第2节 基因工程的基本操作程序 课件（共43张PPT）

(共43张PPT)
基因工程的基本操作程序
年 级：高二
学 科：生物学（人教版）
背景：1992年，我国北方棉铃虫连年大暴发，减产造成严重经济损失，棉农“谈虫色变”。原本种植期喷洒两三次的农药，由于一遍遍打农药产生了抗药性，接连喷洒多次也不见效果，因施药过量土壤受到极大污染，稻田无法正常耕种。
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉，2015年我国
100
抗虫棉新品种
多个
40
减少农药容量
万吨
450
增收节支社会效益
亿元
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
目的基因的筛选与获取
培育培育转基因抗虫棉主要步骤
基因表达载体的构建
目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
目的基因的筛选与获取
培育培育转基因抗虫棉主要步骤
什么是目的基因？
筛选与获取目的基因方法有哪些？
一、目的基因的筛选与获取
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因
1.目的基因
主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性
基因
生产药物
基因
毒物降解
基因
工业用酶
基因
① 定义
非编码区
非编码区
编码区
启动子
终止子
RNA聚合酶的结合位点，转录起始的信号
编码蛋白质的合成
终止RNA的合成
② 基因的结构
原核生物的基因结构
非编码区
非编码区
编码区
启动子
终止子
外显子
内含子
真核生物的基因结构
② 基因的结构
非编码区
非编码区
编码区
转录
剪接
外显子
内含子
前体mRNA
成熟mRNA
真核生物的基因结构
② 基因的结构
2. 筛选合适的目的基因
在浩瀚的“基因海洋”中找到所需要的目的基因往往不容易，从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
① 明确目的基因
已知结构和功能清晰的基因
目的基因
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只在某些昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
Bt基因
Bt抗虫蛋白
编码
苏云金杆菌
含有
测序技术
测定核酸和蛋白质序列
序列数据库(如GenBank)
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
序列对比工具(如BLAST)
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能
Q：明确了目的基因后，该怎么获得它呢？
② 筛选目的基因的技术手段
2. 筛选合适的目的基因
我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的过程中，科学家人工合成了目的基因。
DNA合成仪
① 人工合成法
在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成。
3. 获取目的基因的方法
根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
原理
② PCR扩增（聚合酶链式反应）
常用方法
PCR仪
3. 获取目的基因的方法
(1)原理：
半保留复制
(2)条件：
⑥缓冲液
②DNA模板
⑤2种引物
③4种脱氧核苷酸
④耐高温的DNA聚合酶
①高温(替代解旋酶)
② PCR扩增（聚合酶链式反应）
2种引物
短单链核酸(DNA或RNA)　　　　
本质：
作用：
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸　　　　
引物连接模板链的3’端　　　　
游离的脱氧核苷酸连接在引物的3’端　　　　
注意：1种引物会导致引物与引物之间结合形成双链，不能与模板链结合。
-3′
5′-
3′-
-5′
子链延伸
-5′
3′-
5′-
-3′
子链延伸
PCR的过程
4种脱氧核苷酸
引物
耐高温的DNA聚合酶
DNA模板
第① 步：变性
当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链。
第②步：复性
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
PCR的过程
第③步：延伸
当温度上升到72℃时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
3′
5′
5′
3′
PCR的过程
3′
5′
3′
5′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
第1轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
PCR的过程
3′
5′
3′
5′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。
PCR的过程
模板DNA
目的基因
3′
5′
5′
3′
引物1
引物2
原料
Taq聚合酶
50
72
95
℃
PCR三轮扩增过程
目的基因
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第一轮：高温变性
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第一轮：高温变性
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第一轮：高温变性
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第一轮：低温复性
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第一轮：中温延伸
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第二轮：高温变性
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第二轮：高温变性
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第二轮：低温复性
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第二轮：中温延伸
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第三轮：高温变性
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第三轮：高温变性
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第三轮：低温复性
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第三轮：中温延伸
PCR三轮扩增过程
3′
5′
5′
3′
50
72
95
℃
第三轮：中温延伸
PCR三轮扩增过程
PCR小结
①过程
变性
目的基因DNA受热变性后解为单链
复性
2种引物与单链相应互补序列结合
延伸
以DNA单链为模板，在耐高温的DNA聚合酶作用下延伸。即将4种脱氧核苷酸加到引物的 3’端
1个模板DNA分子经过n轮PCR，以指数形式扩增，可以扩增出约2n个DNA片段。　　　　
②结果：
(超过90℃)
(50℃左右)
(72℃左右)
③PCR技术获取目的基因时至少要经过3次循环才能从DNA分子中分离出目的基因
④经过n轮复制，需要引物 个
只有两条母链上没有引物
2n+1-2
⑤常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 边解旋边复制 DNA在高温下变性解旋
全部解旋后在复制
场所 主要在细胞核内 细胞外（主要在PCR扩增仪内）
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ① 模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ② 原料：均为四种脱氧核苷酸 ③ 酶：均需DNA聚合酶 ④ 引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端合成子链 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
4. 通过构建基因文库获取目的基因
基因组文库
部分基因文库
基因文库
①基因组文库
基因文库就像一座图书馆，每一个基因就是一本书。如果一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么，我们就可以说这个基因文库很大，就像国家图书馆，这种基因文库叫做基因组文库。
一种生物的一部分基因叫做部分基因文库
国家图书馆
（基因组文库）
部分基因文库
一种生物的全部基因叫做基因组文库。
4. 通过构建基因文库获取目的基因
一种生物的一部分基因叫做部分基因文库
国家图书馆
（基因组文库）
部分基因文库
一种生物的全部基因叫做基因组文库。
有一些基因文库比较小，就像某个市或某个单位的图书馆，只包含一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。如cDNA文库。
② 部分基因文库
4. 通过构建基因文库获取目的基因
利用mRNA逆转录形成的DNA片段
第1：目的基因的筛选与获取
第2：基因表达载体的构建
第3：将目的基因导入受体细胞
第4：目的基因的检测与鉴定
筛选合适的目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
通过构建基因文库获取目的基因
基因工程的基本操作程序
谢谢！