3.2基因工程的基本操作程序-高中生物学人教版（2019）选择性必修三(课件共44张PPT)

(共44张PPT)
3.2基因工程的基本操作程序
04
第四步：目的
基因的检测与
鉴定
01
第一步：目的
基因的筛选与
获取
02
第二步：基因 表达载体的构
建
03
第三步：将目
的基因导入受
体细胞
目录/CONTENTS
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国 已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会 经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗
科学家将苏云金杆菌的“杀虫基因” ——Bt抗虫蛋白基因转到棉花里，
让棉花也能产生Bt抗虫蛋白(苏云金杆菌伴胞晶体蛋白)——破坏鳞翅目 昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
01 课堂导入
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种 植的过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其 中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量 减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝 收。大量施用农药杀虫，不仅会提高生产成本， 还可能造成农产品和环境的污染。
转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡， 左)与非转基因抗虫棉(右)
普通棉花
(无抗虫特性)
导入
3.将目的基因 导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
课堂导入
苏云金杆菌
与载体拼接
2.基因表达
载体的构建
棉花细胞
(含抗虫基因)
1.目的基因的
筛选与获取
(含有并表达抗虫基因)
重组DNA 分子
提取
Part 01
第一步：目的基因 的筛选与获取
掌握了Bt基因的序列信息
Bt蛋白分解为多肽后，与害虫肠上皮细胞的特异性受
体结合，导致细胞膜穿孔，造成害虫死亡。
Bt蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒 性，人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性 受体。
第一步：目的基因的筛选与获取
主要指编码蛋白质的基因。
从相关已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
目的基因用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
Bt基因是
培育转基 因抗虫棉 较为合适 的目的基
因
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，用于防治棉花虫害已有多年历史
苏云金杆
菌的杀虫 作用与Bt 基因有关
第一步：目的基因的筛选与获取
筛选目的基因最有效的方法之一是从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
随着测序技术的发展，以及序列数据库(GenBank)、 序列比对工具(如BLAST)
等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供
了更多的机会和可能。
实例： 苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害
苏云金杆菌的杀虫作用于Bt 基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
对Bt基因的表达产物-Bt 抗虫蛋白 有较为深入的了解
Bt基因是培育转基因
抗虫棉较为合适的目
的基因
获取目的基因的方法：
[基因组文库(某生物全部基因)
部分基因文库(主要是cDNA文库)
②人工合成 前 提 ：基因比较小、核苷酸序列已知
方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成
③利用PCR获取和扩增目的基因
第一步：目的基因的筛选与获取
①从基因文库中获取
(1)特点：
半保留复制、边解旋边复制
模 板 ：DNA的两条链
(2)条件： 原 料 ：4种游离的脱氧核苷酸
能量：ATP
酶 ：DNA 解旋酶、DNA 聚合酶等
5’
DNA 聚合酶
解旋酶
四种脱氧核苷酸
5’
(3)复制原则：碱基互补配对原则( A与T、C 与G 配对保证复制的准确进行)
DNA的 复 制
子链(新合成的链)
3’
母链(模板链)
5’
01
3’
只能从57一端→3'—端延伸，细胞内有RNA
引物结合到模板3′一端引发子链的延伸
DNA的复制
5'端到3'端
D N A 聚 合 酶
4种脱氧核苷酸
(dNTP)
温度上升到90℃以上，双链DNA 解聚 为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物 通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4 种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶 的作用下合成新的DNA链。
利用PCR 获取和扩增目的基因
1.原理：DNA半保留复制
2.条件：模板(目的基因)、2 种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA 聚合酶、 缓冲溶液(含Mg +)
3.过程：待
(模板)
A 片段
M
的DN
M
扩增
M
耐高温的DNA聚合酶
(Taq酶)
复性
延伸
!
引物
变性
5’
利用PCR 获取和扩增目的基因
PCR 过程可以在PCR 扩
增 仪(PCR 仪)中自动完成。
中温(72℃)延伸
Taq酶从引物起始 进行子链的合成
低温(50℃)复性
引物结合到互补DNA 链
高温(95℃)变性
DNA解链为单链
预变性 90℃以上 增加大分子模板DNA彻底变性的概率
5' 3’
长度相同但C-G含量高的
3'
第1步：变性
5' TTTTTTTTTTTTTTTTTITTTTI
3,
DNA需要设定的变性温度较
高
当温度超过90℃时，双链
DNA 解旋为单链。
利用PCR 获取和扩增目的基因
5
5
当温度下降到50C°左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单
链DNA结合。
利用PCR 获取和扩增目的基因
TIIITIIIIIIIIIIIIIIl
第2步：复性
5' IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIT
3'"
3′
5′
IIL
5'
3'
5’
3’ IIIIIIIIIII
皿 —3’
第3步：延伸
3’
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的
DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链
利用PCR 获取和扩增目的基因
5’mmm
3,m
3’—
LLL III 5’
3’
5’
5,
I
第一轮循环的产物作为第二轮反应模
板，经过变性、复性和延伸三步产生 第二轮循环产物。
m
利用PCR 获取和扩增目的基因
5
3’
5’
3’ 5'
3
5’π
3
3
5 ,
3’
5’
m
3’
5’ 第二轮循环的产物作为第三轮反应模 板，经过变性、复性和延伸三步产生
利用PCR 获取和扩增目的基因
第三轮循环产物。
5
3’
5’
3’
每次循环后目的基因的量可以增加一倍，即形成指数式扩增(2n)。
3'
5’
3’
5’ 3
5’
3’ 5’ 3
3’
5’
3’
5’
5’ 3’ 5’
3’ 5’
5,
3’
5 5’
3’
5’
TI
uu
I
项目 PCR技术
体内DNA复制
不 同 点 场所 细胞外(主要在PCR仪内)
细胞内(主要在细胞核内)
解旋方式 DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
酶 耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
引物 小段RNA或单链DNA分子
一小段RNA
特点 体外迅速扩增
生物体内边解旋边复制
ATP 不需要
需要
温度条件 在较高温度下进行
细胞内温和的条件
结果 短时间形成大量DNA片段
形成完整的DNA分子
利用PCR 获取和扩增目的基因
Part 02
第二步：基因表达 载体的构建
02)第二步：基因表达载体的构建
1.基因表达载体的目的
( 1 ) 使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
(2)使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点
(1)启动子： ①本质： 一段有特殊序列结构的DNA 片段；
②位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点；
③功能：RNA 聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
(2)终止子： ①本质：一 段有特殊序列结构的DNA 片段；
②位置：位于基因的下游；
③功能：使转录在所需要的地方停下来
(3)标记基因： 作用：便于重组DNA 分子的筛选
(4)复制原点： DNA 复制开始的地方，使能完成自主复制
② 用同种限制酶或能产生
相同末端的限制酶切割含 有目的基因的DNA片段。
③ 将切下的Bt基因片段拼
接到载体的切口处，再加 入适量DNA 连接酶，形成 了一个重组DNA分子。
第二步：基因表达载体的构建
限制酶
限制酶
获取目的基因
标记基因
①用一定的限制酶切割
载体，使其出现一个切口。
目的基因
限制酶切割位点
终止子
载体
复制原点
重组DNA分子 基因表达载体
限制酶切割位点
启动子
连接酶
质粒
Part 03
第三步：将目的基 因导入受体细胞
03) 第三步：将目的基因导入受体细胞
1.转化的概念：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 维持稳租_ 表幽过程。
2.将目的基因导入受体细胞的方法
农杆菌转化法( 双子叶植物和裸子植物常用)
花粉管通道法(我国科学家独创)
基因枪法(单子叶植物常用)
(受精卵)
导入动物细胞——显微注射法
(原核生物)
导入微生物细胞—— Ca2+转化法
导入植物细胞
(2) 农杆菌转化法
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受
体细胞内维持稳定和表达的过程。
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。 ②特点：
a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶
植物没有侵染能力。
b. 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上
的T-DNA (可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到 该细胞的染色体DNA上。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1 .将目的基因导入植物细胞
a.两次拼接：
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒 的 T-DNA 上；
第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基 因的TDNA拼接到受体细胞_染色体DNA。
b.两次导入：
第一次导入是将含目的基因的重组Ti质 粒 导入 农杆菌；
第二次导入(非人工操作)是指含目的基
因的T-DNA 导入受体细胞。
1.将目的基因导入植 物细 胞
(2) 农杆菌转化法
③过程 ：两次拼接和两次导入
Ti质粒 目的基因
构建基因表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
导入
农杆菌
导入
植物细胞
目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
植物组织培养
表现出新性状的植株
第三步：将目的基因导入受体细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.将目的基因导入动物细胞
(1)导入方法：显微注射法
(2)受体细胞： 受精卵 原因：①体积大，易操作； ②易表现出全能性。
(3)过程： 构建基因表达载体并提纯
业
利用显微注射将基因表达
载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
士士么曰口 t 六r, 上 A 一
(1)常用方法： Ca +处理 (目的 )
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
(2)受体细胞： 原核细胞(常选择大肠杆菌)
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
增加细胞壁 一般利用温
的通透性 度变化导入
Ca +处理 感受态 表达载体与感 感受态细胞吸
细胞 细胞 受态细胞混合 收重组DNA
第三步：将目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入微生物细胞
(3)过程：
Part 04
第四步：目的基因 的检测与鉴定
目 的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过 检 测与鉴定才能知道。
1.检测与鉴定的方法
分子水平的检测
目的基因 转录 翻译
是否插入
PCR等技术
个体水平的鉴定
个体
鉴定
抗虫、抗病 接种实验
第四步：目的基因的检测与鉴定
蛋白质
检测
抗原—抗 体杂交
mRNA
第四步：目的基因的检测与鉴定
(1)分子水平的检测
①电泳检测法
方法1: 体细胞中的质粒直接进行电泳检测或者选择合适的限制酶对质粒进行酶
切后再进行电泳检测，同时可借助指示分子大小的标准参照物来进一步确认目 的基因。
方法2:可以以质粒为模板进行PCR 扩增，之后再进行电泳检测。
设计PCR 的一对引物时，最好一个引物与质粒DNA 互补结合， 物
的基因DNA互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物(也可以 都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物), 之 后 再进行电泳检测；
方法3:提取受体细胞的mRNA , 逆转录，获得cDNA, 用上述方法2进行 PCR 扩增，之后再进行电泳检测；
第四步：目的基因的检测与鉴定
(1)分子水平的检测
②核酸杂交检测法(原理)
在含有目的基因的DNA 片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与
基因组DNA或mRNA杂交(遵循碱基互补配对原则), 若出现杂交带，则目的基因 插入成功或转录出mRNA。
15N 用作探针的DNA 5N 15N
六 八
探针
-15N
检测
W
待测标本
标本(DNA单链)
第四步：目的基因的检测与鉴定
(1)分子水平的检测
③抗原-抗体杂交技术
从转基因棉花中提取
蛋白质，用相应的抗 体进行抗原-抗体杂交， 若出现杂交带，则目 的基因成功翻译出蛋 白质。
标记抗体
抗体
牙 杂交
提取蛋白
电泳分离
在抗原-抗体杂交中，目的蛋白是作为抗原还是指体 抗 原
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
插入目的基因
的染色体DNA
脱分化
苏云金芽孢 杆菌
植物细胞
转基因生物 检测方法
观察目标
抗虫植物 害虫吞食
害虫是否死亡
抗病植物 病毒(菌)感染
是否出现病斑
抗盐植物 盐水浇灌
是否正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂
是否正常生长
获取目的基因产物的转 基因生物 提取细胞产物，与天然 产品进行功能活性比较
细胞产物的功能活性是
否正常
第四步：目的基因的检测与鉴定
(2)个体水平的检测
Part 05
片段的扩增与
电泳鉴定
DNA
◆DNA 分子具有可解离的基团，在一定的pH 下，这些基团可以带上正电荷或负电 荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷反_的电极移动，这个 过程就是电泳。
◆在凝胶中DNA 分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA 等有联太小和构像
◆凝胶中的DNA 分子通过染色，可以在波长为300nm 能外灯下被检测出来。
05)DNA 片段的扩增与电泳鉴定
1.DNA 体外扩增(PCR) 的原理
◆PCR 利用了DNA 热变性原理，通过调节温度来控制DNA 双链解 聚与结 合
◆PCR 仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器， 一次PCR 一般要经历30次循
主不
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝束基定。
2.DNA 片段电泳鉴定的原理
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微 量离心管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心
机里，离心约10s, 使 反应液集中在离心管的底部
使DNA 充分变性，以利于
引物更好地与模板结合 仪的循环程序。将装有反应液的微量
移液
离心
扩增
离心 PCR仪中进行反应。
循环 程 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min
3 0 次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
DNA片段的扩增与电泳鉴定
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微 量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示 分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压， 一般为1~ 5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
的核酸染料混匀。
②倒模 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加 样孔。
③凝 固待凝胶溶液完全凝 固 ，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
DNA 片段的扩增与电泳鉴定
用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂 ①融化
糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量
制备
凝胶
个
进行
电泳
个
观察
鉴定
①加液
②加样
③电泳
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
05
05)DNA 片段的扩增与电泳鉴定
注意：
1.为避免外源DNA 等因素的污染，PCR 实验中使用的微量离心管、枪 头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并 在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的 枪头都必须更换。
4.在进行操作时， 一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
答案： C
解析： DNA 连接酶的作用是在相邻两个核苷酸的磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，A 、D 错误；DNA
连接酶在基因工程中作用于两个黏性末端或两个平末端， B 错误；DNA 连接酶与DNA聚合酶作用的部位相
同，均在磷酸和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，作用对象不同，DNA 连接酶作用于DNA片 段 ，DNA 聚合 酶
作用于单个游离的脱氧核苷酸，C 正确。
1.下列对DNA连接酶的功能描述正确的是()
A.将碱基、脱氧核糖、磷酸连接起来
B.在基因工程中只作用于两个黏性末端
C.与DNA 聚合酶作用的部位相同，作用对象不同
D.用于DNA复制时母链与子链间形成氢键
习 题 练 习
1. 下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达()
A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B.通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C. 提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原一抗体杂交技术进行检测
D.抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
答案： A
解析： 检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。①分子水平上的检测：通过PCR等技术检测转基
因生物的DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA; 检测目的基因是否翻译成蛋白
质用抗原一抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定；检测生物个体是否具有抗性及抗性程度；检测基因
工程产品与天然产品的活性是否相同等。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，故选A。
习 题 练 习
2.下列关于目的基因导入受体细胞的相关叙述错误的是()
A.目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化
B.可以用Ca +处理大肠杆菌细胞，使其能吸收周围环境中的DNA 分子，有利于重 组的基因表达载体导入其中
C. 可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上， 使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
D.将目的基因导入动物细胞常用的方法是农杆菌转化法
答案：D
解析：基因工程中的转化是指目的基因进入受体细胞并在受体细胞中维持稳定和表达的过程 ，A正确；可以 用Ca + 处理大肠杆菌细胞，使它处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组的基因表达 载体导入其中，B 正确；花粉管通道法是用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注射入子房中，也可以 在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入 胚囊，C 正确；将目的基因导入动物细胞常采用显微注射法，将目的基因导入植物细胞常采用的是农杆菌转 化 法 ，D 错误。
习 题 练 习
3.基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，是成功的关键，下列相关说法不 正确的是()
A.构建基因表达载体的目的包括使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下 一代
B.基因工程中使用的标记基因有许多种，有的标记基因是质粒上固有的
C.一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码和终止密码等结构 D.基因表达载体中的复制原点是质粒DNA 的复制的起点
答案：C
解析：基因表达载体的构建的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，
使目的基因能够表达和发挥作用，A 正确；质粒上的标记基因有的是固有的，也可以是人为加上去的，B 正 确； 一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等结构，C 错误；复制原点是DNA复 制的起点，D 正确。
习 题 练 习
4.几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化其水解。将几丁质酶基
因转入菊花体内，可增强其抗真菌病的能力。下列有关叙述错误的是()
A.将几丁质酶基因插入Ti质粒的T-DNA 上构建表达载体
B.可通过显微注射法将农杆菌导入菊花受体细胞
C.可用PCR技术或DNA分子杂交检测目的基因是否成功导入
D. 可用真菌接种实验检测转基因菊花对真菌的抗性程度
答案：B
解 析 ：A 、Ti 质粒的T-DNA可以转移到受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，根据这一特点， 构建表达载体时，应该将几丁质酶基因插入到T质粒的T-DNA上 ，A 正确；B 、将 目的基因导入动物细胞常 用显微注射法，而将目的基因导入到植物细胞常用农杆菌转化法，B 错 误 ；C、可 用PCR 技术或DNA分子杂 交检测目的基因是否成功导入，C 正确；D、 几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，可用真菌接种实验检测 转基因菊花对真菌的抗性程度，D 正确。故选：B。
习 题 练 习
课 堂 总 结
1.目的基因的筛选和获取-前提
◆ 利用PCR 获取和扩增
◆ 化学方法人工合成
2.构建基因表达载体-核心
◆ 目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
有了目的基因，我们才能赋予一种 生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能 实现一种生物的基因在另一种生物
◆ 农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物)、中的转化。 感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定- 保证
◆ 分子检测：是否插入、转录、翻译
才能确定目的基因是香真正在受体 细胞中稳定遗传和正确表达。
◆ 个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。