3-1重组DNA技术的基本工具(教学课件)高中生物人教版 (2019)选择性必修3(共37张PPT)
文档属性
| 名称 | 3-1重组DNA技术的基本工具(教学课件)高中生物人教版 (2019)选择性必修3(共37张PPT) |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 5.3MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-06-28 21:59:44 | ||
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文档简介
(共37张PPT)
转基因抗虫棉
普通棉花
·苏云金杆菌
第3章 基因工程
毒蛋白—→ ·杀死害虫
·毒蛋白基因
·
>>> 什么是基因工程
指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出
更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA 分子水
平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA 技术。
【归纳定义】工程别名： 重组DNA技术
操作对象： 基因
操作水平： DNA 分子水平
工程实质： 基因重组
第1节重组DNA 技术的基本工具
第3章基因工程
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当 番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。
科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出 了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA 双螺旋的直径只有2nm, 对如此微小 的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更 需要专门的“分子工具”。
那么,科学家究竟用到了哪些“分子工具” 这些“分子工具”各具有什么特征呢
从社会中来
转基因番木瓜(左)与非转基因番木瓜(右)
①DNA 的基本组成单位相同
②都遵循碱基互补配对原则
③DNA 分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
为什么不同生物的DNA 分子能拼接起来
准端的N李 的帮恩霞属要集细断体鳗揉时A分子
“分基因是控制生物性状的独立遗传单 位 “分子运输车”
限制性海物界共用一套遗传密通接酶
切核酸酵传信息的传递都遵循中心法则
重组 导入 DNA分子
“切割” “拼接”
番木瓜体细胞
抗病毒 基因
载体
表达
01 “分子手术刀”----限制性内切核酸酶(限制酶)
1、 来 源 ：主要来自原核生物
2、 种 类 ：数千种(限制酶不是一种酶，而是一类酶)
限制酶是如何命名的呢 是用生物属
名的头一个字母与种加词的头两个字母，组
成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是
从哪种生物中分离出来的。例如， 一种限制
基因工程
酶是从大肠杆菌(Escherichia coli)的 R型
菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果
它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一
种限制酶，则进一步表示成EcoRI。
粘质沙雷氏杆菌
( Serratia marcesens)
大肠杆菌
( Escherichia coliR)
Sma I 限制酶
EcoRI 限制酶
限制酶名字的由来
资料卡
EcoR I限制酶
只能识别GAATTC
序列，并在G与A 之间切割
Sma I限 制 酶
只能识别CCCGGG
序列，并在C与G 之间切割
基因工程
01 “分子手术刀”----限制性内切核酸酶(限制酶)
3. 作用特点： (1) 识 别双链DNA分子的特定核苷酸序列
( 2 ) 使 每 一 条 链 中特定部位的磷酸二酯键断开。
5’
磷酸二酯键
G
EcoR I 5'... G- A-A-T-T-C......3'
3'.....C-T-T-A-A-G....
Sam I 5'....C-C-C-G-G-G.....3’
3'.....G-G-G-C-C-C.....5’
BamH I 5’......G-G-A-T-C-C.....3’
3'.....C-C-T-A-G -( ......5’
Taq I 5'.......T-C-G-A.....3’
3'........A-G-C-T......5’
①大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸
组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个 或其他数量的核苷酸组成。
②能被限制酶特异性识别的切割位点一 般都具有回文序列：即在切割位点， DNA —条链正向读的碱基序列与另一条 反向读的碱基序列完全一致。
仔细观察左侧四种限制酶识别的特定序 列有何特点
01 “分子手术刀”----限制性内切核酸酶(限制酶) 读：5′ → 3′
基因工程
1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征( D )
A. GAATTC B. GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C. CTGCAG D. CTAAATC
GACGTC GATTTAG
【反馈练习】
01“分子手术刀”----限制性内切核酸酶(限制酶)
5.切割结果：产生黏性末端或平末端
3 1
5’
黏性末端
3’
5’
平末端
3’ 5’
C C G G G
G
3’
5’
Sam I
(在G与C之间切割)
3’
5’
EcoR I
(在G与A之间切割)
3’
G
C
中轴线
基因工程
3’
5'
5’
3’
C
BamH I —GGATCC— —CCTAGG— EcoR I 1 —GAATTC— —CTTAAG— Hind Ⅲ L —AAGCTT— —TTCGAA—
Bgl Ⅱ
—AGATCT—
—TCTAGA—
思考：你从中发现什么现象了
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
同种限制酶产生的黏性末端相同
BamH I GATC
EcoR IAATT
HindIIA GCT
BglII GATC
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
限制性核酸内切酶
II 00:00 ·
00:21
g1 g2 g3
CT CAT GAA TTC CGTAGAAT T CCC TAA
GAAGTACTTAAGGCATCTTAAGGGATI
CTTCATG AATTCCGTAG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGCATCTTAA GGGATT
现有一段DNA, 含 有g1、g2、g3,
g1 g2
若要将g2 提取出来，如何操作
g3
· 需 要 有2 个酶切位点 · 产 生4 个末端 共产生，4 个磷酸基团
5
使用EcoR I酶剪切
3,
识别序列
GAATTC
拓展思维
3
5
1
④AATTC...
G...
D.以上都不对
②...G
...CTTAA
B.①②;③④
①..CTGCA
...G
③ ②④
③ G...
ACGTC...
C.①④;②③
C T G C A
G
【反馈练习】
G
C G T C
缺口怎么办
③
02“分子缝合针”----DNA 连接酶
1. 作 用 ：将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸
之间的磷酸二酯键。
注意：用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键
不是连接氢键(氢键的形成不需要酶的催化)
两DNA片段要具
有相同且互补的 黏性末端才能拼 起来
A T A T
基因工程
02 “分子缝合针”----DNA 连接酶
2. 种 类： ① E.coliDNA 连接酶
·从大肠杆菌中分离得到
· 只 能连接互补黏性末端 的DNA 片段
②T4 DNA连接酶
· 从T4噬菌体中分离得到
· 黏性末端和平末端均能 连接，但连接平末端的 效率相对较低。
黏性末端
平末端
基因工程
02 “分子缝合针”----DNA连接酶
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗 为什么
DNA 聚合酶NA 聚舍酶聚出酶聚合酶
A
A
T
基因工程
T
DNA连接酶
DNA聚合酶
相 同 作用实质 都能催化形成磷酸二酯键
化学本质 都是蛋白质
不 同 点 模板 不需要
需要DNA的一条
链作模板
作用对象 在两个DNA片段之间 形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接
到已有的DNA片段上，
形成磷酸二酯键
作用结果 形成完整的重组 DNA分子
形成DNA的一条链
用途 基因工程
DNA复制
课堂归纳 DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
b
C
a
A.切断a处的酶为
B.连接a处的酶为 C.切断b处的酶为
聚合酶⑤RNA 聚合酶
a: 磷酸二酯键；b: 氢键
3.根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶②解旋酶③DNA 连接酶④DNA
【反馈练习】
4.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、
DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A.①②③④ B.①②④③ C.①④②③D.①④③②
【反馈练习】
03“ 分子运输车”----基因进入细胞的载体
1.作用：将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制
质粒 拟核DNA 质粒
2.种类 动植物病毒
噬菌体
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真
核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外， 氨苄青霉素
并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 抗性基因 复制原点
基因工程
点
因
位
基
入
的
插
目
大肠杆菌细胞
03“ 分子运输车”----基因进入细胞的载体
3、 载体需具备的条件
①有一个至多个限制酶切割位点
——供外源DNA片段(目的基因)插入其中
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA 上，随受体DNA 同步复制。
③具有标记基因——便于重组DNA分子的筛选
④对受体细胞无害、易分离
氨苄青霉素
抗性基因
★真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒
的基础上进行过人工改造的。
插入位点
复制原点
基因工程
目的基因 插入位点
氨苄青霉素
抗性基因
复制原点
03 “分子运输车”----基因进入细胞的载体
如何利用标记基因的筛选呢
50μg/ml 氨苄青霉素
包含质粒
不包含质粒
大肠杆菌-部 分包括RP4
选择培养基
普通培养基
不含抗生素
基因工程
age site Cleavage by EcoRI endonuclease nd Annealing
人的DNA分子
EcoRI
用EcoR I 限制酶切
割
DNA ligase
DNA连接酶
用DNA 连 接酶粘合
基因工程
计划让大肠杆菌表达人类生长激素
用EcoR I 限制酶切
割
0011tt1
Cleavage site
Plasmid chimera
质粒
5'-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3'
3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5'
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切
割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下 面那条DNA 链上切下的片段重组到上面那条DNA 链的切口处，并用透 明胶条将切口粘连起来。
请在两张纸上分别写上下面两段DNA 序列：
5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'
3 -TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA 连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或 连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3. 你插入的DNA 片段能称得上一个基因吗
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
视频演示：重组DNA分子
1)来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
2)作用：识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
3)作用结果：产生黏性末端、平末端
2.“分子缝合线”— DNA 连接酶
1)作用：将不同的DNA片段连接起来
2)分类：E.Coli DNA连接酶、T DNA 连接酶(来源、区别 )
3.“分子运输车”——载体
1)作用：将外源基因送入受体细胞
2)种类：质粒(最常用)、噬菌体、动植物病毒
3)应具备条件：
①有一个至多个限制酶切割位点——供外源DNA片段(目的基因)插入其中
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA 上，随受体DNA 同步复制。
③具有标记基因——便于重组DNA分子的筛选 ④对受体细胞无害
课堂小结
1. “分子手术刀”——限制酶
作用部位：磷酸二酯键
一 、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( C )
A.能连接DNA 分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA 片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA 片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是( A )
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
细菌不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移
到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
练习与应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
二 、拓展应用
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶Spel 切割A片段
产生的DNA片段相连接 为什么
Xba I。因 为Xbal与Spel切割产生了相同的黏性末端。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B,A 片段用限制酶Spel进行切割，B片 段分别用限制酶HindII 、Xbal 、EcoRV 和Xhol进行切割。各限制酶的识 别序列和切割位点如下。
SpeI
Hind Ⅲ
XbaI
EcoRV 5′-GATATC-3
XhoI
04 DNA 的粗提取与鉴定 实验原理
DNA、RNA、 蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差
异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
DNA不溶于酒精，但某 些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓 度为2mol/L 的NaCl 溶液
在一定温度下(沸水浴), DNA被二苯胺试剂染成蓝色
基因工程
初步分离DNA
溶解DNA
鉴定DNA
度
0 0.14
NaCI浓度 (mol/L)
和蛋白质
D N A 溶 解
1.选材：
DNA 含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
(注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没
有细胞核和线粒体，几乎不含DNA 。) SDS:使蛋白质变性与DNA 分离；
2.试剂： 洗涤剂 EDTA:是一种DNA 酶的抑制剂，可
①研磨液——溶解并提取DNA 防止细胞破碎后DNA酶降解DNA;
②体积分数为95%的酒精——析出D NA Tris:提供缓冲体系，使DNA稳定。
③2mol/L的NaCl溶液 ——溶解DNA
④二苯胺试剂——鉴定DNA, 要现配现用
⑤蒸馏水
基因工程
研磨液、二苯胺的配制方法
课本P117
04 DNA 的粗提取与鉴定 材料用具
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取_上清液；或将研
磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液。 可能含有DNA、RNA以及
蛋白质、脂质、糖类等。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2~3min, 溶液中出
现的_白色丝状物_就是粗提取的DNA。
04 DNA 的粗提取与鉴定 方法步骤
破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA
1.破碎细胞- 称取 洋葱，切碎，放入研钵，倒入研磨液 充分研磨。
用玻璃棒沿一个方向搅拌 离心，取沉淀物晾干。
卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中
→避免破坏DNA
过滤能用滤纸代替吗 不可以，因为DNA 会被吸附到滤纸上而大量损失。
2.去除杂质—
3.DNA 的析出一
析出DNA
在等体积的NaCl 溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
基因工程
将丝状物或沉淀物溶于 2 mol/L的NaCl 溶液中，加入
二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
思考：如何评价结果
空白对照组：
DNA 纯度——看提取物颜色
DNA 的量 ——看与二苯胺反应颜色的深浅
方法步骤
4.DNA 的鉴定一
DNA 的粗提取与鉴定
04
五 .思考与讨论：
(1)选什么样的材料实验更易成功 用洋葱做材料，为什么要充分研磨
含DNA 的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
(2)猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA 的材料 操作时如何防止血液凝固
猪血(哺乳动物的成熟红细胞)无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA, 且 核DNA的量较多，适合.
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
(3)如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA 吗
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA 。 如果是猪肝呢
基因工程
绝大多数生物的遗传物质是DNA
基因工程 视频演示：DNA的粗提取与鉴定
转基因抗虫棉
普通棉花
·苏云金杆菌
第3章 基因工程
毒蛋白—→ ·杀死害虫
·毒蛋白基因
·
>>> 什么是基因工程
指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出
更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA 分子水
平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA 技术。
【归纳定义】工程别名： 重组DNA技术
操作对象： 基因
操作水平： DNA 分子水平
工程实质： 基因重组
第1节重组DNA 技术的基本工具
第3章基因工程
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当 番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。
科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出 了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA 双螺旋的直径只有2nm, 对如此微小 的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更 需要专门的“分子工具”。
那么,科学家究竟用到了哪些“分子工具” 这些“分子工具”各具有什么特征呢
从社会中来
转基因番木瓜(左)与非转基因番木瓜(右)
①DNA 的基本组成单位相同
②都遵循碱基互补配对原则
③DNA 分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
为什么不同生物的DNA 分子能拼接起来
准端的N李 的帮恩霞属要集细断体鳗揉时A分子
“分基因是控制生物性状的独立遗传单 位 “分子运输车”
限制性海物界共用一套遗传密通接酶
切核酸酵传信息的传递都遵循中心法则
重组 导入 DNA分子
“切割” “拼接”
番木瓜体细胞
抗病毒 基因
载体
表达
01 “分子手术刀”----限制性内切核酸酶(限制酶)
1、 来 源 ：主要来自原核生物
2、 种 类 ：数千种(限制酶不是一种酶，而是一类酶)
限制酶是如何命名的呢 是用生物属
名的头一个字母与种加词的头两个字母，组
成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是
从哪种生物中分离出来的。例如， 一种限制
基因工程
酶是从大肠杆菌(Escherichia coli)的 R型
菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果
它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一
种限制酶，则进一步表示成EcoRI。
粘质沙雷氏杆菌
( Serratia marcesens)
大肠杆菌
( Escherichia coliR)
Sma I 限制酶
EcoRI 限制酶
限制酶名字的由来
资料卡
EcoR I限制酶
只能识别GAATTC
序列，并在G与A 之间切割
Sma I限 制 酶
只能识别CCCGGG
序列，并在C与G 之间切割
基因工程
01 “分子手术刀”----限制性内切核酸酶(限制酶)
3. 作用特点： (1) 识 别双链DNA分子的特定核苷酸序列
( 2 ) 使 每 一 条 链 中特定部位的磷酸二酯键断开。
5’
磷酸二酯键
G
EcoR I 5'... G- A-A-T-T-C......3'
3'.....C-T-T-A-A-G....
Sam I 5'....C-C-C-G-G-G.....3’
3'.....G-G-G-C-C-C.....5’
BamH I 5’......G-G-A-T-C-C.....3’
3'.....C-C-T-A-G -( ......5’
Taq I 5'.......T-C-G-A.....3’
3'........A-G-C-T......5’
①大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸
组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个 或其他数量的核苷酸组成。
②能被限制酶特异性识别的切割位点一 般都具有回文序列：即在切割位点， DNA —条链正向读的碱基序列与另一条 反向读的碱基序列完全一致。
仔细观察左侧四种限制酶识别的特定序 列有何特点
01 “分子手术刀”----限制性内切核酸酶(限制酶) 读：5′ → 3′
基因工程
1.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征( D )
A. GAATTC B. GGGGCCCC
CTTAAG CCCCGGGG
C. CTGCAG D. CTAAATC
GACGTC GATTTAG
【反馈练习】
01“分子手术刀”----限制性内切核酸酶(限制酶)
5.切割结果：产生黏性末端或平末端
3 1
5’
黏性末端
3’
5’
平末端
3’ 5’
C C G G G
G
3’
5’
Sam I
(在G与C之间切割)
3’
5’
EcoR I
(在G与A之间切割)
3’
G
C
中轴线
基因工程
3’
5'
5’
3’
C
BamH I —GGATCC— —CCTAGG— EcoR I 1 —GAATTC— —CTTAAG— Hind Ⅲ L —AAGCTT— —TTCGAA—
Bgl Ⅱ
—AGATCT—
—TCTAGA—
思考：你从中发现什么现象了
不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
同种限制酶产生的黏性末端相同
BamH I GATC
EcoR IAATT
HindIIA GCT
BglII GATC
写出下列限制酶切割形成的黏性末端
限制性核酸内切酶
II 00:00 ·
00:21
g1 g2 g3
CT CAT GAA TTC CGTAGAAT T CCC TAA
GAAGTACTTAAGGCATCTTAAGGGATI
CTTCATG AATTCCGTAG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGCATCTTAA GGGATT
现有一段DNA, 含 有g1、g2、g3,
g1 g2
若要将g2 提取出来，如何操作
g3
· 需 要 有2 个酶切位点 · 产 生4 个末端 共产生，4 个磷酸基团
5
使用EcoR I酶剪切
3,
识别序列
GAATTC
拓展思维
3
5
1
④AATTC...
G...
D.以上都不对
②...G
...CTTAA
B.①②;③④
①..CTGCA
...G
③ ②④
③ G...
ACGTC...
C.①④;②③
C T G C A
G
【反馈练习】
G
C G T C
缺口怎么办
③
02“分子缝合针”----DNA 连接酶
1. 作 用 ：将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸
之间的磷酸二酯键。
注意：用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键
不是连接氢键(氢键的形成不需要酶的催化)
两DNA片段要具
有相同且互补的 黏性末端才能拼 起来
A T A T
基因工程
02 “分子缝合针”----DNA 连接酶
2. 种 类： ① E.coliDNA 连接酶
·从大肠杆菌中分离得到
· 只 能连接互补黏性末端 的DNA 片段
②T4 DNA连接酶
· 从T4噬菌体中分离得到
· 黏性末端和平末端均能 连接，但连接平末端的 效率相对较低。
黏性末端
平末端
基因工程
02 “分子缝合针”----DNA连接酶
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗 为什么
DNA 聚合酶NA 聚舍酶聚出酶聚合酶
A
A
T
基因工程
T
DNA连接酶
DNA聚合酶
相 同 作用实质 都能催化形成磷酸二酯键
化学本质 都是蛋白质
不 同 点 模板 不需要
需要DNA的一条
链作模板
作用对象 在两个DNA片段之间 形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接
到已有的DNA片段上，
形成磷酸二酯键
作用结果 形成完整的重组 DNA分子
形成DNA的一条链
用途 基因工程
DNA复制
课堂归纳 DNA连接酶和DNA聚合酶功能比较
b
C
a
A.切断a处的酶为
B.连接a处的酶为 C.切断b处的酶为
聚合酶⑤RNA 聚合酶
a: 磷酸二酯键；b: 氢键
3.根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶②解旋酶③DNA 连接酶④DNA
【反馈练习】
4.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、
DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A.①②③④ B.①②④③ C.①④②③D.①④③②
【反馈练习】
03“ 分子运输车”----基因进入细胞的载体
1.作用：将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制
质粒 拟核DNA 质粒
2.种类 动植物病毒
噬菌体
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真
核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外， 氨苄青霉素
并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 抗性基因 复制原点
基因工程
点
因
位
基
入
的
插
目
大肠杆菌细胞
03“ 分子运输车”----基因进入细胞的载体
3、 载体需具备的条件
①有一个至多个限制酶切割位点
——供外源DNA片段(目的基因)插入其中
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA 上，随受体DNA 同步复制。
③具有标记基因——便于重组DNA分子的筛选
④对受体细胞无害、易分离
氨苄青霉素
抗性基因
★真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒
的基础上进行过人工改造的。
插入位点
复制原点
基因工程
目的基因 插入位点
氨苄青霉素
抗性基因
复制原点
03 “分子运输车”----基因进入细胞的载体
如何利用标记基因的筛选呢
50μg/ml 氨苄青霉素
包含质粒
不包含质粒
大肠杆菌-部 分包括RP4
选择培养基
普通培养基
不含抗生素
基因工程
age site Cleavage by EcoRI endonuclease nd Annealing
人的DNA分子
EcoRI
用EcoR I 限制酶切
割
DNA ligase
DNA连接酶
用DNA 连 接酶粘合
基因工程
计划让大肠杆菌表达人类生长激素
用EcoR I 限制酶切
割
0011tt1
Cleavage site
Plasmid chimera
质粒
5'-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAC-3'
3'-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG-5'
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切
割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下 面那条DNA 链上切下的片段重组到上面那条DNA 链的切口处，并用透 明胶条将切口粘连起来。
请在两张纸上分别写上下面两段DNA 序列：
5'-ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC-3'
3 -TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG-5'
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA 连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对 如果不能，可能是什么原因造成的
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或 连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3. 你插入的DNA 片段能称得上一个基因吗
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
视频演示：重组DNA分子
1)来源：主要从原核生物中分离纯化出来。
2)作用：识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
3)作用结果：产生黏性末端、平末端
2.“分子缝合线”— DNA 连接酶
1)作用：将不同的DNA片段连接起来
2)分类：E.Coli DNA连接酶、T DNA 连接酶(来源、区别 )
3.“分子运输车”——载体
1)作用：将外源基因送入受体细胞
2)种类：质粒(最常用)、噬菌体、动植物病毒
3)应具备条件：
①有一个至多个限制酶切割位点——供外源DNA片段(目的基因)插入其中
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA 上，随受体DNA 同步复制。
③具有标记基因——便于重组DNA分子的筛选 ④对受体细胞无害
课堂小结
1. “分子手术刀”——限制酶
作用部位：磷酸二酯键
一 、概念检测
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( C )
A.能连接DNA 分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.只能连接双链DNA 片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA 片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是( A )
A.大肠杆菌的质粒
B.切割DNA分子的酶
C.DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
细菌不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移
到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
练习与应用
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子
二 、拓展应用
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶Spel 切割A片段
产生的DNA片段相连接 为什么
Xba I。因 为Xbal与Spel切割产生了相同的黏性末端。
2.有2个不同来源的DNA片段A和B,A 片段用限制酶Spel进行切割，B片 段分别用限制酶HindII 、Xbal 、EcoRV 和Xhol进行切割。各限制酶的识 别序列和切割位点如下。
SpeI
Hind Ⅲ
XbaI
EcoRV 5′-GATATC-3
XhoI
04 DNA 的粗提取与鉴定 实验原理
DNA、RNA、 蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差
异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
DNA不溶于酒精，但某 些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓 度为2mol/L 的NaCl 溶液
在一定温度下(沸水浴), DNA被二苯胺试剂染成蓝色
基因工程
初步分离DNA
溶解DNA
鉴定DNA
度
0 0.14
NaCI浓度 (mol/L)
和蛋白质
D N A 溶 解
1.选材：
DNA 含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。
(注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没
有细胞核和线粒体，几乎不含DNA 。) SDS:使蛋白质变性与DNA 分离；
2.试剂： 洗涤剂 EDTA:是一种DNA 酶的抑制剂，可
①研磨液——溶解并提取DNA 防止细胞破碎后DNA酶降解DNA;
②体积分数为95%的酒精——析出D NA Tris:提供缓冲体系，使DNA稳定。
③2mol/L的NaCl溶液 ——溶解DNA
④二苯胺试剂——鉴定DNA, 要现配现用
⑤蒸馏水
基因工程
研磨液、二苯胺的配制方法
课本P117
04 DNA 的粗提取与鉴定 材料用具
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取_上清液；或将研
磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液。 可能含有DNA、RNA以及
蛋白质、脂质、糖类等。
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液，静置2~3min, 溶液中出
现的_白色丝状物_就是粗提取的DNA。
04 DNA 的粗提取与鉴定 方法步骤
破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA
1.破碎细胞- 称取 洋葱，切碎，放入研钵，倒入研磨液 充分研磨。
用玻璃棒沿一个方向搅拌 离心，取沉淀物晾干。
卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中
→避免破坏DNA
过滤能用滤纸代替吗 不可以，因为DNA 会被吸附到滤纸上而大量损失。
2.去除杂质—
3.DNA 的析出一
析出DNA
在等体积的NaCl 溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
基因工程
将丝状物或沉淀物溶于 2 mol/L的NaCl 溶液中，加入
二苯胺试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
思考：如何评价结果
空白对照组：
DNA 纯度——看提取物颜色
DNA 的量 ——看与二苯胺反应颜色的深浅
方法步骤
4.DNA 的鉴定一
DNA 的粗提取与鉴定
04
五 .思考与讨论：
(1)选什么样的材料实验更易成功 用洋葱做材料，为什么要充分研磨
含DNA 的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
(2)猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA 的材料 操作时如何防止血液凝固
猪血(哺乳动物的成熟红细胞)无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA, 且 核DNA的量较多，适合.
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
(3)如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA 吗
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA 。 如果是猪肝呢
基因工程
绝大多数生物的遗传物质是DNA
基因工程 视频演示：DNA的粗提取与鉴定