(共30张PPT)
第1节 动物细胞工程
(第一课时-动物细胞培养)
第二章 细胞工程
动物细胞融合
动物细胞培养
动物体细胞核移植
动物细胞工程
基础
新课引入
希普:首例胚胎移植成功
哈里森:首创动物组织体外培养法
张明觉:发现哺乳动物精子获能现象
格登、童第周:体细胞核移植成功
试管家兔诞生
米尔斯坦和科勒:创立单克隆抗体技术
胚胎分割移植成功
埃文斯:成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞
克隆羊多莉诞生
山中伸弥:获得诱导多能干细胞
单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴
1890年
1907年
1951年
1958年
1959年
1975年
1978年
1981年
本节聚焦
1.动物细胞培养需要哪些基本条件?
2.动物细胞培养的基本操作过程是什么?
3.怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险?
【从社会中来】P43
在治疗大面积烧伤时,通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说,自体健康皮肤非常有限,使用他人皮肤来源又不足,而且会产生免疫排斥反应。
讨论:异体移植面临的问题: 。
供体器官短缺、免疫排斥等
获得大量的自体健康皮肤的方法: 。
取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增;
皮肤干细胞培养(研究中)
通过细胞培养构建的人造皮肤
1、概念:
从动物体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后在适当的培养条件下,让这些细胞生长和增殖的技术。
2、目的:
获得细胞或细胞产物;不能获得完整动物个体。
3、原理:
细胞增殖(有丝分裂)
那么,动物细胞的培养需要哪些条件呢?
动物细胞培养
动物体
组织
单个细胞
细胞生长和增殖
取出
分散
适宜条件
01
动物细胞培养的条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素 …
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
充足的营养、稳定的内环境
将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基
含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质,满足细胞对未知营养成分的需求。
培养基的构成:合成培养基 + 血清等天然成分
一般用液体培养基,
也称为培养液
为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清?
1、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等,
2、氨基酸有多种,是细胞合成蛋白质的基本成分,其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成(称为必需氨基酸),必须由培养液提供。
3、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子;血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质,这是细胞生长和增殖所必需的,能促进细胞的生长、增殖和贴附。
4、因此,细胞培养时,要保证细胞能够顺利生长和增殖,一般需添加10%~20%的血清。
01
动物细胞培养的条件
糖类、氨基酸、无机盐、维生素 …
无菌、无毒的环境
适宜的温度、pH和渗透压
适宜的气体环境
①培养液、培养用具:灭菌处理;
②无菌操作;
③适量添加抗生素
定期更换培养液,以便清除代谢物。
①适宜的温度:哺乳动物细胞培养的温度多以___________ 为宜;
②适宜的pH:多数动物细胞生存的适宜pH为________ ;
③适宜的渗透压:
维持细胞正常的形态和功能。
36.5±0.5℃
7.2-7.4
01
动物细胞培养的条件
维持培养液的pH
95%空气 + 5%CO2 的CO2 培养箱
O2:细胞代谢所必需
CO2培养箱
松盖培养瓶
培养皿
动物
组织块
分散成
单个细胞
机械法
胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
思考 1.常用胰蛋白酶分散细胞,这说明细胞间的物质主要是什么成分? 用胃蛋白酶行吗?
说明细胞间的物质主要是蛋白质。
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2,当pH大于6时,胃蛋白酶就失去活性,多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4,胃蛋白酶在此环境中没有活性,所以用胃蛋白酶不行。
02
动物细胞培养的过程
思考2.用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理组织块,使组织分散成单个细胞的目的是什么?
①使细胞与培养液充分接触,一方面保证细胞所需氧气和营养的供应,
另一方面保证细胞内代谢产物的及时排出。
②使得在细胞水平操作的其他得以实现。
动物
组织块
分散成
单个细胞
机械法
胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
02
动物细胞培养的过程
思考3.实验过程中,胰蛋白酶处理时间过长,会出现什么结果?
细胞膜的成分中含有蛋白质,而胰蛋白酶能够水解蛋白质,因此,胰蛋白酶会把细胞消化掉。因此,胰蛋白酶处理的时间不能太长。
动物
组织块
分散成
单个细胞
机械法
胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
02
动物细胞培养的过程
动物
组织块
分散成
单个细胞
机械法
胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
加培养液
细胞悬液
02
动物细胞培养的过程
思考4.为什么要将动物组织块分散成单个细胞,制成细胞悬液?
02
动物细胞培养的过程
体外培养的动物细胞
要求:(培养瓶(皿)内表面光滑、无毒、易于贴附)
悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生长的现象;
细胞贴壁
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖的现象
接触抑制
细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等
接触抑制
悬浮生长
贴壁生长
(大多数)
肿瘤细胞失去接触抑制,
可以在培养液无限增殖下去。
动物
组织块
分散成
单个细胞
机械法
胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
思考4.为什么要将动物组织块分散成单个细胞,制成细胞悬液?
成块的组织中细胞与细胞靠在一起,彼此限制了细胞生长和增殖。
加培养液
细胞悬液
02
动物细胞培养的过程
动物
组织块
分散成
单个细胞
机械法
胰蛋白酶
胶原蛋白酶处理
加培养液
细胞悬液
原代培养
传代培养
放入培养瓶
在适宜条件中
在适宜条件中
分瓶培养
原代培养
传代培养
将分瓶之前的细胞培养,即动物组织经过处理后的初次培养称为原代培养。
将分瓶后的细胞培养称为传代培养。
02
动物细胞培养的过程
悬浮细胞
贴壁细胞
②制成细胞悬液,分瓶培养
①收集细胞
加培养液
离心法
胰蛋白酶,离心法
区分原代培养和传代培养的方法
方法
区分两种培养的关键是看用胰蛋白酶处理的对象和是否分瓶。
①分瓶前,第一次用胰蛋白酶对动物组织进行处理后的培养是原代培养。
②第二次用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,分瓶后的细胞培养为传代培养。
02
动物细胞培养的过程
放入CO2培养箱中培养
取动物组织
传代培养
制备细胞悬液
原代培养
转入培养液中
放入CO2培养箱中培养
用机械的方法,或用胰蛋白酶,胶原蛋白酶等处理的方法,将组织分散成单个细胞
分瓶培养
离心、收集细胞
02
动物细胞培养的过程
1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较,分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较,哪些细胞更易于培养?为什么?
思考·讨论
02
动物细胞培养的过程
【答案】细胞的增殖能力与供体的年龄有关,幼龄动物的细胞增殖能力强,有丝分裂旺盛,老龄动物的细胞则相反。所以,一般来说,幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样,分化程度越低的细胞,増殖能力越强,所以更容易培养。
植物组织培养和动物细胞培养的比较 P42
固体培养基
葡萄糖、动物血清
液体培养基
细胞增殖
植物细胞的全能性
许多细胞
蔗糖、植物激素
①都进行有丝分裂,不涉及减数分裂;
②均需无菌操作,需要适宜的温度、pH等条件
新的植株
外植体
↓脱分化
愈伤组织
↓再分化
芽、根或胚状体
↓生长发育
植物体
动物的组织
机械法或胰蛋白酶、
↓ 胶原蛋白酶处理
细胞悬液
↓
原代培养
↓
细胞悬液
↓
传代培养
细胞悬浮液
10代细胞
50代细胞
无限传代
原代培养
传代培养
细胞株
细胞系
如何界定原代培养和传代培养?细胞株和细胞系?
遗传物质改变
遗传物质可能改变
多数细胞固定在表面生长和分裂
随细胞增多,细胞就会停止分裂增殖
保持细胞正常二倍体核型
(遗传物质没改变)
拓展思考:正常细胞能否一直传代培养下去?
传代培养的细胞一般传至10代左右,细胞的生长就会出现停滞,大部分细胞衰老死亡。但极少数细胞能存活下来并继续传下去,一般还可以顺利地传至40~50代,部分细胞的细胞核型可能会发生改变。
一般情况下,当细胞传至50代以后会再次出现停滞,不能再传代。但有少部分细胞会克服细胞寿命限制,获得不死性,遗传物质发生改变,并朝着等同于癌细胞的方向发展,从而有可能在培养条件下无限制地传下去(不死性)。
细胞株:传代培养的10代以后的细胞,也就是能传至40~50代的细胞
细胞系:超过50代的细胞(带有癌变的特点)
动物细胞培养技术常将细胞培养至10代以内。能保持正常的二倍体核型。
03
早期胚胎中
具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞,并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。
胚胎干细胞
分布
特点
应用实例
在体外分化成心肌细胞、
神经元细胞和造血干细胞等
局限性
必须从胚胎中获取 ,涉及伦理问题;因而限制了在医学上的应用。
干细胞培养及其应用
ES细胞
成体组织或器官内
造血干细胞(骨髓、外周血和脐带血中)
神经干细胞(神经系统中)
精原干细胞(睾丸中)
具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织,不具有发育成完整个体的能力
成体干细胞
分布
举例
特点
应用实例
治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病等)
治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
造血干细胞→
神经干细胞→
治疗细胞损伤造成的疾病
03
干细胞培养及其应用
通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞
①将特定基因或特定蛋白导入细胞
(成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞)
诱导多能干细胞
概念
制备方法
应用
优点
②用小分子化合物诱导形成。
①诱导过程无须破坏胚胎;
②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞,将它移植回病人体内后,理论上可以避免免疫排斥反应。
可治疗镰状细胞贫血症;
在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展
iPS细胞
03
干细胞培养及其应用
03
干细胞培养及其应用
诱导多能干细胞
(iPS细胞)
多种体细胞
定向诱导分化
体外诱导小鼠成纤维细胞
移植
取成纤维细胞等
iPS细胞
转入相关因子
细胞发生转化
分化
胰岛细胞
神经元
血细胞
肠上皮细胞
心肌细胞
肝细胞
病人
iPS细胞用于治疗人类疾病示意图
iPS细胞的应用前景:
临床治疗人类疾病如:
白血病、帕金森病、阿而茨海默病等
动物细胞培养
课堂总结
动物细胞培养的概念和原理
干细胞培养及其应用
营养条件;无菌、无毒的环境;温度、pH和渗透压;气体环境
原理:细胞的增殖
在适当的培养条件下,让这些细胞生长和增殖的技术
干细胞的分布
干细胞的类型
干细胞的应用
胚胎干细胞( ES细胞)
成体干细胞
动物细胞培养的条件
动物细胞培养的过程
取动物组织
单个细胞
细胞悬液
原代培养
传代培养
早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中
主要应用在医学上
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考
(1)由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间,因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑,如果要将这些细胞用于紧急情况,应该提前采取什么措施
像建立骨髓库一样,尝试建立iPS细胞库,可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞,这样不仅可以节省时间、成本,还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。
二.拓展应用
练习与应用(P47)
现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考
(2)如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟,该技术可能会有哪些应用?又可能带来哪些问题?
该技术可能被用于治疗不孕症;获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究;获得生殖细胞进行转基因操作,再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。
该技术可能带来一系列的伦理问题。例如,如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子,两者受精可能培育出“单亲”婴儿;有的人还可能有目的地选择iPS细胞,从而“设计”婴儿。
二.拓展应用
练习与应用(P47)