质粒A．上m、n分别是启动子和终止子，目的基因的b链为模板链。下列叙述错误的是（ ）
A．①过程需要逆转录酶，RNA可从淋巴细胞中获得
B．②过程需在b链5＇端加接NcoI的识别序列
C．③过程目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制
D．质粒A的复制和表达过程都遵循中心法则和碱基互补配对原则
19．东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对 Cd的富集能力，从而有 效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述错误的是（ ）
A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得
B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带
C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列
D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞
20．科研人员构建了可表达H-M3融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图所示，其中M3为水母体内的绿色荧光蛋白基因。下列有关叙述错误的是（ ）
A．构建重组质粒必须使用T4DNA连接酶
B．导入受体细胞的“融合基因”需要两个启动子和两个终止子
C．构建H-M3融合基因的目的是有利于检测H基因能否表达以及表达量
D．为确定H基因定向连接到质粒中，可选择引物组合有8种
三、非选择题
21．研究发现，大豆GmNF-YA19基因在不同非生物胁迫中均有响应。为研究该基因的功能，科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因，构建GmNF-YA19基因表达载体并转化烟草，实验过程如下图1、2所示。回答下列问题：
(1)在利用PCR扩增GmNF-YA19基因时，其原理是 ，延伸子链时需加入 酶，需要设计 种特异性引物，引物的作用是 。
(2)根据图中信息，最好选用 两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，其原因是 。
(3)基因表达载体导入烟草常用 法。有研究表明，GmNF-YA19基因对干旱胁迫的应答最显著，科研人员对GmNF-YA19转基因烟草（OE1、OE2和OE3）的抗旱性进行鉴定。对干旱处理后的WT（野生型）烟草和GmNF-YA19转基因烟草叶片的电解质渗透率及丙二醛（二者反应叶片损伤程度）、可溶性糖和脯氨酸（二者是细胞中渗透压调节物质1含量进行检测，结果如下图3所示。
由结果分析，GmNF-YA19基因调节的机理可能是干旱胁迫下， 。
22．肌肉生长抑制素MSTN是骨骼肌生长发育负调控因子，MSTN在肌肉组织中特异性表达，其活性的丧失或降低会引起动物肌肉的过度发育，表现为肌纤维直径变大或肌纤维数增加，口感良好。因此，通过基因敲除获得具有育种能力的MSTN基因突变牛十分必要。
限制酶 KpnI MfeI HindIII EcoRI BamHI
识别序列及切割位点
图2
(1)科研人员利用打靶载体敲除牛MSTN基因（以下简称M基因），载体构建及M基因敲除过程如图1所示。为构建能够敲除M基因的打靶载体，需先设计引物，通过PCR技术扩增M基因。在引物上添加PstI限制酶识别序列，限制酶识别序列添加至引物的 （填“5'端”或“3'端”），据图1应选择的引物是 （从a、b、c、d中选择），将得到的PCR产物酶切后连入打靶空载体，鉴定正确后进行后续实验。
(2)为将抗生素抗性基因neo（抵抗抗生素新霉素）从原载体中切下，随后插入M基因中。据上图1及表中限制酶信息，应选择限制酶 分别对M基因和neo基因进行酶切，并用 连接，完成打靶载体构建。
(3)将构建好的打靶载体通过 法导入牛受体细胞中。据图1，受体细胞基因组中的M基因通过交换被替换为打靶载体上插入neo基因的M基因片段。交换后的打靶载体以及未成功交换的打靶载体（线形DNA片段）很不稳定，在相关酶的作用下随即降解。
(4)载体可整合到受体细胞基因组DNA的其他部位，引发K基因表达，使细胞在加入物质Q的培养基上无法存活。在选择培养基中除有细胞培养的必需成分外，还需要加入物质Q和 ，可筛选出成功敲除M基因的受体细胞，其原因是 。
23．猴痘是由猴痘病毒引起的一种人畜共患病。研究发现其F3L蛋白可抑制宿主天然免疫。科研人员通过转基因技术，利用大肠杆菌表达F3L蛋白，进行猴痘病毒相关研究。
注：kanr为抗卡那霉素抗性基因；EcoRI、XhoI为酶切位点
回答下列问题：
(1)PCR扩增F3L基因时，反应体系中添加的引物作用是 。
(2)将PCR扩增得到的含F3L基因的DNA片段与质粒都经双酶切，再用 将两者连接，构建F3L基因表达载体。研究表明蛋白表达诱导物质（IPTG）能促使F3L基因在大肠杆菌中表达，推测其影响部位是图1中 （填字母）。
(3)大肠杆菌用 处理，然后将基因表达载体导入其中，为筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，还需使用含有 的固体培养基。
(4)重组大肠杆菌在0.6mM IPTG浓度下培养，探究不同的温度、培养时间的优化方案。将其提取的蛋白质进行电泳，结果如图2，已知F3L蛋白相对分子质量为24.6ku，请用方框在图2-乙中标出其所在位置 ，从图中可推测出培养重组菌的最适条件为 。
注：M为已知相对分子质量标准；ku为蛋白质相对分子质量
24．异丁醇具有燃值高、能量密度高等优点，其开发和利用对优化我国能源结构和保护环境有非常重要的战略意义。基于酿酒酵母的发酵途径（图甲）和图乙的质粒，研究者构建了一种表达载体pUC18，用于过表达ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因，以实现异丁醇的大规模生产。已知氨苄青霉素能抑制细菌细胞壁的形成。据此回答下列问题：
(1)图乙质粒上有多个限制酶切位点，作用是 。研究人员先用pUC18转化经 处理（处理方法）的大肠杆菌，以便筛选、鉴定扩增重组质粒。重组质粒上有 ，所以能在大肠杆菌中扩增。
(2)将环状载体pUC18导入酿酒酵母时，一般会将其进行酶切得到线性化载体，随后再将其导入受体细胞。根据所学的知识推测酶切得到线性化载体的目的是 。
(3)提取成功构建的表达载体并导入不能合成组氨酸的酿酒酵母菌株，将菌株接种在培养基中以获得单菌落，培养基中必须要添加的物质有 （用下列字母填写：a．组氨酸、b．氨苄青霉素、c琼脂）。
(4)异丁醇的大量积累会伤害细胞，研究人员给该工程菌导入一个经改造的光敏蛋白基因，使工程菌对特定的蓝光敏感。进行不同的光照处理，使其在异丁酵产生阶段和生长繁殖阶段进行切换，结果如下图丙所示。
注：5 / 10/ 20h pulse分别代表在黑暗条件下每隔5、10、20h发出15s和65s的蓝光脉冲30min
①对照组的酵母菌需要导入 。
②以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行发酵时，若想进一步提高其异丁醇产量，综合图甲和图乙信息，分别写出进一步优化菌株和工艺的措施 。
25．眼球中的小梁网由小梁网细胞构成，小梁网细胞凋亡可能引发青光眼，最终损伤视神经。线粒体是小梁网细胞凋亡的调控中心，部分机理如图（1）所示。其中APAF1为细胞凋亡激活因子；Bcl-2与Bax是调控线粒体凋亡的相关蛋白，两者结合后会使线粒体外膜通透性改变，导致线粒体内膜上的电子传递蛋白细胞色素c外流。检测发现，小李患JOAG型青光眼，该病由位于1号染色体的MYOC基因突变所致。MYOC基因编码链上部分碱基序列以及小李家庭成员MYOC基因扩增、酶切后的电泳结果如图（2）所示。
(1)研究发现，JOAG型青光眼是由MYOC基因的编码链第733位碱基“T”替换为“G”所致。突变后，MYOC蛋白第245位氨基酸由 变为 。若想利用PCR扩增MYOC突变基因开展研究，设计其引物的部分序列是 。（通用遗传密码：GAG为谷氨酸；CUC为亮氨酸；GGU为甘氨酸；UGU为半胱氨酸；ACA为苏氨酸；CCA为脯氨酸）
(2)据图（2）判断，小李家系JOAG型青光眼的遗传方式是 ，其父母再生育二胎为患病男孩的概率是 。
(3)调查发现，小李还患有红绿色盲（由OPN1LW基因突变所致）。一般情况下，小李体内OPN1LW突变基因与MYOC突变基因进行重组的过程发生在 。（编号选填）
① 精细胞 ②小梁网细胞③ 精原细胞 ④ 初级精母细胞
(4)研究还发现，TGF-β蛋白过量也会影响小梁网的功能，从而引发青光眼。据已学知识推测，TGF-β蛋白过量的原因可能是______。（单选）
A．TGF-β基因启动子区域甲基化程度下降
B．TGF-β基因启动子区域与其他蛋白质结合
C．TGF-β基因的mRNA上终止密码子结构改变
D．体内部分RNA片段与TGF-β基因转录的产物结合
(5)结合题干及已学知识推测，为缓解青光眼所引发的症状，下列方案合理的有______。（多选）
A．移植正常的神经干细胞修复或再生视神经
B．阻断Bax与Bcl-2结合降低小梁网细胞凋亡
C．基因治疗修正MYOC突变基因并注入眼球组织
D．诱导多能干细胞产生小梁网细胞并注入眼球组织
试卷第1页，共3页
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参考答案：
1．C
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：
（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。
（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中，A错误；
B、将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，在沸水浴的条件下，溶液可变为蓝色，B错误；
C、PCR 技术大量扩增目的基因时，第n 1次生成2n 1个DNA分子，第n次复制形成2n个DNA，所以需要的引物数目为（2n 2n 1）×2=2n，C正确；
D、DNA分子在凝胶载样缓冲液中带正电荷或负电荷，可用于电泳；凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，在波长为300nm的紫外灯下可以被检测出来，D错误。
故选C。
2．C
【分析】1、根据题意分析：在过表达S6的细胞中，检测到CDH1水平明显降低，在S6基因敲除细胞中，CDH1第135位赖氨酸乙酰化水平升高，推测S6蛋白与CDH1蛋白结合，可能使CDH1蛋白第135位赖氨酸乙酰化水平降低。
2、一般来说，原癌基因表达的蛋白质是细胞正常的生长和增殖所必需的，这类基因一旦突变或过量表达而导致相应蛋白质活性过强，就可能引起细胞癌变。相反，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞凋亡，这类基因一旦突变而导致相应蛋白质活性减弱或失去活性，也可能引起细胞癌变。
【详解】A、人体细胞分裂过程中，中心粒在间期倍增，进入分裂期后，在前期两组中心粒之间的星射线形成了纺锤体，A正确；
B、将S6-GFP融合基因转入细胞后，可根据绿色荧光的强弱来挑选细胞进行培养，B正确；
C、在S6过表达细胞中，检测到CDH1蛋白水平明显降低，在S6基因敲除细胞中，CDH1蛋白第135位赖氨酸乙酰化水平升高，推测S6蛋白与CDH1蛋白结合，可能使CDH1蛋白第135位赖氨酸乙酰化水平降低，C错误；
D、在癌细胞中，S6蛋白表达量明显升高，而CDH1蛋白水平明显降低，故S6基因可能是一种原癌基因，CDH1基因可能是一种抑癌基因，D正确。
故选C。
3．C
【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理：
①DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度变化而改变的，当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出；
②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液，·利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA；
③DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
【详解】A、实验Ⅰ中利用酒精溶解蛋白质的特征，实验Ⅱ中利用色素能溶解到无水乙醇中的特性，A正确；
B、实验Ⅰ中将切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，实验Ⅱ充分研磨的目的是使色素溶解到酒精中，B正确；
C、实验Ⅰ粗提取的DNA呈现白色丝状，实验Ⅱ提取的色素滤液呈现绿色，C错误；
D、实验I中DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同，据此可将DNA析出，而实验Ⅱ各种色素在层析液中的溶解度不同，因而在滤纸条上扩散的速度不同，因此能分离色素，D正确。
故选C。
4．B
【分析】基因工程的原理是基因重组，需要的工具有限制酶、DNA连接酶和运载体。
【详解】A、基因工程可以定向改造生物的性状，培育新品种，A正确；
B、质粒是存在于细菌和酵母菌等生物细胞中的一种环状DNA分子，不是细胞器，B错误；
C、所有生物共用一套密码子是细菌细胞内的基因可在植物细胞内表达的原因，C正确；
D、对于基因工程或分子生物学实验室向外排放转基因细菌等必须严加管制，避免污染环境，D正确。
故选B。
5．B
【分析】1、将目的基因导入受体细胞时根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
2、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA 是否插入目的基因常用DNA 分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA，常用分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、提取该微生物mRNA，在反转录酶的催化作用下，反转录为cDNA，再通过PCR可获得大量目的基因（抗旱基因E），A正确；
B、启动子和终止子分别负责启动和终止基因的转录过程，它们在基因表达调控中发挥着至关重要的作用，目的基因复制与复制原点有关，B错误；
C、农杆菌经钙离子处理后，成为感受态，使其易于吸收周围的DNA分子，所以将重组质粒置于经Ca2+处理的农杆菌悬液中，可获得转化的农杆菌，C正确；
D、用E蛋白的抗体进行抗原-抗体杂交，可在分子水平检测转基因玉米的抗旱性状，之后还需要个体水平的检测，即抗旱实验进行筛选，D正确。
故选B。
6．B
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、粗提取的DNA中可能含有蛋白质、脂质、糖类等，A正确；
B、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离，B错误；
C、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，C正确；
D、在DNA粗提取时，用2mol/L的NaCl溶液可以溶解DNA，D正确。
故选B。
7．A
【分析】原核细胞和真核细胞最主要的区别是原核细胞没有核膜包被的成形的细胞核，同时原核细胞也没有线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体等复杂的细胞器，具有拟核，拟核中没有染色体的存在，但是一般具有细胞壁、细胞膜、细胞质、核糖体。
【详解】A、聚酮化合物是一类精氨酸衍生物，其组成元素中一定有C、H、O、N，可能有S，A正确；
B、链霉菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，且聚酮化合物不是分泌蛋白，不需要高尔基体和内质网加工分类，B错误；
C、葡萄糖能为链霉菌的代谢活动提供能量，脂质的降解能为聚酮化合物的合成提供前体物质，故减少葡萄糖供给并抑制脂质降解不利于链霉菌产生聚酮化合物，C错误；
D、利用基因工程技术改良野生型链霉菌并不能得到一个新物种，D错误。
故选A。
8．A
【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
【详解】A、重叠延伸PCR可将多个短DNA连接成一个长DNA，可以帮助将人工合成的短DNA合成为目标长DNA，A正确；
B、等位基因特异PCR可鉴定出两个基因中单核苷酸的差异，可用于亲子鉴定以及遗传病的筛查，无法检测是否存在某种病毒，B错误；
C、热不对称性PCR需对温度进行精细控制，对温度的要求高于常规PCR，C错误；
D、荧光定量PCR可将扩增的结果表现为便于观察的荧光信号，可用于某些病毒的检测，无法判断两份DNA间的细微差别，因此无法用于亲子鉴定，D错误。
故选A。
9．B
【分析】农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。
【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据农杆菌的这一特点，将目的基因（基因G）插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因（基因G）整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，A正确；
B、农杆菌属于原核生物，含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，故不会出现农杆菌的蓝色菌落，B错误；
C、根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌会导致未转化的愈伤组织能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确；
D、用Ca2+处理细胞，使大肠杆菌处于感受态，易于吸收周围环境中的DNA分子，能提高基因表达载体进入农杆菌的效率，D正确。
故选B。
10．C
【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。
【详解】A、三种限制酶切割后获得的黏性末端相同，均为-GATC-，A正确；
B、用限制酶切割右图DNA分子获得目的基因时，两个限制酶共切割了4个位点，则断裂了4个磷酸二酯键，B正确；
C、切割质粒和切割目的基因用均用BclⅠ和BglⅡ，由题干可知，两种酶切割后产生的黏性末端相同，形成的重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，C错误；
D、切割质粒用MboⅠ，产生黏性末端且识别序列为-GATC-，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，产生黏性末端（-GATC-），形成的重组质粒中原来的BclⅠ和BglⅡ的切割位点的序列发生改变，不能再被这两种酶切割，但不影响MboⅠ的作用（能识别-GATC-），D正确。
故选C。
11．C
【分析】发酵工程以其生产条件温和、原料来源丰富且价格低廉、产物专一、废弃物对环境的污染小和容易处理等特点，在食品工业、医药工业和农牧业等许多领域得到了广泛的应用，形成了规模庞大的发酵工业。
【详解】A、对菌种分离纯化方法有平板划线法和稀释涂布平板法；据图可知在生产青霉素的过程中对菌种进行分离纯化采用了稀释涂布平板法，A正确；
B、青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；
C、在发酵罐内发酵是本发酵工程的中心环节，C错误；
D、青霉菌属于真菌，真菌培养时适宜在中性偏酸环境中生长；故培养青霉菌时一般将pH调至酸性，D正确。
故选C。
12．C
【分析】细胞核的结构：（1）核膜：核膜是双层膜，外膜上附有许多核糖体，常与内质网相连；其上有核孔，是核质之间频繁进行物质交换和信息交流的通道；（2）核仁：与某种RNA的合成以及核糖体的形成有关；（3）染色质：细胞核中能被碱性染料染成深色的物质，其主要成分是DNA和蛋白质。
【详解】AB、据图可知，有限状态机与向导RNA结合后，与分布在细胞膜上的核仁蛋白接触，进而进入细胞内，进入细胞的过程是胞吞，胞吞需要消耗能量，AB错误；
C、核孔是大分子物质进出细胞核的通道，cas9（核酸编辑酶：一种蛋白质）/向导RNA复合物能通过核孔进入细胞核，C正确；
D、向导RNA能够通过碱基互补配对定位到特定的基因位置，但不能切割磷酸二酯键，D错误。
故选C。
13．C
【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按 碱基互补配对的原则结合，再调 温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
【详解】A、退火是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，退火温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链，A正确；
B、电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小、带电量和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；
C、由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，均为450bp，C错误；
D、选取引物甲乙，扩增出400bp长度片断时，可以说明目的基因反接，若正接，不能扩增出100bp的片段，D正确。
故选C。
14．C
【分析】基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂产生配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中，随配子独立遗传给后代，同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合。
【详解】A、由图示结果可知，提取F2群体中矮秆植株的DNA进行 PCR，MM、Mm、mm序列均出现在矮秆序列中，说明矮秆基因与M/m序列自由组合，因此突变基因不在3号染色体上，子二代矮秆几乎都只含有N序列，说明矮秆基因与N序列连锁，故可将突变基因定位在7号染色体上，A错误；
B、根据题意可知，将ds-3与野生型亲本杂交，F1为野生型，F1自交F2中高秆∶矮秆=3∶1，说明矮秆为隐性性状，根据图示可知，突变型只含M和N序列，野生型只含m和n序列，故两亲本基因型可写为aaMMNN，AAmmnn，F1基因型为AaMmNn，由于a和N连锁，F2中不会出现AANn，B错误；
C、由图可知，F2矮秆植株中均含有DNA序列N，很少有n，说明矮秆基因和N位于同一条染色体上，而个别 Nn的出现可能是由于7号染色体的非姐妹染色单体发生互换，也可能是N发生了基因突变，形成了an的配子，an的配子与aN的配子结合形成了aaNn的个体，C正确；
D、PCR技术基于DNA复制原理，能用于DNA扩增也能通过PCR技术获取目的基因，D错误。
故选C。
15．D
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【详解】A、PCR过程中，引物结合在模板链3＇端，故a链的方向是自左向右为5＇→3＇，A正确；
B、从启动子的方向可知，转录方向是自左向右，b链的方向是3＇→5＇，所以b链做模板链，B正确；
C、引物B中TTA对应终止密码子，标记基因可以插入刺突蛋白编码序列的首端或末端，所以标记基因需要插入引物B的②位置，C正确；
D、新冠病毒是RNA病毒，需要先逆转录为DNA后再进行扩增，D错误。
故选D。
16．D
【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、基因的检测与鉴定。
【详解】A、过程②是通过PCR技术实现的，由②的扩增产物两端的酶切序列为BglⅡ可知，进行PCR时，需要在两种引物的5'端添加限制酶BglⅡ的识别序列，A错误；
B、要达到让紫苏DGATI基因在四尾栅藻细胞中表达的目的，应该添加四尾栅藻的启动子，B错误；
C、若只考虑DNA片段的两两连接，构建重组质粒时可得到3种大小不同的连接产物，即目的基因自连、质粒自连以及目的基因和质粒相互连接的用产物，C错误；
D、利用EcoRI限制酶切割重组质粒进行鉴定。已知质粒pCAMBLA中EcoRⅠ的酶切位点与BamHI的酶切位点间的最短距离为600bp，根据质粒pCAMBIA和DGATI基因的长度可知，若利用EcoRI限制酶切割重组质粒进行鉴定，正确连接的重组质粒酶切产物应为2400bp和800bp，A组重组质粒为所需质粒，D正确。
故选D。
17．ACD
【分析】1、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。
【详解】A、DNA单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA由两条单链螺旋缠绕形成，Cre酶切下一个待敲除基因的过程中，需要切断基因前后两端，因此需要破坏四个磷酸二酯键，A正确；
B、据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B错误；
C、1oxP1、1oxP2位置如图2黑白三角符号所示，两个loxP1和两个loxP2之 间的基因最多会被Cre酶敲除一次，将含Cre酶的病毒注入小鼠体内，Cre酶表达情况不同，识别的loxP不同，则有可能未敲除荧光蛋白基因，此时为红色(同不含Cre酶时)，也有可能敲除两个loxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色，也有可能敲除两个1oxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色，因而不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，C正确；
D、小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能出现两种颜色，D正确。
故选ACD。
18．BC
【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【详解】A、①过程为逆转录，该过程需要逆转录酶，干扰素由淋巴细胞产生，因此可从淋巴细胞中获得控制干扰素合成的mRNA，A正确；
B、b链是模板链，转录只能从模板链的3′端开始，结合图中质粒上启动子和终止子的方向分析可知，应在a链5′端加接NcoI的识别序列，b链5′端加接BamHI的识别序列，才能保证目的基因正向插入质粒，B错误；
C、③过程目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行转录，C错误；
D、质粒A的复制过程有A-T、T-A、C-G、G-C的碱基配对方式，表达过程有A-T、U-A、C-G、G-C的碱基配对方式，都遵循中心法则和碱基互补配对原则，D正确。
故选BC。
19．ABD
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、由于引物接在了目的基因的两侧，因此经过两轮PCR后，可获得与HMA3基因等长的DNA单链，故若要获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；
B、 用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；
C、构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；
D、质粒上含有潮霉素抗性基因，用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或含空质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误 。
故选ABD。
20．ABD
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接黏性末端，另外T4DNA连接酶还可以连接平末端，构建重组质粒可使用T4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶，A错误；
B、导入受体细胞内的“融合基因”需要一个启动子和一个终止子，保证转录的正常进行，B错误；
C、构建H-M3融合基因的目的是有利于检测H基因能否表达及表达量，若发现有绿色荧光则说明可正常表达，绿光越深，说明表达量越高，C正确；
D、为确定H基因定向连接到质粒中，引物组合应分别结合于H基因及左侧或右侧碱基序列，即F3-R1、F2-R1、F1-R2、F1-R3，可选择引物组合有4种，D错误。
故选ABD。
21．(1) DNA半保留复制 耐高温的DNA聚合酶 2/两 使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
(2) PvuⅡ和EcoRⅠ 保证目的基因和质粒正向连接，避免发生自身环化
(3) 农杆菌转化法 GmNF-YA19基因的表达产物促进了可溶性糖和脯氨酸的产生，同时抑制了丙二醛的产生
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA半保留复制，引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，因此延伸子链时需加入耐高温的DNA聚合酶，在利用PCR扩增GmNF-YA19基因时，由于基因结构为双螺旋结构，且在进行复制时，两条单链均可作为模板进行复制，因此，需要设计2种特异性引物，在PCR扩增过程中，引物的作用是与模板链在特定位置发生碱基互补配对，而后使DNA聚合酶从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸。
（2）根据图中信息，在质粒的启动子和终止子中间含有的限制酶为PvuⅡ、KpnⅠ和EcoRⅠ三种限制酶切割位点，由于KpnⅠ在质粒中不只一个识别位点，因此最好选用PvuⅡ和EcoRⅠ进行切割，且在目的基因的两端也存在着两种酶的识别位点，即选用PvuⅡ和EcoRⅠ两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，这样可以保证目的基因和质粒正向连接，避免发生自身环化。
（3）将目的基因表达载体导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，这里将基因表达载体导入烟草常用农杆菌转化法。实验中对干旱处理后的WT（野生型）烟草和GmNF-YA19转基因烟草叶片的电解质渗透率及丙二醛（二者反应叶片损伤程度）、可溶性糖和脯氨酸（二者是细胞中渗透压调节物质）含量进行检测，根据实验结果可知，转基因烟草在干旱胁迫下，电解质渗透率及丙二醛的含量均较野生型低，且随着干旱时间延长，叶片损伤程度加大，但均低于野生型，同时，可溶性糖和脯氨酸的含量表现为在转基因烟草均高于对照组，且随着盐胁迫时间的延长，这两种物质的含量继续上升，据此可推测，GmNF-YA19基因对干旱胁迫的调节机理可能是干旱胁迫下，GmNF-YA19基因的表达产物促进了可溶性糖和脯氨酸的产生，同时抑制了丙二醛的产生，进而降低了叶片的损伤程度，提高了植物细胞渗透压的调节能力。
22．(1) 5'端 a和d
(2) EcoRI和MfeI DNA连接酶
(3)显微注射
(4) 新霉素 成功敲除M基因的受体细胞基因组DNA含有neo基因，无K基因表达，使其具有新霉素抗性，且可在含物质Q的培养基上存活
【分析】1、引物是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
2、选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：
①不能破坏目的基因
②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）
③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。
3、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）利用PCR技术扩增DNA分子时，子链的延伸方向是从引物的5'端到3'端，因此在引物上添加PstI限制酶识别序列，限制酶识别序列应添加至引物的5'端，否则引物失效。就图中给定的a、b、c、d四种引物而言，想要将基因M完整的扩增出来，应当选用引物a和d。
（2）由图可知，M基因内部有HindⅢ、EcoRI和BamHI的识别位点，因此切割M基因必须在这三种限制酶之间选择；neo基因两侧具有MfeI和KpnI的识别序列，切割neo基因只能在这两种限制酶之间选择，根据表中各种限制酶识别序列可知，只有MfeI与EcoRI切割得到的黏性末端相同，都为AATT—3'，因此可用EcoRI切割M基因，用MfeI切割neo基因，得到相同黏性末端之后再用DNA连接酶将其连接，即可将neo基因插入M基因中，完成打靶载体构建。
（3）将目的基因导入受体细胞时，若受体细胞是动物细胞，常采用显微注射法。
（4）打靶载体也可能整合到受体细胞基因组DNA的其他部位，引发K基因表达，使细胞在加入物质Q的培养基上无法存活。在选择培养基中除有动物细胞培养的必需成分外，还需加入新霉素和物质Q，可筛选出成功敲除M基因的受体细胞，其原因是敲除M基因的受体细胞基因组DNA含有neo基因，无K基因表达，使其具有新霉素抗性，且可在含物质Q的培养基上可存活。
23．(1)使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
(2) DNA连接酶（T4DNA连接酶、Ecoli DNA连接酶） P
(3) Ca2+（CaCl2） 卡那霉素
(4) 12h、42℃
【分析】1、PCR技术是对体内DNA复制过程的模仿，也需要模板、原料、酶和引物等。待扩增的DNA分子是模板，原料是4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基。
2、基因工程的基本操作步骤包括获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA 分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物等。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，反应体系中添加的引物作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
（2）构建基因表达载体时，要先用限制酶切割含F3L基因的DNA片段及起载体作用的质粒，使它们有可以相互连接的相同末端，然后再用DNA连接酶（或T4DNA连接酶、Ecoli DNA连接酶）把两者连接起来。据图可知，在基因表达载体中，F3L基因由P侧顺时针向T侧表达。依题意，蛋白表达诱导物质（IPTG）能促使F3L基因在大肠杆菌中表达，因此推测，其影响部位是图1中P。
（3）用大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。依题意，基因表达载体中含有抗卡那霉素抗性基因，为筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，还需使用含有卡那霉素的固体培养基养基。
（4）依题意，F3L蛋白相对分子质量为24.6ku，则其在电泳图谱中的位置如图示： 。据图2甲图可知，12h培养时长对应的电泳条带最明显，推测培养重组菌的最适时长为 12h。据图2乙图可知，42℃的培养温度对应的电泳条带最明显，推测培养重组菌的最适温度为42℃。
24．(1) 便于插入多种外源基因 Ca2+处理 原核生物的复制原点
(2)线性化载体能整合到酿酒酵母染色体DNA，从而能更稳定存在并发挥功能
(3)bc
(4) 不含光敏蛋白基因的空载体 敲除该工程菌的ADHs和ALDs基因，在黑暗条件下每隔10h发出15s和65s的蓝光脉冲30min
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）图中质粒作为载体将ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因送入受体细胞中，所以质粒DNA分子上多个限制酶切位点，其作用是供外源DNA片段（基因）插入；受体细胞不同，目的基因导入的方法也不一样，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，本题中是将ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因导入大肠杆菌，因此先用CaCl2(Ca2＋)溶液处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率；将重组质粒导入大肠杆菌，由于重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。
（2）环状DNA分子首尾相接，而与环状载体相比，线性化较体能更稳定地存在并发挥功能，所以线性化载体整合到酿酒酵母染色体DNA上，能更稳定存在并发挥功能。
（3）载体中含有组氨酸合成酶基因，则成功转化的受体细胞能够自行合成组氨酸，载体中含有氨苄青霉素抗性基因，将菌株接种在不含组氨酸、含氨苄青霉素的培养基中，可以筛选出成功转化的酿酒酵母，该过程称为微生物的选择培养。选择培养使用的培养基为固体培养基，因此需要加入琼脂。
（4）①对照组为没有经过自变量处理的组，因此对照组的酵母菌需要导入不含光敏蛋白基因的空载体。②分析甲图可知E酶和F酶可催化丙酮酸转化为乙醇和乙酸，从而降低异丁醇的产量，所以可以敲除该工程菌的ADHs和ALDs基因，提高异丁醇产量，分析丙图可知在黑暗条件下每隔10h发出15s和65s的蓝光脉冲30min的一组异丁醇产量最高，所以可以在黑暗条件下每隔10h发出15s和65s的蓝光脉冲30min，来提高异丁醇产量。
25．(1) 半胱氨酸 甘氨酸 5'-TACTCCAAGA┄CCTACACCT┄GTTCTACACT-3'
(2) 伴X染色体隐性遗传 1/4
(3)④
(4)C
(5)ABCD
【分析】MYOC对视神经的影响: MYOC是通过影响小梁网的功能而对青光眼的发病产生影响， MYOC可能在巩膜筛板对视神经轴突的功能及存活产生影响,进而在青光眼的发病过程中产生作用。MYOC有可能通过改变视神经的结构、代谢以及营养支持而增加视神经对青光眼损害的易感性,从而导致青光眼的视神经损害。
【详解】（1）MYOC基因的编码链第733位碱基“T”替换为“G”所致。突变后，MYOC蛋白第245位氨基酸由半胱氨酸变为甘氨酸；若想利用PCR扩增MYOC突变基因开展研究，设计其引物的部分序列是5'-TACTCCAAGA┄CCTACACCT┄GTTCTACACT-3'。
（2）由电泳图可以看出，小李与其母亲的症状和碱基序列完全相同，而且小李的父亲与健康人完全相同，均是正常的，所以小李家系JOAG型青光眼的遗传方式是伴X染色体隐性遗传，假设控制该性状的基因为A/a，则其父亲为XAY、母亲为XAXa，其父母再生育二胎为患病男孩（XaY）的概率是1/4。
（3）一般情况下，小李体内OPN1LW突变基因与MYOC突变基因均位于X染色体上，进行重组的过程只能是减数第一次分裂四分体时期非姐妹染色单体的交叉互换，发生在④（初级精母细胞）。
（4）由题意可知，，TGF-β蛋白过量也会影响小梁网的功能，从而引发青光眼。基因的甲基化有可能不是导致其蛋白表达异常的主要原因，TGF-β蛋白过量的原因可能是TGF-β基因的mRNA上终止密码子结构改变，ABD错误、C正确。故选C。
（5）为缓解青光眼所引发的症状，可以采用的方案有移植正常的神经干细胞修复或再生视神经、阻断Bax与Bcl-2结合降低小梁网细胞凋亡、基因治疗修正MYOC突变基因并注入眼球组织、诱导多能干细胞产生小梁网细胞并注入眼球组织，ABCD正确。
故选ABCD。
答案第1页，共2页
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