第2节 基因工程的基本操作程序 课件（共33张PPT）
文档属性
| 名称 | 第2节 基因工程的基本操作程序 课件（共33张PPT） |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 1.8MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-05-19 15:49:13 | ||
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文档简介
(共33张PPT)
年 级：高二
学 科：生物学（人教版）
基因工程的基本操作程序
第1：目的基因的筛选与获取
第2：基因表达载体的构建
第3：将目的基因导入受体细胞
第4：目的基因的检测与鉴定
筛选合适的目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
通过构建基因文库获取目的基因
基因工程的基本操作程序
1.作用
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2) 同时使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成
——核心步骤
目的基因
标记基因
启动子
终止子
复制原点
二、基因表达载体的构建
(4)标记基因：将含有目的基因的细胞筛选出来
(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因
(5)复制原点：
DNA复制的起始位点
(3)终止子：
(2)启动子：
必须插入到启动子和终止子之间
eg四环素抗性基因、荧光蛋白基因等
①本质：有特殊序列结构的DNA片段
②位置：基因的上游
③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
①本质：有特殊序列结构的DNA片段
②位置：基因的下游
③功能：终止转录
3. 基因表达载体的构建过程
质粒
限制酶
限制酶切割位点
首先，用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；
01
二、基因表达载体的构建
然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
02
限制酶
限制酶切割位点
获取目的基因
目的基因
3. 基因表达载体的构建过程
二、基因表达载体的构建
利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。
03
DNA
连接酶
重组
DNA分子
获取目的基因
3. 基因表达载体的构建过程
二、基因表达载体的构建
质粒
限制酶
限制酶
DNA
连接酶
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
重组
DNA分子
限制酶切割位点
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
3. 基因表达载体的构建过程
二、基因表达载体的构建
1.在基因表达载体构建时，能不能选择Sma I？如果不能，请表述原因。
2.方案①：单独使用Pst I一种限制酶处理；方案②：同时使用Pst I、EcoR I两种限制酶处理；两种方案都可得到目的基因，哪种方案更好？为什么？
假设以下为某转基因抗虫棉品种构建基因表达载体过程中的质粒与目的基因的酶切位点示意图
思考与讨论
“单酶切”与“双酶切”构建基因表达载体
用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
a、b、c、d四个黏性末端相同
“单酶切”
单酶切有什么缺点
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
缺点1：
在DNA连接酶的作用下，质粒被重新环化。
DNA连接酶
连接
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
缺点2：
在DNA连接酶的作用下，目的基因被环化。
DNA连接酶
连接
单酶切有什么缺点
缺点3：
在DNA连接酶的作用下，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
反向连接
重组DNA
a
d
c
a
单酶切有什么缺点
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段
限制酶a切割
c
d
DNA连接酶
连接
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
a
b
“单酶切”与“双酶切”构建基因表达载体
“双酶切”
基因表达载体
导入
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。
三、将目的基因导入受体细胞
方法1：花粉管通道法
我国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞。
子房注射
用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
（一）将目的基因导入植物细胞
花粉管通道法
花柱滴加
三、将目的基因导入受体细胞
外源DNA进入受精卵，并进行随机整合。
花柱滴加
花粉落到柱头上，刺激花粉管萌发并生长至子房
01
剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管进入囊胚。
02
优点
① 利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
② 操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。
萌发的花粉管
柱头
花柱
子房
胚囊
卵细胞
花柱滴加
转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
① 农杆菌
是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
方法2：农杆菌转化法
（一）将目的基因导入植物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
① 农杆菌
方法2：农杆菌转化法
（一）将目的基因导入植物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到细胞的染色体上。
农杆菌
Ti质粒
T-DNA
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入植物细胞
含重组Ti质粒的农杆菌
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
表现出新性状的植物
目的基因
Ti质粒
②农杆菌转化法的原理
（二）将目的基因导入原核细胞
三、将目的基因导入受体细胞
导入方法（感受态细胞法）
Ca2+处理大肠杆菌细胞
细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态
将重组的基因表达载体导入
（三）将目的基因导入动物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
① 导入动物细胞通常选择受精卵。
② 导入方法：显微注射法
受精卵
注射器
固定吸管
如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因
提取棉花细胞的DNA
通过PCR等技术检测
1. 分子水平的检测
① 检测目的基因是否导入
用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
四、目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
② 检测目的基因是否转录出mRNA
通过PCR等技术检测
如：检测Bt基因是否转录出mRNA
提取棉花细胞mRNA
逆转录产生DNA
用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
四、目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
③ 检测目的基因是否翻译
抗原-抗体杂交检测
如：检测Bt基因是否翻译出Bt抗虫蛋白
从棉花中提取蛋白质
用相应抗体进行抗原-抗体杂交检测
四、目的基因的检测与鉴定
2. 个体水平的检测
检测目的基因是否表现出相应的性状
如：检测抗虫棉是否具有抗虫性状
采摘抗虫棉叶片
饲喂棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
四、目的基因的检测与鉴定
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
1. 利用PCR获取和扩增目的基因
2. 人工合成目的基因
3. 通过构建基因文库获取目的基因
基因工程的基本操作程序
3. 用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段
4. 用DNA连接酶连接
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
5. 导入植物细胞：花粉管通道法；农杆菌转化法
导入动物细胞：显微注射法
导入原核细胞：感受态细胞法
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
6. 分子水平上的检测
① 检测目的基因是否导入（PCR等技术检测）
② 检测目的基因是否转录（ PCR等技术检测）
③ 检测目的基因是否翻译（抗原-抗体检测）
7. 个体水平检测
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
转基因抗虫棉有效的控制了棉铃虫灾害，有了抗虫棉后是否就可以一劳永逸了？
在实际种植过程中，棉铃虫是否对转基因的抗虫棉产生了抗性？证据是什么？
科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对，他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗
社会责任
谢谢！
年 级：高二
学 科：生物学（人教版）
基因工程的基本操作程序
第1：目的基因的筛选与获取
第2：基因表达载体的构建
第3：将目的基因导入受体细胞
第4：目的基因的检测与鉴定
筛选合适的目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
通过构建基因文库获取目的基因
基因工程的基本操作程序
1.作用
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2) 同时使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成
——核心步骤
目的基因
标记基因
启动子
终止子
复制原点
二、基因表达载体的构建
(4)标记基因：将含有目的基因的细胞筛选出来
(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因
(5)复制原点：
DNA复制的起始位点
(3)终止子：
(2)启动子：
必须插入到启动子和终止子之间
eg四环素抗性基因、荧光蛋白基因等
①本质：有特殊序列结构的DNA片段
②位置：基因的上游
③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
①本质：有特殊序列结构的DNA片段
②位置：基因的下游
③功能：终止转录
3. 基因表达载体的构建过程
质粒
限制酶
限制酶切割位点
首先，用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；
01
二、基因表达载体的构建
然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
02
限制酶
限制酶切割位点
获取目的基因
目的基因
3. 基因表达载体的构建过程
二、基因表达载体的构建
利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。
03
DNA
连接酶
重组
DNA分子
获取目的基因
3. 基因表达载体的构建过程
二、基因表达载体的构建
质粒
限制酶
限制酶
DNA
连接酶
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
重组
DNA分子
限制酶切割位点
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
3. 基因表达载体的构建过程
二、基因表达载体的构建
1.在基因表达载体构建时，能不能选择Sma I？如果不能，请表述原因。
2.方案①：单独使用Pst I一种限制酶处理；方案②：同时使用Pst I、EcoR I两种限制酶处理；两种方案都可得到目的基因，哪种方案更好？为什么？
假设以下为某转基因抗虫棉品种构建基因表达载体过程中的质粒与目的基因的酶切位点示意图
思考与讨论
“单酶切”与“双酶切”构建基因表达载体
用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
a、b、c、d四个黏性末端相同
“单酶切”
单酶切有什么缺点
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
缺点1：
在DNA连接酶的作用下，质粒被重新环化。
DNA连接酶
连接
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
缺点2：
在DNA连接酶的作用下，目的基因被环化。
DNA连接酶
连接
单酶切有什么缺点
缺点3：
在DNA连接酶的作用下，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。
启动子
方向
目的基因转录方向
限制酶切割
a
b
c
d
DNA连接酶
连接
反向连接
重组DNA
a
d
c
a
单酶切有什么缺点
用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段
限制酶a切割
c
d
DNA连接酶
连接
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
a
b
“单酶切”与“双酶切”构建基因表达载体
“双酶切”
基因表达载体
导入
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。
三、将目的基因导入受体细胞
方法1：花粉管通道法
我国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞。
子房注射
用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中
在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
（一）将目的基因导入植物细胞
花粉管通道法
花柱滴加
三、将目的基因导入受体细胞
外源DNA进入受精卵，并进行随机整合。
花柱滴加
花粉落到柱头上，刺激花粉管萌发并生长至子房
01
剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管进入囊胚。
02
优点
① 利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
② 操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。
萌发的花粉管
柱头
花柱
子房
胚囊
卵细胞
花柱滴加
转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
① 农杆菌
是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
方法2：农杆菌转化法
（一）将目的基因导入植物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
转化：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
① 农杆菌
方法2：农杆菌转化法
（一）将目的基因导入植物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到细胞的染色体上。
农杆菌
Ti质粒
T-DNA
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
导入植物细胞
含重组Ti质粒的农杆菌
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
表现出新性状的植物
目的基因
Ti质粒
②农杆菌转化法的原理
（二）将目的基因导入原核细胞
三、将目的基因导入受体细胞
导入方法（感受态细胞法）
Ca2+处理大肠杆菌细胞
细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态
将重组的基因表达载体导入
（三）将目的基因导入动物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
① 导入动物细胞通常选择受精卵。
② 导入方法：显微注射法
受精卵
注射器
固定吸管
如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因
提取棉花细胞的DNA
通过PCR等技术检测
1. 分子水平的检测
① 检测目的基因是否导入
用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
四、目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
② 检测目的基因是否转录出mRNA
通过PCR等技术检测
如：检测Bt基因是否转录出mRNA
提取棉花细胞mRNA
逆转录产生DNA
用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
四、目的基因的检测与鉴定
1. 分子水平的检测
③ 检测目的基因是否翻译
抗原-抗体杂交检测
如：检测Bt基因是否翻译出Bt抗虫蛋白
从棉花中提取蛋白质
用相应抗体进行抗原-抗体杂交检测
四、目的基因的检测与鉴定
2. 个体水平的检测
检测目的基因是否表现出相应的性状
如：检测抗虫棉是否具有抗虫性状
采摘抗虫棉叶片
饲喂棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
四、目的基因的检测与鉴定
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
1. 利用PCR获取和扩增目的基因
2. 人工合成目的基因
3. 通过构建基因文库获取目的基因
基因工程的基本操作程序
3. 用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段
4. 用DNA连接酶连接
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
5. 导入植物细胞：花粉管通道法；农杆菌转化法
导入动物细胞：显微注射法
导入原核细胞：感受态细胞法
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
6. 分子水平上的检测
① 检测目的基因是否导入（PCR等技术检测）
② 检测目的基因是否转录（ PCR等技术检测）
③ 检测目的基因是否翻译（抗原-抗体检测）
7. 个体水平检测
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
转基因抗虫棉有效的控制了棉铃虫灾害，有了抗虫棉后是否就可以一劳永逸了？
在实际种植过程中，棉铃虫是否对转基因的抗虫棉产生了抗性？证据是什么？
科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对，他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗
社会责任
谢谢！